Механизм регулирования адипоцитов числа в взрослом организме через дифференциацию и Апоптоз гомеостаза

Согласно отчету 2014 года от Всемирной организации здравоохранения, 39% взрослого населения мира имеет избыточный вес, а 13% страдают ожирением ^1. В ближайшее время, люди с избыточным весом будет включать в себя значительную часть населения пожилого возраста. Важной особенностью ожирения и старения является нарушение регуляции жира по отношению к заболеваемости и смертности ^2. Адипокины, белки , секретируемые жировой ткани (АТ), может вызвать метаболические синдромы , такие как ожирение и диабет типа 2 ^3. Болезни обмена веществ , в основном вызвано чрезмерным накоплением энергии в липидной капли адипоцитов, что приводит при расширении ^4. Поэтому представляет интерес для определения причин и молекулярных механизмов расширения АТ для того, чтобы найти возможности для борьбы с ней.

Избыточное питание приводит к расширению AT, который регулируется двумя событиями: чрезмерное накопление энергии в липидные капли адипоцитов, процессчто приводит к гипертрофии (увеличение размера адипоцитов), и увеличение липогенез, также известный как адипоцитов гиперплазии ^5. Адипогенезом представляет собой процесс дифференциации мезенхимальных стволовых клеток (МСК) в адипоциты. Во-первых, MSCs перерасти в преадипоциты во время фазы действия обязательств. Во- вторых, преадипоциты дальнейшей дифференциации приобретать черты зрелых и функциональных адипоцитов ^6. Несколько факторов транскрипции были определены в качестве основных регуляторов для определения преадипоцитов, таких как цинк палец белка 423 (Zfp423) и фактор клеток раннего B 1 (Ebf1). В то время как Zfp423 вызывает раннее принятие окончательного решения , Ebf1 требуется для генерации адипоцитов клетки - предшественники ^6. Терминальная дифференцировка жестко контролируется транскрипционный каскад, в результате чего пероксисом γ рецептора активатора пролиферации (PPAR & gamma) является существенным фактором транскрипции ^7. Другие ключевые транскрипционные факторы являются CCAAT / энхансер-связывающий белок (CЧлены семьи / EBP) (т.е., C / EBPα, C / EBPβ и C / EBPδ), Kruppel подобные факторы (KLFs), цАМФ реагировать элемент - связывающий белок (CREB) и раннего реагирования на рост 20 (Krox20) ^6.

В последнее время было показано , что семейство активатором протеин-1 (AP-1) участвует в адипоциты процесса дифференцировки ^8,9. Семейство АР-1 образована димерных белкового комплекса, состоящего из Fos, Jun и / или активации фактора транскрипции (ATF) членов. Фос связанных с антигеном 1 и 2 (Фра-1 и Фра-2) способны регулировать дифференциацию адипоцитов. Fra-1 снижает дифференциацию адипоцитов путем ингибирования C / EBPα ^8, в то время как Fra-2 управляет адипоцитов оборота ^9. Fra-2, таким образом, не только уменьшает количество адипоцитов, подавляя экспрессию PPARγ2 во время дифференцировки адипоцитов, но и уменьшает адипоцитов апоптоз посредством прямой репрессии гипоксия-индуцируемый факторов экспрессии (HIFs). Семейство HIF является НЕТЕrodimeric фактор транскрипции комплекс, состоящий из HIF-1, HIF-2Л и HIF-1. Гетеродимеры состоят из чувствительных к кислороду HIF-альфа белок (HIF-1 или HIF-2 & alpha ; ) и кислород нечувствительны HIF-1β субъединицей ^10. Во время нормоксии, HIF-α белки являются поли-ubiquitinylated и окончательно деградирует протеасомами ^11. не в условиях гипоксии, происходящих в AT во время расширения, HIF-α белки больше не гидроксилированного. Таким образом, они становятся стабилизированные и образуют димеры с конститутивно выраженной HIF-1. Транскрипционной активации генов , контролируемых элементов отклика HIF участвует в регуляции ангиогенеза, обмена веществ и воспаления ^12. В самом деле, HIF-1α способствует при дисфункции путем индукции толерантности к глюкозе, ингибируя расходование энергии и периферическое использование липидов, а также за счет увеличения уровня лептина и ВЧУ индуцированную жировая дистрофия печени ^13. Кроме того, HIF-1α регулирует adipocyт.е апоптоз в естественных условиях и в пробирке ^9.

