Методическая статья

Визуализация пространственной реорганизацией МАРК сигнального пути с помощью переходного процесса система экспрессии Tobacco

DOI:

10.3791/53790

⸱

20 марта 2016 г.

 , 
1The Waksman Institute of Microbiology, Rutgers, The State University of New Jersey, 2The Department of Plant Biology and Pathology, Rutgers, The State University of New Jersey

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

На субклеточном уровне сигнальные события динамически модулируются сигналами развития и окружающей среды. В данной статье мы описываем протокол, в котором используется система экспрессии переходных процессов табака для мониторинга динамического белок-белкового взаимодействия и выявления пространственной организации передачи сигнала в клетках растений.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Визуализация динамических сигнальных событий в живых клетках было проблемой. Мы расширили установленную систему транзиторной экспрессии, биомолекулярной флуоресцентный комплементационная (BiFC) анализа в эпидермальных клеток табака, от взаимодействия тестирования белок-белок для контроля пространственного распределения сигналов в клетках растений. В этом протоколе, мы использовали пробу BiFC , чтобы показать , что взаимодействие и передача сигналов между Arabidopsis MAPKKK Йоду и MAPK6 происходит на плазматической мембране. Когда совместно высказывалось каркасный белок BASL, взаимодействие YODA-МАРК перераспределены и пространственно совместно с поляризованным CFP-BASL. Эта модифицированная система экспрессии табака позволяет быстро обследования сигнализации локализации и динамических изменений (менее 4-х дней) и может работать с несколькими флуоресцентных цветов белка (не менее трех). Мы также представили подробные методы для количественного определения распределения белка (асимметричную пространственную локализацию, или "поляризации";) В клетках табака. Эта усовершенствованная система экспрессии табака имеет потенциал, чтобы быть широко используется для быстрого тестирования динамических сигнальных событий в клетках живых растений.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Белки взаимодействуют в запутанную иерархической сети и образуют комплексы, которые играют ключевую роль практически во всех биологических процессах, происходящих в непредсказуемом клеточной среде. Тем не менее, от развития растений в ответах роста, наблюдается отсутствие удобных инструментов, которые могут не только быстро, но и эффективно идентифицировать и контролировать эти динамические сигнализации событий на субклеточном уровне.

Переходная система экспрессии белка в табачных листьев эпидермис имеет привлекательный преимущества для визуализации флуоресцентных белков в живых клетках. Эта система обеспечивает условия полу- прижизненно, позволяющие посттрансляционной модификации белков и быстрое исследование локализации белка. Рассматривая дополненный сигнал YFP, бимолекулярный флуоресцентный комплементационная (BiFC) анализ информирует возможность взаимодействия белок-белок в клетках растений. По сравнению с другими методами, например, дрожжи-два гибридных (Y2H) и со-immunoprecipitation (Co-IP), BiFC также предоставляет мощные средства визуализации отсеков, где белок-белковые взаимодействия могут происходить на субклеточном уровне.

Поскольку асимметричное деление клеток (ДСА) поддерживает стволовые популяции клеток при создании новых типов клеток для формирования ткани / органа, он является незаменимым механизмом содействия эукариотической многоклеточность. Развитие Arabidopsis устичный была использована в качестве модельной системы для изучения ДСА в растениях. Клетка-предшественник, meristemoid материнские клетки, разрывами асимметрично, чтобы производить два разных дочерних клеток, а meristemoid (претерпевает стволовые клетки, как разделение, перед завершением на пару замыкающих клеток) и устичный родословная наземной клетки (SLGC) (может делиться и дифференцироваться в мостовая клетки), соответственно (рис 1). В устьичной ДСА, новый белок Преломление Асимметрия в Lineage УСТЬИЧНОГО (BASL) поляризован premitotically водить деление асимметрию, которая вклЛюд физическая асимметрия и клеточная судьба асимметрия 1. МАРК каскад , состоящий из MAPKKK Йоду и МАРК, MPK3 и 6 является центральным для формирования паттерна устичный деления и судьбы принятия 2,3, 4,5.

В последнее время , Zhang и др. связала полярности белка BASL к сигнального пути YDA-МАРК в Arabidopsis устьичной ДСА 6. Канонический YODA-МАРК путь, через MPK3 / 6, фосфорилирует BASL и активизирует свою поляризацию. Фосфорилированные BASL функционирует как помост и вербует Йоду (Yda) и MPK3 / 6 с образованием белкового комплекса и концентрировать сигнализацию на клетки коры головного мозга 6. Поляризационная компонентов МАРК и положительной обратной связи между BASL и пути YDA-МАРК представляет собой новый механизм поляризации белка в клетках растений. Локально обогащается сигнализации МАРК гипотетически быть тесно связана с судьбой клеток дифференциации в устьичной ДСА 6 (рисунок 1). Один из КEY экспериментальные данные , которые поддержали эту модель пришла от табака анализов , которые продемонстрировали пространственное перераспределение МАРК индуцированных выражением BASL 6.

