Качественный и количественный анализы для обнаружения и определения характеристик белка Противомикробные

Краткое содержание

Здесь мы представляем протоколы для быстрого скрининга и характеристики ферментов на антимикробную активность. В анализе диффузии микрослайдов и анализе высвобождения красителя используются целевые бактериальные субстраты для качественной и количественной оценки ферментативной активности.

Аннотация

Первоначальные оценки больших микробных библиотек для потенциальных производителей новых антимикробных белков требуют как качественных, так и количественных методов для скрининга целевых ферментов, прежде чем вкладывать больше исследовательских усилий и ресурсов. Цель данного протокола состоит в том, чтобы продемонстрировать два взаимодополняющих анализа для проведения этих первоначальных оценок. Анализ диффузии микрослайдов обеспечивает начальный или простой скрининг обнаружения, позволяющий качественно и быстро оценить протеолитическую активность в отношении массива как жизнеспособных, так и убитых при нагревании бактериальных целевых субстратов. В свою очередь, повышенная чувствительность и воспроизводимость анализа высвобождения красителя обеспечивает количественную платформу для оценки и сравнения воздействий окружающей среды, влияющих на гидролитическую активность белковых противомикробных препаратов. Возможность маркировать специфические субстраты клеточных культур, убитых при нагревании, красителем Remazol brilliant blue R расширяет эту возможность для адаптации анализа высвобождения красителя для характеристики интересующей ферментативной активности.

Введение

Антимикробные препараты играют важную роль в борьбе с широким спектром микроорганизмов, таких как вирусы, грибки и бактерии. Антимикробная активность, продуцируемая различными бактериями, варьирует по целевой специфичности от широкого спектра действия до видоспецифичных, включая клинически значимые бактериальные патогены ¹. В природе белковые антимикробные соединения, такие как бактериоцины и лизины, представляют собой микробный арсенал средств для самозащиты, репликации и получения питательных ^{веществ2,3}. Выступая в качестве посредников популяционной динамики в микробных сообществах, белковые противомикробные препараты обеспечивают конкурентное преимущество продуцирующего организма по сравнению с непродуктивными, чувствительными видами ⁴. В качестве рекомбинантных ферментов и пробиотиков эти белки также имеют экономическое и социальное значение, поскольку потребность в новых источниках контроля патогенов возрастает с каждым новым расширением устойчивости к противомикробным препаратам в бактериальной популяции.

Первые оценки недавно открытых белковых противомикробных препаратов включают определение основных физических характеристик, присущих ферменту. Методы быстрого скрининга потенциальных противомикробных препаратов позволяют отобрать кандидатов с гидролитической активностью в отношении желаемых целевых субстратов. Анализ диффузии микрослайдов и количественный анализ высвобождения красителя позволяют использовать различные субстраты для обнаружения ферментативного гидролиза. Что касается белковых антимикробных ферментов, обладающих активностью в отношении клеточной стенки бактерий, универсальность этих анализов позволяет проводить быстрый и эффективный, качественный и количественный скрининг жизнеспособных бактериальных клеток (только микрослайдовый анализ), убитых теплом целых бактериальных клеточных субстратов или очищенного пептидогликана из целевой бактерии. Эти анализы полезны для открытия антимикробных ферментов для использования в таких областях, как альтернативные методы лечения, пищевые добавки и ингибиторы производства биопленки.

Анализ диффузии микрослайдов и анализ высвобождения красителя являются продемонстрированными методами обнаружения и характеристики новых белковых противомикробных препаратов. Анализ диффузии микрослайдов обеспечивает относительную (качественную) оценку антимикробной активности и позволяет свести к минимуму концентрацию и активность фермента. С помощью этого метода активность легко визуализируется как развитие зоны лизиса с отсутствием активности, что приводит к отсутствию формирования зоны. Скорость развития зоны и диаметр зоны указывают на количество и чистоту фермента, присутствующего в образце; Однако на эту скорость и качество очистки субстрата в пределах зоны также может влиять присутствие загрязняющих веществ, полнота реакции гидролиза и тип субстрата. Мешающие загрязняющие вещества могут влиять на скорость диффузии ферментов из скважины, в то время как неполный гидролиз или изменение типа субстрата могут привести к образованию мутной зоны лизиса ⁶.

Анализ выделения красителя количественно оценивает количество ковалентно связанных продуктов красителя Remazol brilliant blue R, высвобождаемых в надосадочную жидкость реакции из ферментативно гидролизованного субстрата. Метод имеет лишь незначительную вариабельность, связанную с разницей в субстрате, что обеспечивает большую чувствительность для обнаружения гидролиза по сравнению с анализом микрослайдовой диффузии. Эти свойства позволяют использовать метод для характеристики биохимических свойств фермента и для стандартизации анализа для сравнения между различными антимикробными ферментами.