Настоящий протокол описывает методы для изучения состояния AT распутывать молекулярные характеристики адипоцитов гомеостаза у взрослых мышей. Он показывает , как апоптоз, пролиферацию и дифференцировку адипоцитов в естественных условиях и в пробирке можно регулировать с помощью гипоксии. Для этого мы используем мышей с адипоцитов конкретным удалением Fra-2 генерируемой путем скрещивания мышей , несущих Fra-2 floxed аллели с Fabp4-CreERT мышей ^9. При использовании Fabp4-CRE мышей ERT, удаление является адипоцитов конкретным и индуцируется тамоксифена инъекции ^14. Для модели взрослого, внутрибрюшинной инъекции тамоксифен выполняются в течение 5 последовательных дней, начиная с возраста 6 недель. Таким образом, мыши подвергаются нормальной диеты или с высоким содержанием жиров в течение 6 недель до того, как анализ завершен. Мыши, используемые в данном исследовании, были мужского пола на основе на фоне C57BL6, чтобы избежать женских гормонов, таких как эстрогены, Показано, регулирует распределение жира в организме ^15. Использование другого генетического фона может также изменить метаболический фенотип, из - за деформации , связанные с различиями в управлении липида ^16.

Этот протокол показывает , как анализировать AT в условиях гипоксии с использованием гистологии и как количественно адипоцитов апоптоз, пролиферацию и дифференцировку в естественных условиях с использованием иммуногистохимии и ген анализирует профилирование. Исследование завершается экспериментами в пробирке, показывая , как анализировать первичную дифференцировку адипоцитов и апоптоз измененную под воздействием гипоксии.

ЭТИКА ЗАЯВЛЕНИЕ: Животные размещаются в стандартных условиях следующих руководящих принципов Закона об охране животных немецком. Животных кормили стандартной диете и воды вволю и выдерживают с 12 ч день / ночь цикла. Все эксперименты с животными разрешено местным комитетом по этике.

1. В Vivo анализа адипоцитов гомеостаза у взрослых мужчин

1. Для количественной оценки гипоксию в естественных условиях, в первую очередь определить массу тела мышей, а затем вводят 60 мг / кг массы тела твердого pimonidazole гидрохлорида внутрибрюшинно (например: вводят 1,5 мг в 25 г мыши). Pimonidazole является эффективным гипоксическая маркер, который образует аддукты с тиоловыми группами белков, пептидов и аминокислот и обнаруживается с помощью специфического антитела.
2. Жертвоприношение мышей и удалить perigonadal жира колодки (Рисунок 1).
   1. 45 мин после инъекции, принести в жертву мышей CO ₂ удушья и последующее цервикальной дислокации. </ Li>
   2. Придавить конечности мышей (как показано на рисунке 1) и откройте брюшную полость. Снимите левую и правую perigonadal (придатка) жировой ткани внутри брюшной полости.
      Примечание: жировое связаны с придатке по перитонеальных листочков , как показано на рисунке 1 (perigonadal жира колодки обозначены стрелками).
   3. Позаботьтесь, чтобы удалить гонадных ткани из жировой ткани. Определение веса жира площадку для расчета соотношения: жира веса колодки (г) на массу тела (г).

Рисунок 1: Местонахождение perigonadal жировым в брюшной полости мышей. Изображение локализации perigonadal жира у взрослых мышей после жертвоприношения. Perigonadal жира колодки обозначены стрелками. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы VIEW большую версию этой фигуры.

3. Для того, чтобы составить количественный профиль экспрессии генов, использовать один perigonadal жировой ткани для выделения РНК. Примечание: пока ткань не будет обработан, хранить образцы ткани в РНК растворе стабилизации при -80 & deg; C или в жидком азоте.
   1. Для гомогенизации жировой ткани, добавить жировой ткани к 1 мл однофазного раствора гуанидинизотиоцианата и фенола. Используйте пробирки, содержащие керамические шарики (1,4 мм), чтобы сокрушить ткани в гомогенизаторе при 6500 оборотах в минуту (2 раза 20 сек, 30 сек паузы).
   2. Изолировать РНК следующим образом (метод одноступенчатый по Chomczynski и Sacchi ^17).
      1. Для разделения фаз, передавать гомогенизированный жир колодки для микроцентрифужных трубки, добавляют 0,2 мл объема хлороформа, встряхивают в течение 15 секунд, инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре и центрифугировать 12000 х г в течение 5 мин. Перенести верхнюю водную фазу (около 400 мкл), который содержит РНК, в новую пробирку микроцентрифужных. Не включайте ДНК-содержатИНГ интерфазная или фазы фенолом белоксодержащий.
      2. Для осаждения РНК, добавляют 1 объем изопропилового спирта, перемешивают и инкубируют в течение 15 мин при 4 ° С (это также можно инкубировать при температуре -20 ° С в течение ночи). Центрифуга при 12000 х г в течение 10 мин. Удалить изопропиловым супернатант тщательно. Промыть дважды с 75% -ным этанолом с центрифугами шагом 12000 мкг в течение 10 мин.
      3. После высушивания осажденную РНК в течение приблизительно 10 мин при комнатной температуре, растворяют его в 50 мкл H ₂ O (РНКазы). Чтобы облегчить это, инкубировать в течение 2 мин при 65 ° С.
         Примечание: Хранить РНК в 75% -ном этаноле при температуре -80 & deg; C или в жидком азоте в течение длительного хранения.
      4. Количественно препараты РНК A _260/280 (оптимальное частное от 1,8 до 2,2) и вычислить концентрацию по _260:
         
