Мы предоставляем воспроизводимый базовый метод для долгосрочной микроскопии сексуального жизненного цикла делящихся дрожжей. С незначительными корректировками представленный протокол позволяет сосредоточить исследования на разных этапах репродуктивного процесса.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Микроскопия делящихся дрожжей Жизненный цикл сексуальной
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Дрожжи деления Schizosaccharomyces pombe были бесценной модельной системой в изучении регуляции митотического клеточного цикла, механики деления клеток и полярности клеток. Кроме того, классические эксперименты по его половому размножению дали результаты, имеющие решающее значение для современного понимания рекомбинации ДНК и мейоза. Более поздний анализ спаривания делящихся дрожжей поднял интересные вопросы о механизмах отклика на внешние стимулы, росте поляризованных клеток и слиянии клеток. Чтобы детально изучить эти темы, мы разработали простой протокол микроскопии всего полового жизненного цикла. Описанный здесь метод легко корректируется для изучения конкретных этапов спаривания. Вкратце, после выращивания до экспоненциальной фазы в богатой азотом среде, клеточные культуры перемещаются в среду, лишенную азота, на периоды времени, подходящие для стадии полового жизненного цикла, которая будет исследована. Затем ячейки устанавливаются на изготовленные по индивидуальному заказу, легко конструируемые камеры с агарозными прокладками для визуализации. Такой подход позволяет контролировать клетки от начала спаривания до окончательного образования спор.
Введение
Хотя обмен генетическим материалом между двумя ячейками является центральным событием в половом размножении, он опирается на цепи событий, которые способствуют дифференциации клеток, позволяют по выбору партнера, осуществляют слияние клеток клеток и поддержания стабильности генома. Таким образом, половой жизненный цикл представляет себя в качестве модельной системы для изучения ряда биологических вопросов , связанных с развитием коммутаторов, реакция на внешние раздражители, плазма слияния мембран, сегрегации хромосом и т.д. исследуя делящихся дрожжей полового цикла для изучения этих явлений приносит выгоды от мощные генетика Модель системы, устоявшихся высо....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Микроскопия анализ делящихся дрожжей полового размножения
1. Подготовка СМИ
- Подготовка Минимальная споруляционная среда , (MSL-N) 15 путем смешивания следующих компонентов: глюкоза: 10 г / л, КН 2 РО 4: 1 г / л, NaCl: 0,1 г / л, MgSO 4 · 7H 2 O: 0,2 г / Л. Добавить Микроэлементы (10,000x): 100 мкл / л, витамины (1,000x): 1 мл / л, и 0,1 М CaCl 2 мл / л. Фильтр-стерилизовать с помощью фильтра с размером частиц 0,22 мкм пор и хранить при комнатной температуре (RT).
- Используйте следующие витамины (1,000x) Наличие на складе: пантотенат: 1 г / л, никотиновая кис....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Деление роста дрожжей и Спаривание динамика при удалении источника азота
В азотное голодание является необходимым условием для начала полового размножения в делящихся дрожжей дикого типа homothallic H90 штамм контролировали при переходе от азота богатых азотом лишенной среды (рисунок 2), в соответствии с протоколом , описанной на рисунке 1. В кратком изложении, клетки выращивались O / N в экспоненциальной фазе (OD 600 = 0,5) в .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Условия окружающей среды, а также наличие питательных веществ, в частности, сильно влияют на физиологию делящихся дрожжей. Азотное голодание необходимо для приверженности к половому размножению и первоначально приводит к поразительным изменениям в прогрессии митотического клеточного цикла (см. 21 и Рисунок 2). После удаления азота из экспоненциально растущего населения, размер ячейки при делении быстро уменьшается (рис 2С) и большинство клеток арестовывать митоза короче , чем.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Благодарности
AV была поддержана долгосрочной докторантуру EMBO. Исследования, проведенные в лаборатории Мартина финансируется за счет гранта ERC Starting (GeometryCellCycle) и грант научного фонда Швейцарский национальный (31003A_155944) до СГМ.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Глюкоза | Sigma-Aldrich | G8270-10KG | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 1.05108.0050 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71381 | |
| MgSO4• 7H2O | Sigma-Aldrich | 63140 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 12095 | |
| Пантотенат | AppliChem | A2088,0025 | |
| Никотиновая кислота | AppliChem | A0963,0100 | |
| Инозитол | AppliChem | A1716,0100 | |
| Биотин | AppliChem | A0967,0250 | |
| Борная кислота | Sigma-Aldrich | B6768-1KG | |
| MnSO4 | AppliChem | A1038,0250 | |
| ZnSO4• 7H2O | Sigma-Aldrich | Z4750 | |
| FeCl2• 6H2O | AppliChem | A3514,0250 | |
| Оксид молибдена (VI) (MoO3) | Sigma-Aldrich | 69850 | |
| KI | AppliChem | A3872,0100 | |
| CuSO4• 5H2O | AppliChem | A1034,0500 | |
| Лимонная кислота | AppliChem | A2344,0500 | |
| Agarose | Promega | V3125 | |
| (NH4)2SO4 | Merck | 1.01217.1000 | |
| L-лейцин | сигма-олдрич | L8000-100G | |
| соль аденина гемисульфата, мини 99% | сигма-олдрич | A9126-100G | |
| урацил; | Sigma-Aldrich | U0750 | |
| Ланолин | Sigma-Aldrich | L7387 | |
| Вазелин | Reactolab | 92045-74-4 | |
| Парафин | Reactolab | 7005600 |
Ссылки
- Mata, J., Bahler, J. Global roles of Ste11p, cell type, and pheromone in the control of gene expression during early sexual differentiation in fission yeast. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (42), 15517-15522 (2006).
- Xue-Franzen, Y., Kjaerulff, S., Holmberg, C., Wright, A., Nielsen, O.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