В этом протоколе мы предоставляем методы для выполнения базового анализа диффузии микрослайдов и анализа высвобождения красителя, демонстрируя при этом масштаб пределов обнаружения и вариабельность для каждого из них. Анализы используются для проведения базовой оценки неизвестного белка, антимикробного препарата, выделенного из супернатанта культуры неохарактеризованного изолята почвенных бактерий. Наблюдаемая активность в отношении субстратов бактериальных клеток в рамках анализов позволяет сравнивать активность реакции между ранее не охарактеризованным белком, противомикробным белком и α-химотрипсином, контрольным протеолитическим ферментом. Эти протоколы обеспечивают основу для применения двух методов, которые могут быть расширены и модифицированы для адаптации к различным приложениям.

Протокол

1. Подготовка Бактериальные и пептидогликана подложках

Примечание: Цельноклеточные бактериальные субстраты и очищенные пептидогликаны используются в качестве ферментных субстратов как в диффузионном тесте и предметное стекло анализа красителя высвобождением. Эти субстраты требуют подготовки перед проведением реакции фермента. Следующий протокол описывает их подготовку.

1. Всего Бактериальный клеточный субстрат
   1. Производят субстрат бактериальной клетки путем инокуляции 500 мл питательного бульона с 2 мл ночной культуры Bacillus зиЫШз 168 (American Type Culture Collection, ATCC 23857). Инкубируют при 30 ° C при встряхивании (125 оборотов в минуту) до тех пор, культура не достигнет фазы экспоненциального роста, который определяется как фазу быстрого роста, что приводит к удвоению бактериальной культуры. Для культивирования сальмонелла энтерика подвид. Enterica (ATCC 10708), используют питательный бульон в качестве ростовой среды при 37 ° C при встряхивании (125 оборотов в минуту).
   2. Тепло-убить каждую культуру автоклавированием в течение 10 мин при температуре 121 ° С под давлением 3 атм давления.
   3. Урожай убитых нагреванием бактериального субстрата путем центрифугирования в течение 20 мин при 5000 х г. Вымойте гранул в три раза с 1 типа воды и повторно приостанавливать в минимальном количестве воды. В этом исследовании, приостановить субстраты 1200 мкл.
   4. Аликвоты 300 мкл бактериальных клеток субстратов до 1,5 мл микроцентрифужных труб и хранить при температуре 20 ° С.
2. Очищенная пептидогликану Субстрат
   1. Очищают пептидогликана из бактерии целевой подложки ^7-10 или приобрести у поставщика (см Материалы и оборудование таблицу). Очищают сырой пептидогликану препараты из вспомогательных полимеров клеточных стенок.

2. Качественный Diffusion Анализ предметное стекло [Modified из Lachica, и др. ^11]

Примечание: Анализ диффузии является предметное стеклокачественный метод для обнаружения присутствия антимикробного фермента в образце. Поскольку фермент диффундирует через агарозном матрицу, содержащую подложку, зона очистки развивается как фермент гидролизует субстрат. Следующий протокол описывает подготовку и выполнения анализа диффузии для качественно предметное стекло обнаружения присутствия белковых препаратов.

