Методическая статья

Методика Целевой показатель микроинъекции к проявляющему Xenopus почки

DOI:

10.3791/53799

⸱

3 мая 2016 г.

 ,  , 
1Department of Pediatrics, Pediatric Research Center, University of Texas McGovern Medical School, 2Program in Genes & Development, University of Texas Graduate School of Biomedical Sciences, 3Program in Cell & Regulatory Biology, University of Texas Graduate School of Biomedical Sciences, 4Department of Genetics, University of Texas MD Anderson Cancer Center

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем протокол использования карт судьбы и трассировщиков линий для целевых инъекций в отдельные бластомеры, которые дают начало почке эмбрионов Xenopus laevis.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эмбриональной почки из Xenopus Laevis (лягушки), предпочки, состоит из одного нефрона, и может быть использован в качестве модели для заболевания почек. Xenopus эмбрионы велики, развиваются внешне, и можно легко манипулировать с помощью микроинъекции или хирургическими процедурами. Кроме того, карты судьбы были установлены для ранних эмбрионов Xenopus. Целенаправленное микроинъекции в индивидуальную бластомере, которые в конечном счете приводят к возникновению органа или ткани интерес может быть использован для селективного гиперэкспрессией или сбить экспрессию генов в этой ограниченной области, уменьшение вторичных эффектов в остальной части развивающегося эмбриона. В этом протоколе мы опишем , как использовать установленные карты судьбы Xenopus целевой развивающийся Xenopus почки (Предпочка) через микроинъекции в конкретные бластомере 4- и 8-клеточных эмбрионов. Инъекции линиджа трассеров позволяет проверить конкретного нацеливания инъекции.После того, как зародыши развились до стадии 38 - 40, в целом монтажа иммуноокрашивания используется для визуализации pronephric развития, а также вклад целевых клеток к предпочки могут быть оценены. Тот же метод может быть адаптирован в отношении других типов тканей, в дополнение к предпочки.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Xenopus эмбриональной почки, Предпочка, является хорошей моделью для изучения развития почек и болезней. Эмбрионы развиваются внешне, имеют большие размеры, могут быть получены в больших количествах, и легко манипулировать с помощью микроинъекции или хирургических процедур. Кроме того, гены, регулирующие развитие почек у млекопитающих и земноводных сохраняются. Млекопитающие почки прогрессировать через три этапа: Предпочка, мезонефроса и 1 вторичной почки, в то время как эмбриональные амфибии имеют Предпочка и взрослые амфибии имеют вторичной почки. Основная фильтрация единица этих форм почек является нефрон, и оба млекопитающих и земноводных требуют те же сигнальные каскады и индуктивные события пройти нефрогенеза 2, 3. Предпочка Xenopus содержит один нефрона , состоящий из проксимального, промежуточного, дистальной и соединительной трубочки, и гломусных (аналог клубочках млекопитающих) 1, 4-6 (рис 1 ). Один большой нефрона присутствует в предпочки Xenopus делает его пригодным в качестве простой модели для изучения генов , участвующих в процессах развития почек и болезней.

Карты судьбы клеток были созданы для ранних эмбрионов Xenopus, и находятся в свободном доступе в Интернете по адресу Xenbase 7-11. Здесь мы описываем технику для микроинъекции линиджа трассеров для нацеливания развивающиеся Xenopus пронефрос, хотя и тот же метод может быть адаптирован к целевой других тканей , таких как сердце или глаз. Lineage трейсеры ярлыки (в том числе жизненно важных красителей, флуоресцентно меченных декстранов, гистохимического обнаруживаемых ферментов и мРНК, кодирующие флуоресцентные белки), которые могут быть введены в раннем бластомере, что позволяет визуализировать потомству этой клетки в процессе разработки. Этот протокол использует MEM-RFP мРНК, кодирующий мембранный целевой красный флуоресцентный белок 12, как клонального трассера. Целенаправленное микроинъекции технологийniques для отдельных бластомеров в 4- и 8-клеточных эмбрионов, описанных здесь, могут быть использованы для инъекций с Morpholinos, чтобы сбить экспрессию гена или экзогенной РНК гиперэкспрессией гена интерес. Путем введения в брюшную, вегетативного бластомере, в первую очередь Предпочка эмбриона будут направлены, в результате чего контралатеральной Предпочка в качестве контроля развития. Co-инъекция трассера проверяет, правильно бластомеров инъецируют, и показывает, какие ткани в эмбрионе возникла из введенного бластомере, проверяя адресности предпочки. Иммуноокрашивание предпочки позволяет визуализировать, как хорошо pronephric трубочки были направлены. Избыточной экспрессии и нокдаун эффекты затем может быть забит против контралатеральной стороне эмбриона, который служит в качестве контроля развития, и может быть использовано для вычисления pronephric 13 индекса. Наличие клеточной судьбы карты позволяет этому целенаправленный метод микроинъекции быть использована для целевых тканей OTHэр чем предпочки и совместной инъекции флуоресцентного индикатора позволяет направленно микроинъекции в каждой ткани, чтобы быть проверены перед проведением анализа.