В общем, это не так легко контролировать, где передача сигналов МАРК происходит потому, что молекулы МАРК часто встречаются повсеместно внутрь клетки. В данном исследовании мы использовали систему сплит-YFP визуализировать взаимодействие между вверх по течению и вниз по течению киназ те предположить, где происходит реле сигнализации. Кроме того, мы расширили использование системы BiFC путем коэкспрессирующей третий белок (CFP-меченый) с раздельным YFP пары (предполагающим белок-белкового взаимодействия), чтобы визуализировать ли и каким образом дополнены YFP может быть пространственно модулируют СО- выразил CFP белок. Поступая таким образом, мы показали, что совместное выражение CFP-BASL индуцированной пространственной реорганизации взаимодействий между Yda и MPK6, от равномерного распределения к поляризованной кучность в клеточной коре табака эпидермисаAl клетки. Таким образом , эта система имеет потенциал , чтобы быть разработаны для мониторинга динамических сигнальных событий в клетках растений в условиях , когда клетки сталкиваются с проблемой внутренних или внешних раздражителей (например, совместная экспрессия других белков, химического применения, атаки патогена или изменений в окружающей среде, и т.д.. ).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Плазмиду Строительство

  1. Генерирование конструкции по технологии клонирования , как описано выше 1,6.
    1. Сначала с помощью ДНК-полимеразы с высокой точностью соответствующих праймеров для амплификации кодирующих последовательностей BASL, YDA и MPK6 и суб-клонировать их в векторы входа. Найти подробный протокол в 7.
    2. Для создания доминирующие негативные версии MPK6 и Yda (DNmpk6 8 и DNyda 4 соответственно), использовать запись плазмид MPK6 и Yda в качестве матрицы и ввести точечные мутации с помощью сайт-направленного мутагенеза 9.
  2. Для построения конструкции для временных тестах табака, проводят стандартную LR (ATTL х атр рекомбинация) реакции (подробная процедура в 7) включить BASL в pH35CG 10, DNyda и DNmpk6 в pXNGW и pXCGW векторы 11, соответственно.
    1. Подтвердите результирующих плазмид путем ферментативного расщепления и последовательности. После того, как Successful, преобразование бинарных конструкций в Agrobacterium tumefaciens штамма GV3101 12 и выращивают их на селекции пластин при 28 ° С в течение 2 - 3 дней.

2. Приготовление раствора Agrobacterium Infiltration

  1. Инокулируйте несколько свеже трансформированных Agrobacterium колонии в 10 мл Лурии-Бертани (LB) среде с соответствующими антибиотиками (Гентамицин 25 мкг / мл, Рифамицин 25 мкг / мл, Спектиномицина 100 мкг / мл для pH35CG, pXNGW и pXCGW конструирует, одни и те же концентрации гентамицина и рифамицин с использованием канамицина 50 мкг / мл для P19 (экспрессии белков против трансгенной глушителей) 13.
  2. Grow Agrobacterium культур в C шейкере 28 ° со скоростью 200 оборотов в минуту в течение приблизительно 16 часов , а затем измерить OD 600 ( по оценкам, достигает 1,5 - 1,8) (рис 2A-B). Спин вниз культур при 2500 мкг в течение 10 мин. Повторное приостановить и ваSh гранул клеток с 10 мМ MgCl 2 (инфильтрация раствора).
  3. Спином вниз культуры вновь и вновь приостановить гранул с соответствующим количеством раствора инфильтрации для достижения конечной OD 600 = 0,5 (рис 2C-D). Перед инфильтрации растения, оставляют клеточные смеси при комнатной температуре в течение 1 - 3 ч. Этот шаг помогает поддерживать гомеостаз клеток.

