Гипофункция слюнных желез, основной побочный эффект лучевой терапии головы и шеи снижает качество жизни пациента. Демонстрация эффективности новых методов лечения на животных моделях является предпосылкой перед клиническим переходом. Этот протокол описывает ретродукционное введение и местное облучение подчелюстных желез крыс.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Retroductal Подчелюстные Сальник закапывания и локализованный фракционированного облучения в крысиной модели слюнных гипофункции
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Нормальные ткани, которые находятся внутри порталов радиации, непреднамеренно повреждаются. Слюнные железы часто травмируются во время лучевой терапии головы и шеи. Непоправимое повреждение клеток приводит к хронической потере функции слюны, которая нарушает основную деятельность полости рта и увеличивает риск инфекций полости рта и кариеса. Гипофункция слюны и ее осложнения серьезно влияют на комфорт пациента. Текущее симптоматическое лечение состояния неэффективно, и необходимы новые методы лечения для облегчения состояния.
Слюнные железы - это экзокринные железы, которые выводят свои выделения в рот через выводные протоки. Канюляция этих протоков обеспечивает прямой доступ к железам. Ретродукционная доставка контрастного вещества в основные слюнные железы является рутинной амбулаторной процедурой для диагностической визуализации. С помощью подобной процедуры целесообразно локализованное лечение желез. Тем не менее, применение этого метода в доклинических исследованиях на мелких животных сопряжено с уникальными трудностями. В этом исследовании мы описываем технику ретродукального введения в подчелюстные железы крыс, процедуру, которая была усовершенствована в лаборатории доктора Брюса Баума (NIH)1, и описываем процедуру локального облучения желез.
Введение
Сопутствующий разрушение здоровых тканей составляет ряд вредных побочных эффектов лечения рака. Часть или весь из основных слюнных желез, которые лежат с полями излучения неизбежно разрушены. Таким образом, большинство пациентов , перенесших лучевую терапию для рака головы и шеи, рак шейки лимфомы или облучения всего тела перед трансплантацией костного мозга страдают одним из наиболее распространенных и стойких негативных последствий радиации, гипофункции слюнных желез 2-6.
Жидкостные продуцирующих ацинарных клеток слюнных желез крайне чувствительны к радиации. Повреждение слюнных желез вызывает резкое умалять слюноотделения, состояние называют слюнной гипофункции. Хроническое уменьшение слюноотделения ухудшает ключевые оральные мероприятия, такие как жевания, глотания, речи и вкуса, но болезненного последствиями сильной боли, слезы слизистых оболочек, дисфагия, оппортунистических инфекций, а также кариес ухудшаетпациента благополучия и функции 2,3.
Так как радиотерапия-ассоциированной потери слюнных клеток является необратимым, не существует каких-либо корректирующих лечение ксеростомией. Текущее лечение , которое фокусируется на смягчающий симптомы с искусственными заменителями слюнных и prosecretory препаратов является неэффективным для долгосрочного облегчения 6. Хотя улучшенные методы доставки излучения помогли уменьшить тяжесть состояния, нормальная токсичность ткани и его осложнения остаются ограничивающим фактором при лечении рака 6,7. Превентивные меры по предотвращению радиотерапии-ассоциированных осложнений, таким образом, становится нормой. Радио-защитные агенты , которые роются свободных радикалов кислорода, виды приемных клеток заселение, или улучшают восстановление ДНК в настоящее время изучаются , чтобы предотвратить слюнных гипофункции 8-11.
Выделения экзокринных слюнных желез стекают в рот через главные выводных протоков. Интраоральных катетеризация гое выводные протоки для инъекций контрастных агентов обычно делается в амбулаторных условиях. Используя аналогичный подход, слюнные железы могут быть направлены непосредственно на лечение локализованного 12. Помимо снижения риска развития системных побочных эффектов, retroductal железа инстилляция имеет дополнительные преимущества. Компоновка монослой клеток слюнных вокруг дерева протоковой позволяет нацеливание всех слюнных эпителиальных клеток, и волокнистый инкапсуляция железы действует как барьер для уменьшения нежелательного терапевтического распространения. В сущности, слюнные железы оптимально подходит для целенаправленного лечения железы недугов, таких как радиационно-индуцированной слюнных гипофункции.