Во время эмбрионального микроинъекции, температура развития должна регулироваться плотно, учитывая , что темпы развития Xenopus сильно зависит от него 14. Эмбрионы следует инкубировать при более низких температурах (14 - 16 ° С) в течение 4- и 8-клеточных инъекций, так как время развития замедляется. При 22 ° С, время разработки от стадии 1 (1) клетки к стадии 3 (4 ячейки) составляет приблизительно 2 часа, в то время как 16 время разработки ° C до стадии 3 составляет около 4 часов. Она занимает около 15 минут, чтобы перейти от 4-клеточного эмбриона к 8-элементная (стадия 4) эмбриона при 22 ° С, но занимает примерно 30 минут при 16 ° С. Аналогичным образом, при 22 ° С, это займет всего 30 минут для 8-клеточного эмбриона прогрессировать до 16-клеточного эмбриона (стадия 5). На этот раз увеличивается до 45 минут при 16 ° С.refore, полезно, чтобы замедлить скорость развития эмбрионов, чтобы дать достаточно времени для инъекций на 8-клеточной стадии, прежде чем эмбрионы прогрессировать до 16-клеточной стадии. Кроме того, температура роста можно модулировать, чтобы ускорить или замедлить развитие эмбриона, пока почки не полностью развита.

Эпидермис головастика стадии Xenopus эмбрионов является относительно прозрачным, что позволяет легко визуализации развивающихся предпочки без рассечения или очистки ткани 15. Из - за относительной прозрачности Xenopus эмбрионов, получение изображений живых клеток также возможно 16,17. Всего монтажа иммунным для визуализации Предпочка можно с установленными антителами , которые маркируют проксимальный, средний, дальний и подсоединению канальцы стадии 38 - 40 эмбрионов , которые позволяют для оценки pronephric развития после целенаправленного воздействия генной экспрессии в Xenopus эмбрионов 18-20.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Следующий протокол был одобрен в Университете Техаса Научного центра здоровья в Центре Хьюстона для Комитета лабораторных животных медицины защиты животных, который служит в качестве институциональной помощи и использованию комитета (протокол #: HSC-AWC-13-135).