3. Завод Табак и листьев для инъекций

  1. Использование растений табака (Nicotiana benthamiana), выращиваемых 4 - 5-недельных в стандартной камере роста растений (23 ° C с циклами 16 ч-света / 8 ч-темный) 14 для инъекций листьев.
    Примечание: На данном этапе растения табака, как правило, имеют 6 листьев (2 больших, 2 средних и 2 маленьких). Две средние листья являются наиболее оптимальными для инъекций листа (две большие из них слишком стары, в то время как два маленьких часто слишком молоды).
  2. Перед инфильтрации день, поливать tobacсовместные предприятия, чтобы насытить почву.
  3. На инфильтрационной день, предварительно инкубировать растения в темноте в течение 1 - 3 ч. Этот шаг позволяет устьица в эпидермисе широко открыть, что значительно облегчает Agrobacterium при проникновении в лист клеток эпидермиса.
  4. Используя цветные ленты меченых с датами, флаг листья, чтобы быть инфильтрации. Отметьте области, которые будут пропитаны черным толстым шулер (опционально, инфильтрации зоны видны после заражения.).
  5. Возьмем равные объемы Agrobacterium ресуспендирования и смешать их в 100 х 15 мм чашки Петри Осторожным закрученной (рис 2E). Примечание: В нашем случае, мы смешали 1 мл p19 1 мл CFP-BASL, 1 мл DNyda-NYFP и 1 мл DNmpk-cYFP.
  6. В процессе инфильтрации, заполнить 3 мл безыгольного шприца с инфильтрацией смеси (1 - 2 мл) и нажать на нижнюю сторону (абаксиальной) табачного листа (рис 2F). В то время как инфильтрации, полезноиспользовать одну руку, чтобы нажать и, с другой стороны, чтобы мягко поддерживать верхнюю сторону (адаксиальная, против толкающей силы).
    Примечание: После того, как инфильтрация смесь успешно впрыскивается, зараженные районы станут легко узнаваемы в эпидермисе. Тем не менее, инфильтрация может потерпеть неудачу из-за резкой инъекции (повреждение ткани) или недостаточной толчке (без проникновения жидкости). Для каждого теста, мы предлагаем, по крайней мере две инъекции в двух независимых листьев (из разных растений).
  7. Поместите Зараженные растения обратно в камеру роста. Как правило, белковые выражения могут быть обнаружены через 48 ч следующего инфильтрации.

4. конфокальной микроскопии

  1. В 48 ч после инфильтрации, используйте перфоратора акцизным листовую диск из области инъекции (обычно 3 - 4 дисков / область может быть получена) (рис 2G). Используйте пинцет, чтобы аккуратно перенести диски листа к слайду (абаксиальной боковой вверх) и смонтировать их с каплями воды. Не нажимайте слишком харd на покровного стекла , потому что выжимали / поврежденные клетки не будут отображаться хорошо под конфокальной микроскопии (рис 2H).
  2. Перед конфокальной микроскопии, сканировать смонтированные образцы на эпи-флуоресцентный сложного микроскопа, чтобы проверить уровни экспрессии. Примечание: Основываясь на нашем опыте, клетки, которые показывают промежуточные уровни экспрессии лучше всего представлены под конфокальной микроскопии.
  3. Начните с 40X (NA 1.3) объектив на конфокальной микроскопии. Воспроизведения слайд в желаемое положение таким образом, что клетки, экспрессирующие средние уровни флуоресцентных белка остаются в центре. Спектры возбуждения / эмиссии для CFP и YFP 458 нм / 480 - 500 нм и 514 нм / 520 - 540 нм, соответственно.
  4. Активировать кнопку "Live" для предварительного просмотра изображения затем отрегулировать интенсивность лазерного излучения и смарт усиления для наиболее сбалансированного соотношения интенсивности флуоресценции / шум. Для улучшения качества изображения, увеличение сканирования пикселей и / или средний кадр / линии. И, наконец, отрегулируйте ручки фокусировки на REAч средний фокальной плоскости и нажмите кнопку "Capture", чтобы принять изображение.
    Примечание: CFP и YFP изображения могут быть захвачены последовательно или одновременно путем проверки или выключения опции "последовательного" режима сканирования, соответственно.
  5. Когда Z-проекция желателен для вида углубленном ячеек, выберите режим формирования изображения "XYZ", определить глубину диапазона сканирования (10 - 15 мкм) и собирать изображения с верхней к нижней части клетки-мишени , Обобщение полученных изображений с помощью программного обеспечения Leica, щелкнув правой кнопкой мыши на файл изображения, чтобы выбрать "переименовать" и экспортировать изображения в качестве .tiff файлов.
  6. Image 30 - 40 клеток для анализа количественной оценки.