Обычное излучение для лечения рака поставляется в малых дозах (1,8 - 2,5 Гр / фракция / день, пять дней в неделю) в течение нескольких недель. Таким образом, радио-защитное терапевтическое, который показывает эффективность против затяжного схемы излучения в экспериментальных моделях имеет большее клиническое влияние. Compromised функция слюнных после фракционированного облучения было зарегистрировано в небольших животных, но источник излучения, дозы фракция, и протоколы , используемые разнообразны 9,10,13.
Этот отчет устанавливает методы retroductal доставкой и локализованным излучением крыс подчелюстных желез с использованием пациентом соответствующего источника излучения и дозы фракции.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все процедуры были одобрены ЛГУ здравоохранения, Шривпорте, уходу и использованию животных комитета и были в соответствии с руководящими принципами NIH по уходу и использованию лабораторных животных.
1. катетеризация Rat подчелюстной слюнных железах
- Подготовка Шприц-НКТ Ассамблеи
- Сокращение длины 10 см PE10 полиэтиленовых труб с помощью скальпеля. Держите оба конца трубки между указательным и большим пальцем. Нагреть средней части трубки над нежным пламенем, и мягко растянуть размягченное трубку, чтобы удвоить свою длину, потянув обе стороны.
- Обрежьте трубку в середине скальпелем под углом 45 O , чтобы получить 2 канюль - каждый с коническим концом. Разверните Неклиновидная конец канюли, установив его в течение 29 G иглой 0,5 см инсулиновый шприц.
- Удалите канюлю, и сделать 220 мкл физиологического раствора в шприц. Нажмите, чтобы вытеснить воздушные пузыри. Установить cannulа над иглой, и толкать поршень шприца, чтобы удалить воздух и обеспечить свободный поток раствора через канюлю. Отрегулируйте громкость до 200 мкл.
- Интраоральных катетеризация подчелюстной железы Канальные
Примечание: Автоклавы инструменты до процедуры, и стерилизовать в промежутках между процедурами в горячей бусинка стерилизатор.- Взвешивание крыс Sprague Dawley, и дозировать расчетный объем кетамина (42 мг / кг) / ксилазина (8 мг / кг) / Ацепромазин (1,4 мг / кг), смесь в шприц для подкожных инъекций.
- Задержите животное, взявшись за основание хвоста между указательным и большим пальцами одной руки и скользя другой рукой по всему телу, чтобы понять это. Подведите указательным и средним пальцами по бокам головы в то время как держать туловище с большим и остальными пальцами.
- Вводят анестетик в задней конечности мускулатуры. Подтвердить глубину анестезии пальца щепоткой и глазной рефлекс. Нанесите смазку для глаз, чтобы предотвратить сухость времяживотное находится под анестезией.
- Поместите животное на специально разработанной платформе (рисунок 1), а также участвовать верхние резцов на поперечной панели. Потяните нижнюю челюсть вниз, обернув резинкой вокруг нижних резцов и закрепления его на платформу.
- Pass стерильный шовный материал через язык и поднимите его вверх, чтобы поднять пол рта. Зажмите швы с кровоостанавливающего, и передать его на поперечной панели.
- Раскройте щеки с заказного щек распределителем (рисунок 1), и под микроскопом рассекает найти сублингвально сосочки на дне полости рта.
- Возьмитесь конический конец предварительно сформированного PE10 трубки с использованием тонких щипцов. Аккуратно манипулировать кончик канюли в протоковой отверстие на подъязычной сосочков. Подтвердите размещение канюли, продев его 3 - 5 мм в канал; убедитесь, что она проходит без каких-либо препятствий.
- Подчелюстные Сальник INSTIllation
- Вводят атропин (0,5 мг / кг) подкожно в загривок, и подождите 10 мин для снижения слюнных выделениях.
- Закрепите канюлю к воздуховоду отверстие с каплей цианакриловым (клей), и дайте высохнуть. Закапывание раствора в железе (200 мкл / железы), медленно нажимая поршень шприца со скоростью ~ 50 мкл / мин.
- Измельчите трубку с кровоостанавливающего и осторожно удалите шприц. Сохранил трубки в канале в течение 30 - 60 мин, пока животное не приходит в сознание. Удалите шовный материал, который держит язык.