1. Выявление и отбор бластомеров для почки, ориентированных Инъекции

  1. Перед генерацией эмбрионов, использовать нормальный Таблица Xenopus развития 21 , чтобы понять ориентацию ранних клеточных делений в эмбрионе. В качестве альтернативы, схемы доступа ранних стадий развития Xenopus на Xenbase 11.
  2. Получить доступ к интерактивной карты Xenopus клеточных судеб на Xenbase 11 , чтобы выбрать , какие бластомер будут направлены для микроинъекции.
  3. Заметим, что одна клетка эмбриона имеет темно пигментированные животное полюс и вегетативный полюс, который является белым и yolky. Следует отметить, что защитная мембрана, известная как желтковой еnvelope, охватывает зародыш.
  4. Обратите внимание на то, что первое расщепление обычно происходит между левой и правой сторонами эмбриона. Эти клетки способствуют одинаково pronephric линии.
  5. Заметим, что второе расщепление делит дорсальной и вентральной половины эмбриона, что приводит к 4-клеточного эмбриона. Спинные клетки имеют меньшие размеры и имеют меньше пигмента , чем вентральных клеток (Фигура 2А и 3А) На рис.
    1. Определить вентральные бластомеры (V, большие, темные клетки) на левой и правой сторон, которые вносят больший вклад в развивающиеся почки , чем спинной (D, маленькие, светлые клетки) бластомеров (рис 2А).
    2. Если инъекции в 4-клеточного эмбриона, впрыснуть левую вентральной бластомера, нацеленную на левой почки (рис 3A и раздел 3).
  6. Третье расщепление делит пополам растительного и животного сторон, в результате чего восемь клеток эмбриона. На данный момент существует четыре животных бластомеры [левый и правый вентральный(V1) и на дорсальной (Д1)] и четыре вегетативные бластомеры [левый и правый вентральный (V2) , и дорсальный (Д2)] (Фигура 2В и 3В).
    1. Найдите вентральной, вегетативные бластомеры (V2). Эти бластомеры вносят больший вклад в развивающиеся почки любые другие клетки на этой стадии (рис 2В). Чтобы настроить таргетинг на левую почку 8-клеточного эмбриона, вводят в левый V2 бластомере (рис 3B и раздел 3).
  7. Обратите внимание на то, что четвертый и пятый расколы рассекают растительного и животного бластомеров. Два Потомство генерируются из каждого бластомера, в результате чего 16-клеточного эмбриона. Клетки были названы в честь своего предшественника. Например, V2 бластомеров от 8-клеточной стадии приводит к V2.1 и V2.2 потомством на 16-клеточной стадии (фиг.2с). Ячейка V2.2 на 16-клеточной стадии обеспечивает большинство клеток, вносящих вклад в развивающейся почке.
  8. Обратите внимание, шестой и седьмой расколы приводят к 32-клеточной Эмбри во. Опять же, два Потомство генерируются из каждого бластомера, которые названы после их предшественника. Так, например, V2.2 бластомеров из 16-клеточной стадии приводит к V2.2.1 и V2.2.2 на стадии 32-клеток. Существует альтернативная система присвоения имен на стадии 32-клеток, в которых клетки идентифицируют в четыре ряда, как А, В, С и D (от животного к растительно), так и в четырех колонках, как 1, 2, 3 и 4 ( от спины к брюху). Таким образом, V2.2.2 бластомеров, что способствует наиболее развивающимся предпочки, называется С3 под этой альтернативной системы именования (рис 2D).

2. Получение Эмбрионы