1. Определить концентрацию антимикробного фермента быть оценена с использованием бицинхониновой кислоты (ВСА) Protein Assay Kit в соответствии с протоколом производителя.
2. Использование фосфатно-солевого буфера (PBS) в качестве буфера фермента; Однако, эмпирически определить буфер, подходящий для данного фермента.
3. Произвести серийное разведение антимикробного фермента с использованием фосфатно-солевого буфера (PBS) в качестве реакционного буфера. Серийное разведение, используемые в этих анализах диффузии предметное стекло производства окончательных анализа белковых масс 0 пг, 10 пг, 100 пг, 1 нг, 10 нг, 100 нг, 1 мкг, а 10 мкг на объем реакционной смеси.
4. Разлить белковые массы в отдельные пробирки микроцентрифужных и корректировать объемы белка до 20 мкл с помощью PBS в рамках подготовки к дополнение к реакции скважин предметное стекло.
5. Сделать 0,5% раствора агарозы путем растворения 0,25 г агарозы в 50 мл PBS. Раствор нагревают до кипения, пока агароза полностью не растворится. Определение потерь воды в процессе плавки по весу и добавить обратно в раствор.
6. Добавляют 50 мкл 10% азида натрия в воде до раствора агарозы и регулировать температуру раствора до 50 ° С в водяной бане. Азид натрия добавляют для ингибирования роста бактерий загрязняя при инкубации анализа диффузии предметное стекло. Если жизнеспособные клетки используют в качестве субстрата, опустить азид натрия из раствора агарозы.
7. Разморозить убитых нагреванием бактерий субстрат на льду.
8. Повторное приостановить бактериальную субстрат в 12 мл раствора агарозы с целью приблизительного согласовани мутности 2,0 McFArland эквивалентности стандарт (см Материалы таблицу). Сравните Мутность решений визуализацией черной линии на белом фоне с помощью растворов, добавление бактериальной субстрата в агарозе, пока приблизительный мутность не будет достигнута.
9. Немедленно пипеткой 3 мл раствора агарозы-субстрата (25 предметное стекло х 75 х 1 мм ^3).
10. После того, как скользит затвердеть, пробивать три скважины в агарозного слоя подложки каждого, используя предметное стекло пробки мотылька (4,8 мм диаметр). Добавьте 20 мкл каждого доводитс белка серийного разведения в соответствующие лунки.
11. С помощью PBS (20 мкл) или бычьего сывороточного альбумина (5 мкг в 20 мкл PBS) в качестве отрицательного контроля хорошо. С помощью известных бактериолитические ферменты, подходящие для подложки, такие как лизоцим, в качестве положительного контроля.
12. Инкубировать слайд в камере влажности при 37 ° С или оптимальной температуры активность фермента. Продолжительность инкубации зависит от концентрации иУдельная активность противомикробной фермента. Типичное время реакции составляет в течение ночи (приблизительно 16 ч).
13. После инкубации наблюдать слайды под косвенным светом и захвата изображений развивающегося анализа с использованием цифровой однообъективный зеркалку с 60 мм объективом на фокусном расстоянии примерно 30 см.
    Примечание: ферментативная активность белка противомикробного для данного субстрата коррелирует с развитием четкой зоны гидролиза, который образует вокруг скважины, как фермент, диффундирует в агарозы.
14. Для того, чтобы квалифицировать ферментативную активность, наблюдать размеры зон, которые образуют вокруг каждой лунки. Высокая ферментативная активность качественно относится к большей зоне, в то время как низкая ферментативная активность качественно относится к меньшей зоне.

3. Подготовка основания Маркировка - Remazol Brilliant Blue R Dye Этикетировочное [Измененный Чжоу ^12]

Примечание: В анализе красителя релиз, субстрат, ковалентно Линкеd к Remazol бриллиантовый синий R краситель. Следующий протокол описывает получение окрашенных ферментных субстратов.

1. Сделать раствор 250 мМ гидроксида натрия (NaOH) при растворении 1 г NaOH в 99 мл воды типа I, которые будут использоваться для приготовления раствора 200мм Remazol бриллиантовый синий R краситель (БОР).
2. Приготовьте раствор 200 мМ БОР путем растворения 1,25 г БОР в 98,75 мл ± 1 мл свежего раствора 250 мМ NaOH (стадия 3.1).
3. Ресуспендируйте убитых нагреванием бактериальных клеток при концентрации 0,5 г сырого веса в 30 мл раствора БОР. Для получения очищенного пептидогликана, повторно приостанавливать пептидогликана при концентрации 0,3 г сырого веса в 30 мл раствора БОР.
4. Инкубируют реакционную смесь в колбе Эрленмейера на вращающейся платформе в течение 6 ч при температуре 37 ° С при осторожном перемешивании.
5. Передача реакционной смеси до 4 ° С инкубатор и инкубируют в течение еще 12 ч при осторожном перемешивании.
6. После инкубации собирают окрашенного субстрата путем центрифугирования при 3000 мкгв течение 30 мин. Декантируют раствор красителя из гранул субстрата.
7. Удалить нековалентно связанный растворимый краситель из субстратов путем промывки красителя-меченых клеток или пептидогликана раз (примерно 3-5 промывок) с I типа воды с последующим центрифугированием. С каждым добавлением воды, повторно приостанавливать осадок тщательно.
   Примечание: Когда несвязанный, растворимый краситель больше не виден в воде для стирки после центрифугирования. Основание должно быть дано одно дополнительное мытье. Обратите внимание, что субстрат будет оставаться синим, в то время как супернатант последней промывки будет ясно.
8. Хранить крашеные субстраты, суспендированные в минимальном количестве воды, при -20 ° С для последующего использования.