Обработка изображений и 5. Количественный анализ

  1. для обработки изображений и проведения количественной оценки Использование программного обеспечения Фиджи (http://fiji.sc/Fiji~~HEAD=dobj).
    1. Изобразите графики интенсивности флуоресценции.
      1. Чтобы лучше визуализировать ли выражение CFP / YFP являетсяравномерно распределены, используют Фиджи, чтобы продемонстрировать силу сигнала CFP и YFP вдоль периферии клетки. Для достижения этой цели, сначала запустить Фиджи затем выберите "Файл" и "Открыть", чтобы начать изображение. Нажмите кнопку "линии" в меню инструментов и выберите "Сегментированный линию", щелкнув правой кнопкой мыши. Определите область интереса и провести линию вдоль периферии клетки проследить CFP или YFP сигнал (рис 3A-C).
        Примечание: Фиджи измеряет абсолютное значение интенсивности флуоресценции вдоль сегментированных линий.
      2. Выберите в раскрывающемся меню "Анализ" и "Plot Profile", чтобы создать граф с положения и интенсивности значений, которые представляют уровни CFP / YFP вдоль сегментированной линии. При желании, дублируют значения интенсивности (выбрав меню "Copy") в EXCEL или другого графического программного обеспечения для создания сопоставимых графиков интенсивности.
    2. Количественно степень полярности.
      1. Соберите приблизительно 20 представивенные клетки из 3-х экспериментов дублирующих оценить степень полярности CFP и YFP в клетках табака. Рассчитывают степень полярности на основе соотношения интенсивности флуоресценции высокого (определяемой как H) над низкой интенсивности флуоресценции (определяется как L). Примечание: Метод Количественное поясняется на рисунке 3.
        1. Для измерения H и L значения, нарисуйте сегментированный линию вдоль заинтересованной области на периферии клетки (описанной выше), нажмите кнопку "Анализ" из выпадающего меню, а затем выберите "Мера". Когда окно "Результаты" всплывает, используйте "Среднее" значения для выполнения количественной оценки.
        2. Из клеток , воспроизводящих относительно однородную экспрессию CFP и YFP, например, КФП-BASL (фиг.3А) или YFP дополнены от совместного выражения DNyda-NYFP и DNmpk6-cYFP (рис 3б), получаем значения H и L путем измерения два случайно выбранных периферийных сегментов с одинаковой длины.
        3. Из клеток , проявляющих явный полярную накопление флуоресцирующих белков, в этом случае совместная экспрессия CFP-BASL, DNyda-NYFP и DNmpk6-cYFP (рис 3C), собрать значения H из периферийных областей с обогащенными флуоресцентных сигналов и Ls из регионов с низким никакого накопления / флуоресценции.
        4. Бассейн результирующие соотношения H / L от 20 клеток вместе и тест для нормального распределения. Вычислить значения р Т критерию Стьюдента (для нормального распределения) или Колмогорова-Смирнова (KS) тест (для не нормального распределения).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Чтобы предотвратить гибель клеток, вызванную гиперактивного сигнализации МАРК, использовались киназ неактивные версии Yda (DNyda) и MPK6 (DNmpk6) в анализе с совместным экспрессии в клетках табака. Ни взаимодействие между DNyda и DNmpk6 выявлены BiFC ни самой генерируется неравномерный характер распределения (рис 3A-B) СФП-BASL. Тем не менее, когда КФП-BASL был введен в пару DNyda-DNmpk6 взаимодействия, как СФП и сигналы YFP были перераспределены крайне поляризованной об...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Общее использование и возможные модификации Преходящего системы Expression табака для передачи сигнала: гиперэкспрессия флуоресцентного белка (FP) -tagged белков в табаке эпидермиса успешно используется для быстрого изучения белка внутриклеточной локализации в клетках растений. Тем не менее, изучение динамического распределения сигнализации белкового комплекса в Planta является сложной проблемой из - за сложных субклеточных контекстов, транзиторной белок-белкового взаимодействия и сигнальной тр...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Yumeng (Helen) Xia (Университет Рутгерса) за редактирование рукописи. Работа по формированию полярности BASL поддерживается грантами Национального института общих медицинских наук США для J.D. (R01GM109080) и Университета Рутгерса.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Фузионная ДНК-полимеразаNew England BiolabsM0530S
pENTR/D/TOPOLife TechnologiesK2400-20
QuickChange II XL Набор для сайт-направленного мутагенезаAgilent Technology200521
LB бульонAMRESCOJ106-2KG
БактоагарAMRESCOJ673-1KG
ГентамицинСигма-ОлдричG3632-1G
РифампицинСигма-ОлдричR3501-1G
КанамицинСигма-ОлдричK4000-25G
СпектиномицинСигма-ОлдричS4014-5G
MgCl2Sigma-AldrichM8266-100G
25 x 75 мм СлайдVWR16004-382
24 x 50 мм Покровное стеклоVWR48393-241
Лазерный сканирующий конфокальный микроскопLeica TCS SP5 IILAS AF Lite программное обеспечение
объектив 40X объективLeicaHCX  План APO HCX  Plan APO, NA 1.30
ЦентрифугаThermo ScientificSORVALL 6+
ДыроколСкобы
50 мл соколиные пробиркиGenesee Scientific21-108
No. 5 ЩипцыCanemco & Marivac205EQA-Spec