  1. Приготовьте 50 мл Dejelly раствора (2% цистеина, NaOH до рН 8,0).
  2. Изолировать оба семенники из одного самца лягушки в соответствии со стандартными протоколами 14. Поместите семенники в 60 мм чашке Петри заполнены 10 мл семенников решение для хранения данных (1x Марка, Modified Ringers [MMR, 0,1 М NaCl, 2 мМ KCl, 1 мМ MgSO 4, 2 мМCaCl 2, 5 мМ HEPES , рН 8, 0,1 мМ ЭДТА] 12, 1% бычий сывороточный альбумин, 50 мкг / мл гентамицина). Храните семенники при 4 ° С.
    Примечание: Семенники могут храниться в течение приблизительно 7 - 10 дней при температуре 4 ° С, но эффективность удобрений будет уменьшаться, чем дольше семенники были сохранены.
  3. Сожмите женщины лягушки , чтобы получить яйца в соответствии со стандартными протоколами 14. Сбор яйца в 100 мм чашки Петри. Слейте лишнюю воду.
  4. Отрежьте ¼ из семенников в то время как он находится в яичках решение для хранения данных с помощью пинцета и лезвия бритвы. Перенести кусок семенников в чашку Петри, содержащую яйца. Отрегулируйте размер участка семенников, используемого для учета размера семенника, как долго хранится семенников, и сколько яиц должны быть оплодотворены. Как правило, используют от ¼ до 1/3 свежеприготовленного расчлененным семенника, чтобы оплодотворить одну кладку яиц.
  5. Вырезать часть семенников на мелкие кусочки с помощью пинцета и лезвия бритвы. Добавьте достаточно 0.3x MMR+ 30 мг / мл гентамицина в чашку Петри, чтобы покрыть яйца. Вихревой MMR в блюдо перемешать.
  6. Подождите приблизительно 30 минут для оплодотворения иметь место при комнатной температуре. Обратите внимание, что животное полушарие (пигментированный стороне эмбриона) будет сидеть на верхней части эмбриона после эффективного оплодотворения. Затем удалите MMR из чашки Петри с помощью пипетки передачи. Добавьте достаточно Решение Dejelly на блюдо, чтобы покрыть эмбрионов.
  7. В течение следующих нескольких минут, осторожно встряхните блюдо с перерывами. Энергичного встряхивания блюдо в это время может вызвать дефекты оси.   Желе покрытие на зародышах будет растворяться, и эмбрионы будут собираться в центре тарелки во время закрутки. После того как эмбрионы тесно соприкасаются друг с другом в центре тарелки, удалите Dejelly решение с пипетки передачи. Не оставляйте эмбрионов в Dejelly растворе в течение более 5 минут, или эмбрионы могут быть повреждены.
  8. Вымойте dejellied эмбрионов 3 - 5 раз в 0.3xMMR + 30 мг / мл гентамицина, осторожно поливом или пипеткой от MMR и заполнение блюдо с новым MMR. Не удаляйте все MMR из чашки, или эмбрионы могут быть повреждены.
  9. Удалите все неоплодотворенные яйца или кусочки семенников из чашки Петри с помощью пипетки передачи.
  10. Инкубируйте эмбрионов между 14 и 22 ° C.
    Примечание: Эмбрионы, выращенные при более низких температурах, развиваются медленнее, чем эмбрионов, выращенных при более высоких температурах. Сроки этапов развития можно найти на Xenbase 22.
    1. Чтобы наРынкиСупермаркеты их развития, место половина эмбрионов из одного оплодотворения в чашке Петри выдерживают при 14 ° С, а другая половина эмбрионов в чашке Петри выдерживают при 18 ° С. Это позволяет для двух наборов вливаний в 4-клеток или 8-клеточных эмбрионов из одного оплодотворения.