- Передача животное в отдельную клетку, а также использовать лампу высокой температуры, чтобы держать его теплым во время восстановления. Не оставляйте животное без присмотра, пока он не пришел в сознание, чтобы поддерживать грудины лежачее положение.
- После того, как животное полностью амбулаторное, он будет размещен в виварии с неограниченным доступом к пище и воде.
2. Локализованные фракционированного облученияподчелюстных железах
- Сдерживание животное, как описано ранее, и анестезию с внутримышечным введением кетамина (33 мг / кг) / ксилазином (6 мг / кг) / ацепромазина (1 мг / кг) смеси в заднюю конечность. Подтвердить глубину анестезии, и нанесите смазку для глаз.
- Поместите животное на лежачем линейного ускорителя столешницу, и продлить его шею, наклоняя голову. Сколлимировать поле излучения (3 см ширина щели), чтобы охватить область от нижней границы нижней челюсти к верхней части грудины.
- Поместите 1 см ткани-эквивалентно болюса по области, и отрегулировать расстояние между источником излучения и верхней части болюса до 100 см.
- Облучают животное (2,5 Гр), используя 6 MV фотонный пучок линейного ускорителя. Мощность дозы, размер поля, и расстояние от источника излучения до поверхности болюс будет диктовать время экспозиции. В текущем наборе вверх, животных облучали при мощности дозы ~ 1 Гр / мин.
- Повторите воздействия; 2,5 Гр / сут в течение в общей сложности 8дней; 4 дней / неделю с интервалом 2 дня между ними. Держите животное в тепле во время восстановления. Передача животных в виварии после того, как она полностью амбулаторное.
- Собирают стимулируется подчелюстной слюной сальника 8 недель после лучевой терапии для измерения функции железы 14. Эвтаназии животных под анестезией путем сердечной перфузии холодным 4% параформальдегид / фосфатным буферным солевого раствора рН 7,2. Вытравить подчелюстные железы для гистологического и иммуногистохимического анализа 14.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Адаптация минимально инвазивной методики сиалография, местное лечение крупных слюнных желез возможно. Retroductal введение в крыс подчелюстной слюнных желез была предпринята попытка с помощью внутриротовой катетеризацией протоков Уортон (рисунок 2). Слюнные протоки Wharton открытых на подъязычное сосочков находится на дне полости рта, но отверстия не легко различимы. Вставка канюли, таким образом, делается путем осторожного зондирования. Чтобы избежать предосудительного ...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Слюнные железы часто получают дозы облучения за порогом восстановления тканей у пациентов, перенесших лучевую терапию по поводу рака головы шеи, выборного абляции шеи узлов или региональных гематологических злокачественных новообразований. Несмотря на то жидкость секретирующих ацинарных клеток железы являются терминально дифференцированных, они парадоксальным образом чувствительны к радиации. Секреторную функцию капель в течение первых недель радиации, а также необратимые повреждения железы приводит к хронической выход ...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Мы благодарим доктора Джона Чанга (Радиационная онкология, Научный центр здоровья LSU) за помощь в измерении дозы облучения. Исследование было поддержано Американским онкологическим обществом (номер гранта: 116945-RSG-09-038-01-CCE), Национальным институтом здравоохранения (номер гранта: R21CA173162) и Онкологическим центром Фейст-Вейлера.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Интрамедик Полиэтиленовая трубка (ПЭ10) | Бектон Диксон | 427401 | |
| 1/2 мл Инсулиновый шприц U-100 | Бектон Диксон | 309306 | |
| искусственными слезами | Miller Vet Supply | 5098-9840-64 | |
| Стерилизатор горячих бусин | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Perma-Hand шелковый шов | Ethicon | K833H | |
| Щипцы Graefe | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Olympus SZX16 Стереомикроскоп | Hunt Optics and Imaging | ||
| 6 MV Линейный ускоритель | Elekta | ||
| Болюс - Skinless | Тепловая лампа Civco | MTCB410 | |
| Braintree Scientific | HL-1 110 В |
Ссылки
- Delporte, C., et al. Increased fluid secretion after adenoviral-mediated transfer of the aquaporin-1 cDNA to irradiated rat salivary glands. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (7), 3268-3273 (1997).