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dong, J., MacAlister, C. A., Bergmann, D. C. BASL controls asymmetric cell division in Arabidopsis. Cell. 137, 1320-1330 (2009).
  2. Lukowitz, W., Roeder, A., Parmenter, D., Somerville, C. A MAPKK kinase gene regulates extra-embryonic cell fate in Arabidopsis. Cell. 116, 109-119 (2004).
  3. Bergmann, D. C., Lukowitz, W., Somerville, C. R. Stomatal development and pattern controlled by a MAPKK kinase. Science. 304, 1494-1497 (2004).
  4. Lampard, G. R., Lukowitz, W., Ellis, B. E., Bergmann, D. C. Novel and expanded roles for MAPK signaling in Arabidopsis stomatal cell fate revealed by cell type-specific manipulations. Plant Cell. 21, 3506-3517 (2009).
  5. Wang, H., Ngwenyama, N., Liu, Y., Walker, J. C., Zhang, S. Stomatal development and patterning are regulated by environmentally responsive mitogen-activated protein kinases in Arabidopsis. Plant Cell. 19, 63-73 (2007).
  6. Zhang, Y., Wang, P., Shao, W., Zhu, J. K., Dong, J. The BASL Polarity Protein Controls a MAPK Signaling Feedback Loop in Asymmetric Cell Division. Dev Cell. 33, 136-149 (2015).
  7. Xu, R., Li, Q. Q. Protocol: Streamline cloning of genes into binary vectors in Agrobacterium via the Gateway(R) TOPO vector system. Plant methods. 4, 4(2008).
  8. Bush, S. M., Krysan, P. J. Mutational evidence that the Arabidopsis MAP kinase MPK6 is involved in anther, inflorescence, and embryo development. J Exp Bot. 58, 2181-2191 (2007).
  9. Carey, M. F., Peterson, C. L., Smale, S. T. PCR-mediated site-directed mutagenesis. Cold Spring Harbor protocols. , 738-742 (2013).
  10. Kubo, M., et al. Transcription switches for protoxylem and metaxylem vessel formation. Genes Dev. 19, 1855-1860 (2005).
  11. Yuan, L., et al. Allosteric regulation of transport activity by heterotrimerization of Arabidopsis ammonium transporter complexes in vivo. Plant Cell. 25, 974-984 (2013).
  12. Weigel, D., Glazebrook, J. Transformation of agrobacterium using the freeze-thaw method. CSH protocols. 2006 (7), (2006).
  13. Voinnet, O., Rivas, S., Mestre, P., Baulcombe, D. An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the p19 protein of tomato bushy stunt virus. Plant J. 33, 949-956 (2003).
  14. Rivero, L., et al. Handling Arabidopsis plants: growth, preservation of seeds, transformation, and genetic crosses. Methods in molecular biology. 1062, Clifton, N.J. 3-25 (2014).
  15. Yang, Z. Cell polarity signaling in Arabidopsis. Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 551-575 (2008).
  16. Zhang, J., Nodzynski, T., Pencik, A., Rolcik, J., Friml, J. PIN phosphorylation is sufficient to mediate PIN polarity and direct auxin transport. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 918-922 (2010).
  17. Furutani, M., et al. Polar-localized NPH3-like proteins regulate polarity and endocytosis of PIN-FORMED auxin efflux carriers. Development. 138, 2069-2078 (2011).
  18. Takano, J., et al. Polar localization and degradation of Arabidopsis boron transporters through distinct trafficking pathways. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 5220-5225 (2010).
  19. Truernit, E., Bauby, H., Belcram, K., Barthelemy, J., Palauqui, J. C. OCTOPUS, a polarly localised membrane-associated protein, regulates phloem differentiation entry in Arabidopsis thaliana. Development. 139, 1306-1315 (2012).
  20. Pillitteri, L. J., Peterson, K. M., Horst, R. J., Torii, K. U. Molecular profiling of stomatal meristemoids reveals new component of asymmetric cell division and commonalities among stem cell populations in Arabidopsis. Plant Cell. 23, 3260-3275 (2011).
  21. Mouchel, C. F., Osmont, K. S., Hardtke, C. S. BRX mediates feedback between brassinosteroid levels and auxin signalling in root growth. Nature. 443, 458-461 (2006).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

BiFCBASL

Похожие статьи