3. Подготовка растворов для инъекций и микроинъекции Эмбрионы

  1. Готовят инъекционный раствор, содержащий 0,01нг / нл мембраносвязанная красный флуоресцентный белок (MEM-RFP) мРНК 9 в то время как эмбрионы развиваются в 4-элементным или 8-клеточной стадии. Храните раствор для инъекций на льду до готовности внедрить.
  2. Загрузите "капиллярной трубки замены стекла в иглы съемника, с верхней части замены трубки на одной линии с верхней части корпуса иглы съемника. Установите значение тепла # 2 до 800, а значение тянуть до 650. Нажмите" 7 тянуть "кнопку, чтобы вытащить иглу. Это позволит создать 2 иглы из одного 7" стеклянной капиллярной трубки.
  3. Срежьте кончик иглы вытащил с парой Дюмон щипцов.
    Примечание: После извлечения иглы, кончик плотно закрыта и должна быть разрезана. Чем ближе к точке иглы, что она измельчается, тем меньше диаметр кончик иглы будет. Хотя диаметр наконечника не будет влиять на объем впрыска с системой микроинъекции, используемой здесь, наконечник с большим диаметром, более вероятно, повредить зародыш.
  4. Слип мicropipette цанговый на задней части иглы. Далее, проскользнуть большое отверстие уплотнительное кольцо на задней части иглы позади цанги.
  5. Заполните иглу с минеральным маслом с использованием 27 калибра иглы для подкожных инъекций, соблюдая осторожность, чтобы не получить пузырьков воздуха в игле.
  6. Наденьте иглу на толкатель microinjector, усаживая иглу в большое отверстие белой пластиковой прокладкой, установленной на поршень. Плунжер должен иметь маленькое уплотнительное кольцо ближе к корпусу microinjector, а затем белой спейсером, большой отверстие уплотнительного кольца и цанги. Закрепите иглу путем затягивания цангу. Аккуратно потяните иглу, чтобы убедиться, что он надежно закреплен.
  7. Нажмите и удерживайте кнопку "пустой" на блоке управления microinjector пока не останется два звуковых сигнала.
  8. Пипетка 3 мкл раствора для инъекций на кусок парафильмом. Вставьте кончик иглы в шарик инъекционного раствора на парафильмом. Нажмите и удерживайте кнопку "заполнить" на microinjector блок управления, чтобы сделать инъекции раствора в иглу.
  9. Заполните блюдо 60 мм Петри выстлана 500 мкм полиэфирной сетки 5% Ficoll в 0.3x MMR + 30 мг / мл гентамицина. Тщательно пипеткой 20 - 30 4-клеток или 8-клеточных эмбрионов в чашку.
  10. Использование цикла 14 волос, манипулировать эмбрионы так, чтобы бластомеров быть впрыскиваемого перед иглой. Чтобы настроить таргетинг на левой почки, выстраиваются в линию эмбрионов так, чтобы левая вентральные бластомеры 4-клеточных эмбрионов или слева V2 бластомеры 8-клеточных эмбрионов сталкиваются с иглой.
  11. Вводят 10 нл раствора для инъекций в выбранную бластомере каждого эмбриона в блюдо.
    Примечание: Сетка на дне чашки Петри стабилизирует эмбрионов и предотвращает их от прокатки, что позволяет им вводить без использования петли волос для стабилизации.
  12. Передача впрыскивается эмбрионов в лунки планшета для культуры, которые были заполнены с 5% Ficoll в 0.3x MMR + 30 мг / мл гентамицина. Выдержите впрыскивается эмбрионас при 16 ° С в течение не менее одного часа, чтобы позволить инъецированные бластомеры заживать.
  13. Передача зажили эмбрионов в лунки новой культуры пластины, которые были заполнены с 0.3x MMR + 30 мг / мл гентамицина на стадии 9 (до гаструляции).
  14. Инкубируйте эмбрионов на 14 - 22 ° С до тех пор пока не достигнет эмбрионы Stage 38 - 40 21.