- Chambers, M. S., Rosenthal, D. I., Weber, R. S. Radiation-induced xerostomia. Head Neck. 29 (1), 58-63 (2007).
- Sciubba, J. J., Goldenberg, D. Oral complications of radiotherapy. Lancet Oncol. 7 (2), 175-183 (2006).
- Rodrigues, N. A., et al. A prospective study of salivary gland function in lymphoma patients receiving head and neck irradiation. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 75 (4), 1079-1083 (2009).
- Coracin, F. L., et al. Major salivary gland damage in allogeneic hematopoietic progenitor cell transplantation assessed by scintigraphic methods. Bone Marrow Transplant. 37 (10), 955-959 (2006).
- Jensen, S. B., et al. A systematic review of salivary gland hypofunction and xerostomia induced by cancer therapies: management strategies and economic impact. Support Care Cancer. 18 (8), 1061-1079 (2010).
- de Castro, G. Jr, Federico, M. H. Evaluation, prevention and management of radiotherapy-induced xerostomia in head and neck cancer patients. Curr Opin Oncol. 18 (3), 266-270 (2006).
- Epperly, M. W., Carpenter, M., Agarwal, A., Mitra, P., Nie, S., Greenberger, J. S. Intraoral manganese superoxide dismutase-plasmid/liposome (MnSOD-PL) radioprotective gene therapy decreases ionizing irradiation-induced murine mucosal cell cycling and apoptosis. In Vivo. 18 (4), 401-410 (2004).
- Cotrim, A. P., Sowers, A., Mitchell, J. B., Baum, B. J. Prevention of irradiation-induced salivary hypofunction by microvessel protection in mouse salivary glands. Mol Ther. 15 (12), 2101-2106 (2007).
- Zheng, C., et al. Prevention of radiation-induced salivary hypofunction following hKGF gene delivery to murine submandibular glands. Clin Cancer Res. 17 (9), 2842-2851 (2011).
- Palaniyandi, S., et al. Adenoviral delivery of Tousled kinase for the protection salivary glands against ionizing radiation damage. Gene Ther. 18 (3), 275-282 (2011).
- Baum, B. J., Voutetakis, A., Wang, J. Salivary glands: novel target sites for gene therapeutics. Trends Mol Med. 10 (12), 585-590 (2004).
- Limesand, K. H., et al. Insulin-like growth factor-1 preserves salivary gland function after fractionated radiation. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 78 (2), 579-586 (2010).
- Timiri Shanmugam, P. S., et al. Recombinant AAV9-TLK1B administration ameliorates fractionated radiation-induced xerostomia. Hum Gene Ther. 24 (6), 604-612 (2013).
- Coppes, R. P., Vissink, A., Konings, A. W. T. Comparison of radiosensitivity of rat parotid and submandibular glands after different radiation schedules. Radiother Oncol. 63 (3), 321-328 (2002).
- Sunavala-Dossabhoy, G., Palaniyandi, S., Richardson, C., De Benedetti, A., Schrott, L., Caldito, G. TAT-mediated delivery of Tousled protein to salivary glands protects against radiation-induced hypofunction. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 84 (1), 257-265 (2012).
- Baum, B. J., et al. Transfer of the AQP1 cDNA for the correction of radiation-induced salivary hypofunction. Biochim Biophys Acta. 1758 (8), 1071-1077 (2006).
- Tran, S. D., et al. Paracrine effects of bone marrow soup restore organ function, regeneration, and repair in salivary glands damaged by irradiation. PLoS One. 8 (4), e61632(2013).
- Nanduri, L. S., et al. Salisphere derived c-Kit+ cell transplantation restores tissue homeostasis in irradiated salivary gland. Radiother Oncol. 108 (3), 458-463 (2013).
- Arany, S., Benoit, D. S., Dewhurst, S., Ovitt, C. E. Nanoparticle-mediated gene silencing confers radioprotection to salivary glands in vivo. Mol Ther. 21 (6), 1182-1194 (2013).
- Voutetakis, A., et al. Reengineered salivary glands are stable endogenous bioreactors for systemic gene therapeutics. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (9), 3053-3058 (2004).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