4. Количественный Dye-релиз анализа

Примечание: В ходе анализа красителя высвобождения, гидролиз БОР-окрашенного субстрата в ферментативной реакции выпусками окрашивают продукты в реакционную супернатант. Колометрической измерение количества красителя выпущен указывает на АМОUNT ферментативной активности в пределах данного образца для данного фермента. Количественный метод позволяет сравнение различных ферментов через субстратов и позволяет изменения условий окружающей среды , влияющих на реакцию ферментативного (например, температуры, солености и рН). Следующий протокол описывает подготовку и выполнения анализа красителя высвобождения для количественного определения ферментативной активности белковых препаратов.

1. Подготовка к Пробирной Dye-релиз
   1. Дайте замороженный окрашенная субстрат нагреться до комнатной температуры и дважды промывали буфером для анализа (PBS), который определяется эмпирически для данного фермента.
   2. Рассчитать объем суспензии подложки, которая необходима путем умножения объема реакционной смеси 200 мкл на количество анализов на красителе высвобождением должна быть выполнена.
   3. Приготовить приостановку подложку путем добавления окрашенную субстрата в объеме буфера для анализа, определенного в пункте 4.1.2, до оптической плотности (ОД) 2,0 достигается при длине волны 595 нм с использованием спектрофотометра. Для того, чтобы оставаться в пределах функциональных ограничений спектрофотометра измерения 2,0 OD ₅₉₅ как 1,0 для 1: 1 разбавления концентрированного раствора. Использование буфера для анализа в качестве заготовки.
      Примечание: Мутность субстрат для реакции может быть увеличена за пределы 2,0 до соответствовать уровню активности высокоэффективных ферментов.
   4. Подвешивание белка противомикробным оценивать в буфере для анализа при ориентировочной концентрации 1 мг / мл.
   5. С помощью микропланшет-количественный анализ пробирного набора ВСА Protein в соответствии с протоколом производителя, определить фактическую концентрацию образца белка, подвергаемых тестированию. Отрегулируйте концентрацию суспензии сырья до 1 мг / мл с использованием буфера для анализа.
2. С помощью анализа Dye-релиз для определения оптимального инкубационного условия для белка антимикробной
   1. Развести запас белка антимикробной суспензии до 100 нг / мкл. Такая концентрация дает автофокусInal реакционную массу на 1 мкг белка на объем (10 мкл) добавляют в реакционную смесь для анализа.
   2. Определить диапазон рабочих температур, чтобы быть оценены на предмет бактериолитического белка. Термический диапазон в этих анализах включены 5 ° C, 15 ° C, 25 ° C, 35 ° C, 45 ° C, 55 ° C и 65 ° C.
   3. Выполнение анализов реакции в 0,5 мл микроцентрифужных труб. Для каждого теплового состояния, добавить 10 мкл белка фондовой к 200 мкл подготовленной суспензией субстрата.
   4. Выдержите в амплификатор в течение 8 часов при перемешивании с помощью инверсии один раз в час.
   5. После инкубации, купировать реакцию путем добавления 25 мкл этанола.
   6. Удалить непереваренные, нерастворимые подложки путем центрифугирования при 3000 х г в течение 2 мин, и передать 150 мкл реакционной смеси супернатанта для каждой реакционной смеси до 96-луночные плоскодонные микропланшеты, следя за тем, чтобы не нарушать осадок непереваренной субстрата.
   7. Мера ферментативную активность белка AntimicrobМВЛ для данного субстрата путем определения количества растворимого БОР красителя отделено от подложки после ферментативного гидролиза. Для количественной оценки ферментативной активности, измеряют поглощение супернатанта при 595 нм с использованием микропланшет-спектрофотометра. Увеличение оптической плотности с помощью растворимого красителя выпущен в супернатант из меченого субстрата представляет собой количественное измерение ферментативной активности.
      Примечание: Изменение оптической плотности представлено единицах активности (АС), где 1 результатов AU в 0,01 увеличение оптической плотности реакционной супернатанта красителя высвобождения при длине волны 595 нм. Пустое реакция, инкубировали со всеми компонентами реакции, за исключением фермента, используется для вычитания любой краситель, который высвобождает из БОР-меченого субстрата за счет инкубации. Оптимальная температура ферментативная обеспечивает пиковую единицу измерения активности.
   8. Повторите шаги 4.2.1 через 4.2.7 с использованием различных инкубационных буферов, чтобы определить оптимальные условия для буферных антимикробного фермента. В тHESE анализы, используют PBS.
3. С помощью анализа Dye-релиз для определения минимальной концентрации активного при температуре Оптимальная Инкубационный для белка антимикробной
   1. Произвести серийное разведение акций антимикробной суспензией белка с использованием буфера для анализа. Диапазон серии разведений будет изменяться в зависимости от активности антимикробного фермента. Серийное разведение, используемые в этих анализах получают окончательный анализ количества белка от 0 пг, 10 пг, 100 пг, 1 нг, 10 нг, 100 нг, 1 мкг и 10 мкг.
   2. Выполнение каждой реакции, был в 48-луночных плоскодонных микропланшет. Для каждого условия анализа, добавьте 10 мкл соответствующей белковой суспензии до 200 мкл подготовленной суспензией субстрата. Отрегулировать любое изменение объема белкового раствора добавляют в реакционную смесь до 10 мкл с использованием реакционного буфера.
   3. Уплотнение микропланшет с пластиной уплотнительной пленкой, чтобы избежать изменения объема вследствие испарения. Выдержите в шейкере инкубаторе при определенной оптимальной втемпература cubation для данного белка противомикробного в течение 16 часов при встряхивании.
   4. После инкубации остановить реакцию добавлением 25 мкл этанола в каждую лунку и удалить непереваренные подложку центрифугированием при 3000 х г в течение 2 мин.
   5. Передача 150 мкл реакционной супернатанта для каждой реакционной смеси в 96-луночные плоскодонные микропланшеты, следя за тем, чтобы не нарушать осадок из непереваренной субстрата.
   6. Для количественной оценки ферментативной активности, измеряют поглощение супернатанта при 595 нм с использованием микропланшет-спектрофотометра. Пустое реакция, инкубировали со всеми компонентами реакции, за исключением фермента, используется для вычитания любой краситель, который высвобождает из БОР-меченого субстрата за счет инкубации. Увеличение оптической плотности с помощью растворимого красителя выпущен в супернатант из меченого субстрата обеспечивает количественную меру для ферментативной активности.
      Примечание: Изменение оптической плотности представлено единицах активности (АС), где 1 AU результаты в0,01 увеличение оптической плотности реакционной супернатанта краситель высвобождения при длине волны 595 нм.