4. Закрепление и Иммуноокрашивание Эмбрионы

  1. Приготовьте 50 мл сульфата МОПС / EGTA / магний / Формальдегид Буфер [MEMFA: 100 мМ MOPS (рН 7,4), 2 мМ EGTA, 1 мМ MgSO 4, 3,7% (об / об) формальдегида].
  2. С помощью пипетки передачи, положить 10 - 20 Stage 38 - 40 эмбрионов в стеклянный флакон. Добавить 10 мкл 5% бензокаин в 100% этанола во флакон и инвертировать флакона для смешивания. Подождите 10 минут, чтобы обезболить эмбрионов.
  3. Удалите MMR из флакона с помощью стеклянной пипетки. Если обработке нескольких ампул в то же время, Флаконы можно держать вертикально в 24-луночный культуральный планшет.
  4. С помощью стеклянной трубыTTE, заполнить флакон с MEMFA. Поместите флакон на трехмерной качающейся платформе в течение 1 ч при комнатной температуре.
  5. Извлеките MEMFA из флакона с помощью стеклянной пипетки. Заполните флакон с 100% -ным метанолом. Поместите флакон на трехмерной качающейся платформе в течение 10 мин при комнатной температуре. Повторите этот шаг мыть еще один раз, и хранить эмбрионов в 100% -ном растворе метанола в течение ночи при -20 ° С.
  6. Приготовьте 1х фосфатно-солевом буферном-бычьим сывороточным альбумином-Тритон (РВТ): 1X PBS, 2 мг / мл бычьего сывороточного альбумина, 0,1% Тритон Х-100.
  7. Готовят первичный раствор антител: 1x ПБТ с 10% козьей сывороткой с 1: 5 разбавление мышиного моноклонального антитела 4A6 (маркировать мембраны промежуточных, дистальной и соединительных трубочек 20), с 1:30 разбавлением мышиных моноклональных антител 3G8 (маркировать просвет проксимальных канальцев 20) и 1: 250 разбавлением кроличьи поликлональные антитела RFP (маркировать МЕМ-RFP Tracer). Хранить при температуре 4 ° С.
  8. Подготовьте SecondaРаствор Ry антитела: 1x ПБТ с 10% козьей сыворотки, 1: 500 Alexa 488 козий против мышиного IgG (концентрация запас 2 мг / мл; на этикетке 4A6 и 3G8), и 1: 500 Alexa 555 козьего анти-кроличьего IgG (акций концентрация 2 мг / мл; маркировать МЕМ-RFP Tracer). Хранить при температуре 4 ° С, охватывающих трубу в фольгу для защиты от света.
  9. В качестве альтернативы, собирать первичные и вторичные антитела, после окрашивания, и сохранить при 4 ° С для повторного использования в будущих экспериментах. Если антитело быть сохранены для повторного использования, добавить 0,01% азида натрия.
  10. Immunostain эмбрионов с использованием установленных протоколов 18.