   3. Для того, чтобы избежать загрязнения ДНК, переваривают 1 мкг препарата РНКс 1 U ДНКазы I в течение 30 мин при 37 ° С в объеме 10 мкл. Деактивировать при 65 ° С в течение 10 мин.
      Примечание: Этот шаг не является обязательным.
   4. Используйте 10 мкл препарата РНК, содержащей 1 мкг РНК для реакции обратной транскриптазы, чтобы генерировать одноцепочечную кДНК, пригодный для применения количественного ПЦР. Компоненты и их количества приведены в таблице 1.
   5. Используйте PCR Master Mix для количественного реального времени реакции ПЦР. Для того, чтобы определить , метаболические изменения во всей жировой ткани, используют специфические праймеры для генов , участвующих в AT гомеостаза (таблица 2) и условия ПЦР , перечисленных в таблице 3.
   6. В режиме реального времени для анализа данных ПЦР.
      1. Определение базовой линии (рисунок 2), нормально цикл от 1 до 15, где нет никаких изменений в флуоресцентных сигналов. В режиме реального времени программное обеспечение ПЦР нормализует специфические сигналы флуоресценции к исходной флуоресценции и к внутреннему опорному красителя, ROX, в результате чеговеличина конкретных сигналов с помощью праймеров, дельта Rn (ΔRn).
      2. Установите порог в экспоненциальной фазе кривой амплификации. Пересечение определяет пороговый цикл (Ct). На основе значения КТ, вычислить относительное выражение (& Delta; CТ) и изменение раза (ΔΔCt):
         
         

Таблица 1: Компоненты с соответствующим объемом для обратной реакции транскриптазы , чтобы генерировать одноцепочечную кДНК.

Таблица 2: Список генов с последовательностью соответствующих праймеров , используемых для анализа адипоцитов гомеостаза.

Таблица 3: ПЦР в реальном времени условия.

Рис . 2: Характеристики реального времени кривой ПЦР - амплификации Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

