Retroductal Подчелюстные Сальник закапывания и локализованный фракционированного облучения в крысиной модели слюнных гипофункции

Сопутствующий разрушение здоровых тканей составляет ряд вредных побочных эффектов лечения рака. Часть или весь из основных слюнных желез, которые лежат с полями излучения неизбежно разрушены. Таким образом, большинство пациентов , перенесших лучевую терапию для рака головы и шеи, рак шейки лимфомы или облучения всего тела перед трансплантацией костного мозга страдают одним из наиболее распространенных и стойких негативных последствий радиации, гипофункции слюнных желез ^2-6.

Жидкостные продуцирующих ацинарных клеток слюнных желез крайне чувствительны к радиации. Повреждение слюнных желез вызывает резкое умалять слюноотделения, состояние называют слюнной гипофункции. Хроническое уменьшение слюноотделения ухудшает ключевые оральные мероприятия, такие как жевания, глотания, речи и вкуса, но болезненного последствиями сильной боли, слезы слизистых оболочек, дисфагия, оппортунистических инфекций, а также кариес ухудшаетпациента благополучия и функции ^2,3.

Так как радиотерапия-ассоциированной потери слюнных клеток является необратимым, не существует каких-либо корректирующих лечение ксеростомией. Текущее лечение , которое фокусируется на смягчающий симптомы с искусственными заменителями слюнных и prosecretory препаратов является неэффективным для долгосрочного облегчения ^6. Хотя улучшенные методы доставки излучения помогли уменьшить тяжесть состояния, нормальная токсичность ткани и его осложнения остаются ограничивающим фактором при лечении рака ^6,7. Превентивные меры по предотвращению радиотерапии-ассоциированных осложнений, таким образом, становится нормой. Радио-защитные агенты , которые роются свободных радикалов кислорода, виды приемных клеток заселение, или улучшают восстановление ДНК в настоящее время изучаются , чтобы предотвратить слюнных гипофункции ^8-11.

Выделения экзокринных слюнных желез стекают в рот через главные выводных протоков. Интраоральных катетеризация гое выводные протоки для инъекций контрастных агентов обычно делается в амбулаторных условиях. Используя аналогичный подход, слюнные железы могут быть направлены непосредственно на лечение локализованного ^12. Помимо снижения риска развития системных побочных эффектов, retroductal железа инстилляция имеет дополнительные преимущества. Компоновка монослой клеток слюнных вокруг дерева протоковой позволяет нацеливание всех слюнных эпителиальных клеток, и волокнистый инкапсуляция железы действует как барьер для уменьшения нежелательного терапевтического распространения. В сущности, слюнные железы оптимально подходит для целенаправленного лечения железы недугов, таких как радиационно-индуцированной слюнных гипофункции.

Обычное излучение для лечения рака поставляется в малых дозах (1,8 - 2,5 Гр / фракция / день, пять дней в неделю) в течение нескольких недель. Таким образом, радио-защитное терапевтическое, который показывает эффективность против затяжного схемы излучения в экспериментальных моделях имеет большее клиническое влияние. Compromised функция слюнных после фракционированного облучения было зарегистрировано в небольших животных, но источник излучения, дозы фракция, и протоколы , используемые разнообразны ^9,10,13.

Этот отчет устанавливает методы retroductal доставкой и локализованным излучением крыс подчелюстных желез с использованием пациентом соответствующего источника излучения и дозы фракции.

Все процедуры были одобрены ЛГУ здравоохранения, Шривпорте, уходу и использованию животных комитета и были в соответствии с руководящими принципами NIH по уходу и использованию лабораторных животных.