5. Визуализация эмбрионы и анализа целевых Pronephric ткани

  1. Экран на иммуноокрашиванию эмбрионов, чтобы убедиться, что правильно бластомеров инъецируют при просмотре флуоресценции трейсера под флуоресцентным стереомикроскопа на 1X (для просмотра весь эмбрион) и 5X (для просмотра почек) увеличение. Место эмбрионов в стеклянной пластине с несколькими хорошо с мыLLS заполненные 1x ПБТ с помощью пипетки передачи с наконечником отрезаны. Манипулирование эмбрионов с петлей для волос. Используйте только те эмбрионы , которые имеют совместное инъецированных трассирующий , присутствующий в предпочки на левой стороне эмбриона (рис 3C, F и фиг.4С, F) для генной экспрессией или бросовой анализа.
  2. В качестве альтернативы, очистить эмбрионов в Clear Мюррей (2 части бензилбензоат: 1 часть бензиловый спирт) путем размещения эмбрионов в стеклянный флакон и наполнения флакона с Clear Мюррея. Визуализируйте эмбрионов с использованием стеклянного луночного планшета.
    Примечание: Мюррей Clear является органический растворитель, и его следует использовать с осторожностью. Надевайте перчатки, и использовать только стеклянные флаконы и пипетки с Clear Мюррея.
  3. Хранить эмбрионов при 4 ° С в 1x PBT в течение 2 - 3 недель. Для длительного хранения эмбрионов, обезвоживают эмбрионов промыванием два раза в 100% метаноле при комнатной температуре в течение 10 мин. Хранить эмбрионов при -20 ° С в 100% метаноле.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Микроинъекции 4- и 8-клеточных эмбрионов Xenopus с MEM-RFP мРНК показывают различные уровни ориентации на предпочки. На рисунке 4 показан этап 40 эмбрионов с правильными паттернов экспрессии мРНК MEM-ОПП. Эмбрионы были введены в левой вентральной бластомере (фиг.4А), и сортируют для надлежащего характера экспрессии мРНК МЕМ-RFP. Помимо выражения MEM-RFP в проксимальной, промежуточной, дистальной и присоединительные канальцев почки, правильно инъ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ориентация Предпочка развивающихся эмбрионов Xenopus опирается на выявление и введение правильного бластомера. Инъекция V2 бластомере 8-клеточных эмбрионов ориентирована на левый Предпочка 18. Это оставляет контралатеральной правильные Предпочка в качестве внутреннего контроля. Если морфолино нокдаун или РНК суперэкспрессия используется для изменения развития почек, контралатеральной правые Предпочка могут быть использованы для сравнения эффектов гена нокдаун или избыточная экспрессия на левом предпо...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Национальным институтом здравоохранения гранта NIDDK (K01DK092320) и финансирование запуска из отдела педиатрии в Университете штата Техас Макговерна медицинской школы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Хлорид натрияFisherS271-3
Хлорид калияFisherP217-500
Сульфат магния FisherM63-500
Хлорид кальцияFisherC79-500
HEPESFisherBP310-500
EDTAFisherS311-500
Раствор гентамицина, 50 мг/млAmrescoE737-20ML
L-цистеин, 99%+Acros Organics52-90-4
Ficoll FisherBP525-100
100 мм x 15 мм чашка ПетриFisherFB0875712
Mini Fridge IIBoekel260009Настольный инкубатор для эмбрионов.
Gap43-RFP плазмидаДля получения индикаторной РНК. Ссылка: Davidson et al., 2006.
Родамин декстран, 10 000 M.W.ИнвитрогенD1817Трейсер.
Класс молекулярной биологии, стерильная очищенная вода USPCorning46-000-CI
7" Drummond сменные трубки Drummond3-000-203-G/XLиглы для микроинъекций.
ИглосъемникSutter InstrumentsP-30
Тонкие щипцыDumont11252-30Для ломания микроинъекционного наконечника иглы.
Nanoject IIDrummond3-000-204Микроинъектор.
Масло минеральное, тяжелоеFisherCAS 8042-47-5Масло для игл.
27 G Monoject игла для подкожных инъекцийCovidien8881200508Для загрузки минерального масла в иглу для микроинъекций.
Шприц Luer-Lok 5 млBD309646Для загрузки минерального масла в иглу для микроинъекций.
Чашка Петри 60 мм x 15 мм FisherFB0875713A
800 микрон Полиэфирная сеткаМелкие деталиCMY-0800-C
Перенос пипетокFisher13-711-7MДля переноса эмбрионов. Отрежьте кончик так, чтобы эмбрионы легко захватывались пипеткой.
6-луночная клеточная культуральная пластинаNest Biotechnology
MOPSFisherBP308-500
EGTAAcros Organics67-42-5
ФормальдегидFisherBP531-500
15 мм x 45 мм Флакон с винтовой резьбойFisher03-339-25BДля фиксации, окрашивания и хранения эмбрионов.
24-луночный клеточный планшетГнездо Биотехнология
БензокаинСпектрBE130
ЭтанолFisherBP2818-4
МетанолFisherA412-4
Фосфатный буферный раствор (PBS) 1x порошокFisherBP661-50
Бычья сыворотка белкаFisherBP1600-100
Triton X-100FisherBP151-500
3D Mini рокер, модель 135Denville Scientific57281
Сыворотка для коз, происхождение из Новой ЗеландииИнвитроген16210064
азид натрияFisherS227I-25
Моноклональное антитело 3G8Европейский ресурсный центрПервичное антитело для мечения проксимальнее трубочки.
Моноклональное антитело 4A6Европейский ресурсный центрПервичное антитело для мечения промежуточных, дистальных и соединительных канальцев.
anti-RFP pAb, очищенный IgG/кроликMBLPM005Первичное антитело к метке индикатора Gap43-RFP.
Alexa Fluor 488 козий антимышиный IgGLife TechnologiesA11001Вторичное антитело для мечения почечных канальцев.
Alexa Fluor 555 козий антикролик IgGLife TechnologiesA21428Вторичное антитело к метке индикатора Gap43-RFP.
9 Полостная пятнистая пластинаCorning7220-85
БензилбензоатFisher105862500Опционально - для очистки эмбрионов
Бензиловый спиртFisherA396-500Опционально - для очистки эмбрионов
Xenopus Xenopus