Результаты

Анализ диффузии и предметное стекло количественный анализ красителя высвобождения являются эффективными методами скрининга и измерения первоначальных исследований новых белковых препаратов. Каждый метод имеет свои преимущества и недостатки; Однако, когда выполняется в сочетании, они позволяют быстро первоначальный отбор и основную характеристику противомикробного.

Диффузионный анализ позволяет эффективно предметное стекло для быстрого скрининга микробных библиотек, получения белковых препаратов. Когда уровни концентрации фермента вызывает беспокойство, чувствительность обнаружения ограничений может ограничить анализ, требующий большего количества фермента, чтобы быть добавлены в реакционную лунку, чем анализом на красителе высвобождением. Как показано на фиг.1, качественные свойства анализа позволяют наблюдателю сравнивать относительные количества присутствующего фермента в каждую лунку.

фиг 1А (25 мкг фермента), передний край зоны отображает мутный или неполную лизис подложки, в то время как зона ближе всего к колодцу отображает более полный лизис субстрата. Это явление, продукт концентрации уменьшающейся диффундирующего фермента на переднем крае, затрудняет точное измерение диаметра зоны. Поскольку колодцы B (15 мкг), С (10 мкг), D (5 мкг), Е (1,0 мкг), и F (0,1 мкг) , наблюдаемых на рисунке 1, диаметр зоны полного лизиса рассеивает до исчезновения коррелируют с пониженным количеством фермента. Для выполнения условия F (0,1 мкг), концентрация фермента в агарозы находится ниже предела, который позволит диффундирующая фермент визуализироваться, как она движется через агарозы, гидролизовать субстрат. Анализ диффузии также предметное стекло работать с использованием очищенных Сенная палочка peptidoglycan в качестве субстрата (рисунок 2). В то время как зона менее рельефное , чем наблюдаемые с цельноклеточной сальмонелла энтерика в связи с нежеланием пептидогликана равномерно приостановить агарозы, гидролиз пептидогликана неизвестным антимикробного фермента очевидна.

Анализ красителя релиз является более чувствительным и универсальным, чем анализ анализа диффузии предметное стекло, что позволяет более низкий предел обнаружения и изменение факторов внешней среды, влияющих на ферментативную реакцию. В представительных анализах, температура варьировалась для определения оптимальной температуры для антимикробного фермента, определено , что 35 ° С в PBS (рисунок 3). Этот оптимум хорошо видно в супернатантах реакции , как повышенные количества синего цвета (рисунок 3б), а также представлены в единицах активности , полученные из измерений оптической плотности при длине волны 595 нм (фиг.3А).Универсальность анализа красителя релиз позволяет исследователю варьировать не только температуру, но и буфер реакции и буферных компонентов быстро определить оптимальные условия инкубации для данного фермента.