1. катетеризация Rat подчелюстной слюнных железах

1. Подготовка Шприц-НКТ Ассамблеи
   1. Сокращение длины 10 см PE10 полиэтиленовых труб с помощью скальпеля. Держите оба конца трубки между указательным и большим пальцем. Нагреть средней части трубки над нежным пламенем, и мягко растянуть размягченное трубку, чтобы удвоить свою длину, потянув обе стороны.
   2. Обрежьте трубку в середине скальпелем под углом 45 ^O , чтобы получить 2 канюль - каждый с коническим концом. Разверните Неклиновидная конец канюли, установив его в течение 29 G иглой 0,5 см инсулиновый шприц.
   3. Удалите канюлю, и сделать 220 мкл физиологического раствора в шприц. Нажмите, чтобы вытеснить воздушные пузыри. Установить cannulа над иглой, и толкать поршень шприца, чтобы удалить воздух и обеспечить свободный поток раствора через канюлю. Отрегулируйте громкость до 200 мкл.
2. Интраоральных катетеризация подчелюстной железы Канальные
   Примечание: Автоклавы инструменты до процедуры, и стерилизовать в промежутках между процедурами в горячей бусинка стерилизатор.
   1. Взвешивание крыс Sprague Dawley, и дозировать расчетный объем кетамина (42 мг / кг) / ксилазина (8 мг / кг) / Ацепромазин (1,4 мг / кг), смесь в шприц для подкожных инъекций.
   2. Задержите животное, взявшись за основание хвоста между указательным и большим пальцами одной руки и скользя другой рукой по всему телу, чтобы понять это. Подведите указательным и средним пальцами по бокам головы в то время как держать туловище с большим и остальными пальцами.
   3. Вводят анестетик в задней конечности мускулатуры. Подтвердить глубину анестезии пальца щепоткой и глазной рефлекс. Нанесите смазку для глаз, чтобы предотвратить сухость времяживотное находится под анестезией.
   4. Поместите животное на специально разработанной платформе (рисунок 1), а также участвовать верхние резцов на поперечной панели. Потяните нижнюю челюсть вниз, обернув резинкой вокруг нижних резцов и закрепления его на платформу.
   5. Pass стерильный шовный материал через язык и поднимите его вверх, чтобы поднять пол рта. Зажмите швы с кровоостанавливающего, и передать его на поперечной панели.
   6. Раскройте щеки с заказного щек распределителем (рисунок 1), и под микроскопом рассекает найти сублингвально сосочки на дне полости рта.
   7. Возьмитесь конический конец предварительно сформированного PE10 трубки с использованием тонких щипцов. Аккуратно манипулировать кончик канюли в протоковой отверстие на подъязычной сосочков. Подтвердите размещение канюли, продев его 3 - 5 мм в канал; убедитесь, что она проходит без каких-либо препятствий.
3. Подчелюстные Сальник INSTIllation
   1. Вводят атропин (0,5 мг / кг) подкожно в загривок, и подождите 10 мин для снижения слюнных выделениях.
   2. Закрепите канюлю к воздуховоду отверстие с каплей цианакриловым (клей), и дайте высохнуть. Закапывание раствора в железе (200 мкл / железы), медленно нажимая поршень шприца со скоростью ~ 50 мкл / мин.
   3. Измельчите трубку с кровоостанавливающего и осторожно удалите шприц. Сохранил трубки в канале в течение 30 - 60 мин, пока животное не приходит в сознание. Удалите шовный материал, который держит язык.
   4. Передача животное в отдельную клетку, а также использовать лампу высокой температуры, чтобы держать его теплым во время восстановления. Не оставляйте животное без присмотра, пока он не пришел в сознание, чтобы поддерживать грудины лежачее положение.
   5. После того, как животное полностью амбулаторное, он будет размещен в виварии с неограниченным доступом к пище и воде.

2. Локализованные фракционированного облученияподчелюстных железах

1. Сдерживание животное, как описано ранее, и анестезию с внутримышечным введением кетамина (33 мг / кг) / ксилазином (6 мг / кг) / ацепромазина (1 мг / кг) смеси в заднюю конечность. Подтвердить глубину анестезии, и нанесите смазку для глаз.
2. Поместите животное на лежачем линейного ускорителя столешницу, и продлить его шею, наклоняя голову. Сколлимировать поле излучения (3 см ширина щели), чтобы охватить область от нижней границы нижней челюсти к верхней части грудины.
3. Поместите 1 см ткани-эквивалентно болюса по области, и отрегулировать расстояние между источником излучения и верхней части болюса до 100 см.
4. Облучают животное (2,5 Гр), используя 6 MV фотонный пучок линейного ускорителя. Мощность дозы, размер поля, и расстояние от источника излучения до поверхности болюс будет диктовать время экспозиции. В текущем наборе вверх, животных облучали при мощности дозы ~ 1 Гр / мин.
5. Повторите воздействия; 2,5 Гр / сут в течение в общей сложности 8дней; 4 дней / неделю с интервалом 2 дня между ними. Держите животное в тепле во время восстановления. Передача животных в виварии после того, как она полностью амбулаторное.
6. Собирают стимулируется подчелюстной слюной сальника 8 недель после лучевой терапии для измерения функции железы ^14. Эвтаназии животных под анестезией путем сердечной перфузии холодным 4% параформальдегид / фосфатным буферным солевого раствора рН 7,2. Вытравить подчелюстные железы для гистологического и иммуногистохимического анализа ^14.