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vize, P. D., Seufert, D. W., Carroll, T. J., Wallingford, J. B. Model systems for the study of kidney development: Use of the pronephros in the analysis of organ induction and patterning. Dev. Biol. 188 (2), 189-204 (1997).
  2. Brandli, A. W. Towards a molecular anatomy of the Xenopus pronephric kidney. Int. J. Dev. Biol. 43 (5), 381-395 (1999).
  3. Hensey, C., Dolan, V., Brady, H. R. The Xenopus pronephros as a model system for the study of kidney development and pathophysiology. Nephrol. Dial. Transplant. 17, (Suppl 9) 73-74 (2002).
  4. Carroll, T., Vize, P. D. Synergism between Pax-8 and lim-1 in embryonic kidney development. Dev. Biol. 214 (1), 46-59 (1999).
  5. Zhou, X., Vize, P. D. Proximo-distal specialization of epithelial transport processes within the Xenopus pronephric tubules. Dev. Biol. 271 (2), 322-338 (2004).
  6. Raciti, D., et al. Organization of the pronephric kidney revealed by large-scale gene expression mapping. Genome Biol. 9 (5), 84(2008).
  7. Moody, S. A., Kline, M. J. Segregation of fate during cleavage of frog (Xenopus laevis) blastomeres. Anat. Embryol. Berl. 182 (4), 347-362 (1990).
  8. Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 16-cell stage of Xenopus embryo. Dev. Biol. 119 (2), 560-578 (1987).
  9. Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 32-cell stage of Xenopus embryo. Dev. Biol. 122 (2), 300-319 (1987).
  10. Bauer, D. V., Huang, S., Moody, S. A. The cleavage stage origin of Spemann's Organizer: Analysis of the movements of blastomere clones before and during gastrulation in Xenopus. Dev. 120 (5), 1179-1189 (1994).
  11. Karpinka, J. B., et al. Xenbase, the Xenopus model organism database; new virtualized system, data types and genomes. Nucleic Acids Res. 43, 756-763 (2015).
  12. Davidson, L. A., Marsden, M., Keller, R., Desimone, D. W. Integrin alpha5beta1 and fibronectin regulate polarized cell protrusions required for Xenopus convergence and extension. Curr. Biol. 16 (9), 833-844 (2006).
  13. Wallingford, J. B., Carroll, T. J., Vize, P. D. Precocious expression of the Wilms' tumor gene xWT1 inhibits embryonic kidney development in Xenopus laevis. Dev. Biol. 202, 103-112 (1998).
  14. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis. A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2000).
  15. Miller, R. K., Lee, M., McCrea, P. D. The Xenopus pronephros: A kidney model making leaps toward understanding tubule development. Xenopus Development. Kloc, M., Kubiak, J. Z. , Wiley. 215-238 (2014).
  16. Lienkamp, S. S., et al. Vertebrate kidney tubules elongate using a planar cell polarity-dependent rosette-based mechanism of convergent extension. Nat. Genet. 44 (12), 1382-1387 (2012).
  17. Lyons, J. P., et al. Requirement of Wnt/β-catenin signaling in pronephric kidney development. Mech. Dev. 126 (3-4), 142-159 (2009).
  18. Miller, R. K., et al. Pronephric tubulogenesis requires Daam1-mediated planar cell polarity signaling. J. Am. Soc. Nephrol. 22, 1654-1667 (2011).
  19. Vize, P. D., Jones, E. A., Pfister, R. Development of the Xenopus pronephric system. Dev. Biol. 171 (2), 531-540 (1995).
  20. Miller, R. K., Lee, M., McCrea, P. D. Chapter 12: The Xenopus Pronephros: A Kidney Model Making Leaps toward Understanding Tubule Development. Xenopus Development. Kloc, M., Kubiak, J. Z. , Wiley and Sons. Oxford. (2014).
  21. Taira, M., Otani, H., Jamrich, M., Dawid, I. B. Expression of the LIM class homeobox gene Xlim-1 in pronephros and CNS cell lineages of Xenopus embryos is affected by retinoic acid and exogastrulation. Development. 120, 1525-1536 (1994).
  22. Weber, H., et al. Regulation and function of the tissue-specific transcription factor HNF1 alpha (LFB1) during Xenopus development. Int. Dev. Biol. 40 (1), 297-304 (1996).
  23. Carroll, T. J., Vize, P. D. Synergism between Pax-8 and lim-1 in embryonic kidney development. Dev. Biol. 214 (1), 46-59 (1999).
  24. Etkin, L. D., Pearman, B., Ansah-Yiadom, R. Replication of injected DNA templates in Xenopus embryos. Exp. Cell Res. 169 (2), 468-477 (1987).
  25. Vize, P. D. The chloride conductance channel ClC-K is a specific marker for the Xenopus pronephric distal tubule and duct. Gene Expr. Patterns. 3 (3), 347-350 (2003).
  26. Uochi, T. S., Takahashi, S., Ninomiya, H., Fukui, A., Asashima, M. The Na+, K+-ATPase alpha subunit requires gastrulation in the Xenopus embryo. Dev. Growth Differ. 39 (5), 571-580 (1997).
  27. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin): A systematical & chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , Garland Publishing, Inc. NY. (1994).
  28. Ubbels, G. A., Hara, K., Koster, C. H., Kirschner, M. W. Evidence for a functional role of the cytoskeleton in determination of the dorsoventral axis in Xenopus laevis eggs. J. Embryol. Exp. Morphol. 77, 15-37 (1983).
  29. Huang, S., Johnson, K. E., Wang, H. Z. Blastomeres show differential fate changes in 8-cell Xenopus laevis embryos that are rotated 90 degrees before the first cleavage. Dev. Growth Differ. 40 (2), 189-198 (1998).
  30. Colman, A., Drummond, D. The stability and movement of mRNA in Xenopus oocytes and embryos. J. Embryol. Exp. Morph. 97, 197-209 (1986).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Xenopus

Похожие статьи