Уровень активности неизвестного антимикробного фермента (рисунок 4) и альфа-химотрипсина фермента управления (рисунок 5) были измерены в определенной оптимальной температуре инкубации 35 ° С в PBS против БОР-меченого Сенная палочка убитых нагреванием субстрата. Сопоставление результатов из фиг.4 и 5 указывает на то, что неизвестный антимикробный фермент имеет почти в два раза сродство к B. Сенная субстрат. Кроме того, α-химотрипсин управления не полностью переваривают убитых нагреванием B. зиЫШз субстрат внутри скважины (данные не показаны). Активность альфа-химотрипсина управления начинает пластиныAu около 0,3 мкг по сравнению с продолжающимся ростом единицах активности во всех количествах фермента для неизвестной антимикробного фермента (рис 4 и рисунок 5). Это может означать , что неизвестный фермент обладает большей активностью устойчивой или что существует большее число сайтов расщепления доступны для фермента в пределах B. Сенная субстрат.

Рисунок 1:. Фермент Активность против сальмонелла энтерика Цельноклеточные субстрата Анализ диффузии предметное стекло использовали качественно оценить активность неизвестного белка противомикробного против убитых нагреванием сальмонелла энтерика подвида enterica (АТСС 10708).. Белковые массы, которые были добавлены в соответствующие лунки неизвестной антимикробного подвешенной в фосфатно-солевом буфере (PBS)слайды включали 25 мкг (хорошо А), 15 мкг (а Б), 10 мкг (хорошо С), 5 мкг (хорошо D), 1 мкг (хорошо Е), и 0,1 мкг (хорошо F). одни ФБР, используют для отрицательного контроля этих анализов. Зоны лизиса были обследованы после 6 часов инкубации. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рис . 2: Фермент Активность против Сенная палочка пептидогликана клеточной стенки Анализ диффузии использовали предметное стекло качественно оценить активность неизвестного белка противомикробного против пептидогликана Bacillus зиЫШз 168. Суспендировали в 20 мкл PBS, 10 мкг неизвестного антимикробного добавляли к хорошо А к microslides. одна PBS, был использован в качестве отрицательногоуправления для анализа (хорошо B). Зона лизиса изображался после 6-часовой инкубации при 37 ° C. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3:. Оптимальная температура реакции для белка Противомикробное Универсальность анализа красителя релиз позволяет изменять физико-химических параметров, таких как температура инкубации и буферов, чтобы определить их влияние на активность фермента , представляющего интерес ^6. Как показано на этом рисунке, активность неизвестного белка противомикробного (1 мкг) оценивали в PBS против БОР-меченых убитых нагреванием Сенная палочка при диапазоне температур инкубации. Отображается как единицах активности (АС) в (А), абсорбция БОР-бкруглый вырез продукты выпущен в супернатант после гидролиза измеряли при длине волны 595 нм с использованием микропланшет-спектрофотометра. При каждом температурном режиме, реакции без добавления фермента были использованы для вычитания влияния релизных красителя, который в результате инкубации при различных температурах. Супернатанты реакции , соответствующие каждой температуры инкубации были обследованы до измерения оптической плотности (B). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4:. Диапазон активности для белка Противомикробное Диапазон активности неизвестного белка противомикробного измеряли в качестве единиц активности после того, как в течение ночи инкубирования в течение 0, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 и 1000 нг , как измерено BCA PROTEin анализ (А). Для этих реакций БОР-меченых Б. уровень субстрат зиЫШз был увеличен , чтобы дать оптическую плотность 5,0 при 595 нм , чтобы гарантировать , что реакция с наибольшим количеством фермента (1000 нг) не полностью гидролизовать субстрат всю доступную в течение периода реакции инкубации. Контрольные реакции без добавления фермента были использованы для вычитания влияния релизных красителя, вызванного только инкубирования. Супернатанты реакции , соответствующие каждому количеству фермента были обследованы до измерения оптической плотности (B). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рис . 5: Диапазон активности для a-химотрипсин Диапазон активности для альфа-химотрипсина измеряли как экИты единиц После ночного инкубирования в течение 0, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, и 1000 нг фермента (A). Для этих реакций БОР-меченых Б. уровень субстрат зиЫШз был увеличен , чтобы дать оптическую плотность 5,0 при 595 нм , чтобы гарантировать , что реакция с наибольшим количеством фермента (1000 нг) не полностью гидролизовать субстрат всю доступную в течение периода реакции инкубации. Контрольные реакции без добавления фермента были использованы для вычитания влияния релизных красителя, вызванного только инкубирования. Супернатанты реакции , соответствующие каждому количеству фермента были обследованы до измерения оптической плотности (B). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Обсуждение