Адаптация минимально инвазивной методики сиалография, местное лечение крупных слюнных желез возможно. Retroductal введение в крыс подчелюстной слюнных желез была предпринята попытка с помощью внутриротовой катетеризацией протоков Уортон (рисунок 2). Слюнные протоки Wharton открытых на подъязычное сосочков находится на дне полости рта, но отверстия не легко различимы. Вставка канюли, таким образом, делается путем осторожного зондирования. Чтобы избежать предосудительного кровотечение или перфорация протока, никакая сила не была использована при размещении канюлю. Гладкая резистивные свободный проход канюли в канале была подтверждена путем осторожного вперед и назад движение трубки.

Канюляция во время первых экспериментов было подтверждено вливая железы с гематоксилином или трипанового синего раствора, а также оценку окрашивания железы у умерщвленных животных (рисунок 3). Glи заполнить объем был установлено путем визуализации окрашивания дерева протоковой в искоренены желез. Для животных с массой тела 150 - 250 г, полное заполнение железы была достигнута при 200 - 250 мкл раствора. Быстрое вливание может увеличить давление железы и повышают риск получения травм и biospread. Для того, чтобы избежать разрушения тканей, раствор вводят постепенно со скоростью ~ 50 мкл / мин

Крысиный подчелюстной железы сопоставимы с околоушных желез в их чувствительности к радиации 15. Были изучены подчелюстные железы , потому что они могут быть избирательно облучают , не подвергаясь тяжелой Офф-мишени эффектов (рисунок 4). Щадящая полости рта и большого объема околоушных желез сведено к минимуму влияние мукозита полости рта и острого ксеростомией на здоровье животных и экспериментальных результатах. Наши более ранние исследования на крысах проводились с одиночными, большими дозами радиации 11,16, но гидроразрываtionated дозирования более уместен к клинической практике. Область шеи животного был, поэтому, ежедневно подвергаются малых доз радиации. Для достижения равномерного накопления дозы облучения в пределах подчелюстных желез, расположенных близко к поверхности кожи, мягких тканей-эквивалент болюс изготовлен из однородного геля с плотностью 1,03 г / см помещали над шеей во время излучения.

Влияние фракционного схемы излучения на слюноотделения, как определено через 8 недель после излучения показывают, что ежедневное воздействие с шагом 2,5 Гр уменьшенную слюнной поток стремительнее. Близкий 10-кратное снижение объемов производства слюны был зафиксирован у облученных животных в отличие от необлученных животных (t- тест 2-сторонний Стьюдента, р <0,01; рис 5) 14. Результаты подтвердили создание радиационно-индуцированной слюнных гипофункции у животных.

: Keep-together.within-страницу = "1">
Рисунок 2. катетеризация крыс подчелюстной сальником выводные протоки. Язык поднимается , чтобы поднять пол рта, и полиэтилен канюль были вставлены в подчелюстной протоков отверстия , расположенные на дне полости рта. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы увидеть увеличенную версию эта фигура.

Рисунок 3. Настой гематоксилин раствора в подчелюстной слюнной железы , чтобы подтвердить технику. Сальник окрашивание свидетельствует об успешном введении раствора в подчелюстной железе. Обратите внимание, что сублингвального железа в верхнем левом углу не окрашивается. Не-вселяли управления железа показано на рисунке слева.e.com/files/ftp_upload/53785/53785fig3large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4. Размещение животных для облучения. Животное укладывают навзничь на линейном ускорителе столе, а голова под названием назад , чтобы расширить шею. Коллимированы ширина щели составляла 3 см. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5. Влияние излучения на фракционированного Подчелюстные железы функции. Физиологический раствор закапывают в подчелюстных железах перед радиацией. Шейка животного облучали в долях 2,5 Гр / день в течение 8 дней. ДАТа, показанный представляют собой среднее ± SEM стимулированного подчелюстной слюнной скорости потока через 8 недель после завершения схемы излучения. На рисунке воспроизводится с разрешения авторского права от Human Gene Therapy, Мэри Энн Liebert, Inc. издателя 15. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Авторам нечего раскрывать.