Анализ диффузии и предметное стекло анализа красителя высвобождения обеспечивают преимущества для обнаружения и характеризации ранее неопознанных белковых препаратов. Эти быстрые и чувствительные методы позволяют с высокой пропускной скрининг библиотек организма источником для идентификации представляющих интерес ферментов до инвестирования большие исследовательские ресурсы. Как идентифицируются высокий профиль целевого ферменты, вариации анализов обнаружения можно использовать для быстрого обнаружения фермента или для определения биохимических свойств фермента. Например, во время многоступенчатой ​​схемы очистки белков, анализ диффузии может быстро предметное стекло обнаружить фракции, содержащие интерес фермент. Кроме того, реакция Optima для фермента может быть определена путем изменения буферов реакции и температуру инкубации в анализе красителем высвобождением.

Диапазон фермента массы, необходимой для обнаружения в анализе диффузии предметное стекло является функцией фермента characteriStics. Обнаружение ограничения анализа в целом требуют использования больших количеств фермента, чем анализом на красителе высвобождением. В данном исследовании сравнение пределов чувствительности анализа диффузии (рис предметное стекло 1) в анализе красителя релиз (рисунок 4) показано , что анализ диффузии является предметное стекло менее чувствительным , чем метод анализа красителя высвобождения. Когда концентрация фермента не является проблемой, анализ позволяет предметное стекло быстрого первоначального скрининга библиотек для производства белковых противомикробных препаратов против целевых субстратов с низкой рабочей силы и оборудования требованиям. Несмотря на то, что требует больше усилий и оборудования, анализ красителем высвобождением является более чувствительным и воспроизводимым, что дает количественные результаты, которые можно было провести сравнение между красителем высвобождением анализов тех же самых или различных ферментов на данной подложке. Эти два метода легко выполняются в большинстве микробиологических лабораторий без необходимости узкоспециализированных приборов. В представитивные анализы, контроль фермент, α-химотрипсин, был обнаружен в количествах , как низко как 100 нг (рисунок 5) с использованием анализа красителя высвобождения, в то время как минимальное количество обнаружено в анализе диффузии предметное стекло было 1 мкг (данные не показаны).

Обеспечение полезности в качестве реакции на обнаружение качественного антимикробных ферментов, ряд вариаций анализа диффузии было зарегистрировано ^11,13. При рассмотрении этих анализов, анализ диффузии был разработан предметное стекло для его относительно высокой чувствительности в качестве начального экрана и для его легкости реакции соблюдения. Модифицированный от работы Lachica и др. ^11, в котором использовались агарозы накладками для обнаружения производства нуклеаз штаммов золотистого стафилококка, диффузия анализа предметное стекло работает аналогично радиальному способу ¹⁴ иммунодиффузии , как белок диффундирует из хорошо в агарозы, содержащей субстрат. Радиальная immunodiffuМетод Sion останавливает расширение зоны иммунопреципитации, когда система достигает равновесия образования комплекса между диффундирующего антигеном и антителом в агарозы. В отличие от этого, субстрат анализа диффузии предметное стекло вначале переварены диффундирующего белка противомикробного в постоянно расширяющейся зоне лизиса окружающих скважину. Растущий диаметр зоны продолжается до тех пор фермент теряет активность или субстрат истощена. Скорость производства зоны лизиса оживлены, как чистота, и таким образом удельной активностью, фермента или концентрация фермента добавляли к увеличению скважины.

Для количественной оценки ферментативной активности белка противомикробных против убитых нагреванием B. Сенная, был выбран анализ красителя релиз. Колориметрические анализы с использованием Remazol бриллиантовый синий R краситель (БОР) меченные субстраты позволяют разностороннее и чувствительную оценку белка противомикробного деятельноти. Ферментативный гидролиз БОР-меченых субстрата приводит к высвобождению растворимых синих продуктов, которые можно легко измерить с помощью спектрофотометра при длине волны 595 нм. Несколько вариантов анализа красителя высвобождения БОР, разработанные, чтобы охарактеризовать другие белковые антимикробные ферменты, показать гибкость этого анализа для применения с другими субстратами. Например, при определении влияния лизостафина бактериолитическим активности, Чжоу, и др., Сообщили анализ красителем высвобождения с использованием БОР окрашенного стафилококковые клетки и стафилококковый пептидогликана в качестве подложки ^12. В модифицированном варианте применения данного анализа красителя высвобождения БОР, БОР-меченых Micrococcus Шеиз субстрат был предложен для использования в качестве быстрых и чувствительных средств для диагностики и экран для таких заболеваний, как бактериальные инфекции и наличие злокачественной карциномы, которая может коррелировать с уровнями экспрессии лизоцим человека в сыворотке крови ^15. Кроме того, БОР-меченые бактериальные клеточные субстраты имеютLSO был использован в методе zymogram для обнаружения лизоцима ^16.

Мы демонстрируем пониженный предел обнаружения, удобство и воспроизводимость анализа красителя релиз, что позволяет для быстрого скрининга библиотек для производства ферментов. Модификации анализа позволяют для последующих количественных биохимических характеристик анализов, в том числе воздействия температуры, рН и солености, а также воздействия других протеолитических ферментов на активность антимикробных белков ^6. Кроме того, количественный анализ красителем высвобождения может быть использована для сравнения деятельности нескольких ферментов для данного субстрата. Анализ красителя релиз БОР сообщила полезность для ферментов с активностью в отношении полисахаридов в дополнение к характеристике и детекции белка антимикробных агентов. Петерсон и Eriksson сообщили метод количественного обнаружения endoglycanase активности с использованием аморфных, БОР-крашеные полисахаридные шарики из целлюлозы, ксилана, маннан и читав ^17. В расширении этих выводов, чувствительный метод для обнаружения хитиназе ферментов , продуцируемых Bacillus Thuringiensis Bt-107 был разработан с использованием коллоидного хитина , меченного БОР ^18. Из этих и других исследований, коммерчески доступные источники БОР окрашенного субстратов появились для использования при выявлении гликолитического активности, в том числе против кератина, амилопектин, амилоза, гликоген, ламинарина, D-ксилана, азо-ячменного глюкана, и крахмал.

В данном исследовании мы показали полезность анализа красителя релиз в формате микропланшетов, уменьшая объем БОР-меченого субстрата и фермента, необходимого для получения колориметрического результата. Как показано на фиг.4 и 5, микропланшет анализ красителем высвобождением обеспечивает более низкий предел обнаружения , чем диффузионный анализа для обнаружения предметное стекло ферментативной активности. Что касается быстрого использования, сохранения труда и простоты интерпретации, микрофонroslide анализ диффузии обеспечивает применение в начальных экранах с высокой пропускной способностью на наличие антимикробной активности, а также указанием антимикробной присутствия белка в нижнем течении изоляции белка и очистки шагов. Сочетание этих двух анализов дополняют друг друга в первоначальном скрининге и конечной характеристика новых белковых противомикробных

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
48-луночный микропланшет с плоским дном и крышкой с низким уровнем испарения	Becton Dickinson	3078
96-луночный микропланшет с плоским дном (Costar 3595)	Corning, Inc.	3595
агарозный	Fisher Scientific	BP162-100
α-химотрипсин	MP Biomedicals	215227205
Bacillus subtilis 168	American Type Culture Collection	23857
C1000 Touch Thermal Cycler	Bio-Rad
пробковый точильщик	Humboldt	H-9661
лизоцим	Sigma-Aldrich	L6876-1G
Стандарт эквивалентности McFarland (2.0)	Микрослайды Fisher Scientific	R20412
	Fisher Scientific	22-38-103
питательный бульон	Fisher Scientific	S25959B
пептидогликан Bacillus subtilis 168	Sigma-Aldrich	69554-10MG-F
фосфатно-солевой буфер (1x)	Teknova	P0200
Pierce BCA Protein Assay Kit	Life Technologies	23227
Synergy HT микропланшетный спектрофотометр	BioTek Instruments, Inc.
Ремазол бриллиантовый синий R краситель (RBB)	Sigma-Aldrich	R8001
Salmonella enterica subsp. enterica	American Type Culture Collection	10708
азид	натрия Fisher	Scientific S227-100
гидроксид натрия (NaOH)	Fisher	Scientific S318-500
Titer Tops предварительно нарезанная клейкая полиэтиленовая пленка	Диверсифицированная биотехнология	T-TOPS-50
Ультрачистая дистиллированная вода	Invitrogen	10977-015
Название	Company	Номер в каталоге	Комментарии
Solution
раствор агарозы 50 мл PBS 0,25 г агарозы			Добавьте 10% азид натрия в расплавленный PBS/раствор агарозы
питательный бульон средь 4 г питательного бульона 500 мл воды
250 мМ раствор гидроксида натрия (NaOH) 1 г NaOH 99 мл воды
типа I200 мМ Ремазол блестящий синий R краситель (RBB) 1,25 г RBB 98,75 мл 250 мМ раствор