4. Для выполнения гистологического анализа адипоцитов гомеостаза, используйте второй perigonadal жировой ткани. Не пересушивает ткани!
   1. Закрепить жировой ткани в 3,7% PBS-буферном растворе формальдегида в течение ночи, встраивать в парафин (следуйте инструкциям , как описано в другом месте ¹⁸⁾ и разрезают внедренный ткани в 2-5 мкм толщиной секций (максимум 5 мкм).
   2. Определить количество адипоцитов в поле и размер адипоцитов в ярко-поле микроскопа после гематоксилином и эозином (H & E) окрашиванием: <ол>
   3. Deparaffinize секции промыванием 3 раза в течение 5 мин в ксилоле и повторно гидратировать секция 2 раза в течение 2 мин в 100% этаноле и 2 раза в течение 2 мин в 96% -ном этаноле. Наконец, промойте участок в дистиллированной H ₂ O в течение 5 мин.
   4. Пятно гематоксилином, разводили 1: 5 дистиллированной H ₂ O, в течение 10 мин при комнатной температуре и моют в H ₂ O в течение 5 мин. Пятно с раствором эозина (20 мл 5% -ного эозина Y / 210 мл дистиллированной H ₂ O / 25 мкл лед ной уксусной кислоты) в течение 30 секунд и снова промывали H ₂ O в течение 5 мин.
   5. Высушить частей с помощью 96% -ного этилового спирта и 100% этанола в 2 раза каждый в течение 2 мин и ксилол 3 раза в течение 5 мин. Установите секции с безводным монтажном агентом.
   6. Оценка секций под светлого поля микроскопа. Показательным примером того , как анализировать адипоцитов с ImageJ 1.48v ¹⁹ показан на рис. 3: число клеток на квадратный метр (мкм ^2), площадь клеток (× 10 ³ мкм ²
   7. Откройте изображение секции с ImageJ 1.48v. Если параметры изображения указываются в пикселях вместо единицы длины, изменить масштаб.
   8. Выберите * прямая линия * в панели инструментов и настроить линию на известном расстоянии ссылкой на масштабной линейки. Перейти к Анализировать -> Set Scale Расстояние от линии отображается в пикселях;. добавить известное расстояние и единицу длины, например, мкм. Подтвердите с помощью OK. Размер картины и анализ параметров указаны в единицах длины заданной.
   9. Для определения параметров адипоцитов, отрегулируйте порог. Перейти к Image -> Adjust -> Threshold , чтобы открыть окно Threshold. Выберите следующие параметры: способ сегментации: по умолчанию; Threshold цвет: B & W; Цветовое пространство: HSB. Картина теперь отображается в черно-белом. НастроитьЯркость , чтобы очистить белые адипоциты и закрыть черные межклеточные пространства, как показано на рис. 3b.
   10. Подсчитайте количество адипоцитов на ² мкм (рис 3e) с * многоточечной * выбор в панели инструментов и отметьте каждую ячейку для подсчета.
   11. Для определения размера адипоцитов, выберите * прямая линия * снова на панели инструментов и нарисуйте диаметр адипоцитов (рис 3в). Перейти к Анализировать -> Measure и появится новое окно, с длиной диаметра в мкм.
   12. Для определения площади адипоцитов, выберите * Wand (трассировка) инструмент * и щелкните внутри адипоцитов. Внутренняя стенка адипоците выбран красным цветом (Рис 3). Перейти к Анализировать -> Измерение и появится новое окно, с областью этого адипоцитов в мкм ^2.

Рис . 3: Анализ адипоцитов характеристик в жировых секциях колодки Раздел картины perigonadal жировое самцов мышей , получавших с высоким содержанием жиров (HFD) или нормальной диеты (ND) с ярко-поле микроскопа (а); порог устанавливается в черно-белый (б) и размер адипоцитов (длина, в) количественно с ImageJ 1.48v, область (D) и адипоцитов количество клеток на мм ² (е).F = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53822/53822fig3large.jpg" целевых = "_blank"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Таблица 4: Антитела с соответствующим разбавлением используется для иммуногистохимического окрашивания срезов AT.

Таблица 5: Вторичные антитела с разбавлением , используемые для иммуногистохимического окрашивания.

2. Экстракорпоральное Анализ адипоцитов гомеостаза под влиянием гипоксией

1. Жертвоприношение мышей и удаления подкожной жировой ткани.
   1. Жертвоприношение мышей СО ₂ удушья и последующим смещением шейных позвонков.
   2. Придавить конечности мышей , как показано на рисунке 4. Отделить кожу от верхней части ноги, поясницы и фланг и придавить это с иглами , как на рисунке 4. Затем удалите подкожной жировой ткани, которая расположена кзади у основания задние ноги, окружающие паховые лимфатические узлы (как показано на рисунке 4, слева: подкожный жировой тканиы показано стрелками; справа: паховых лимфатических узлов показано стрелкой).

Рисунок 4: Расположение подкожных жировых отложений. Изображение подкожной жировой ткани; левые стрелки указывают на подкожный жировой ткани и правая стрелка указывает на паховых лимфатических узлов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

2. Isolate полученные из жировой ткани стволовые клетки (ADSC) , как описано ранее ^20.
3. Семенной ADSC 4000 клеток / см ² в Дульбекко, модифицированной Игла среднего Хэма F-12 с добавлением 10% нормальной сыворотки теленка, 1% пенициллина / стрептомицина, 0,5% амфотерицина В, 16 мкМ биотина, 18 мкМ пантотеновой кислоты и 100 мкМ аскорбиновой кислоты и растут культуры до слияния около 70 до 80%, Которая достигается после 4-х до 6 дней культивирования.
4. Побудить Adipogenic дифференциацию.
   1. Удалите прилипший ADSC с поверхности путем обработки трипсином.
      1. Удалить среду, промывают PBS и добавляют 0,025% раствора трипсина (предварительно нагретый до 37 ° С) в течение 2 мин (до тех пор, пока клетки не отделяются от поверхности). Немедленно добавьте средних и мыть клетки.
   2. Граф клеток с помощью камеры Нейбауера.
      1. Поместите стеклянную крышку на центральной площади камеры Neubauer. Развести клеточной суспензии в соотношении 1:10 и загружают в камеру с 10 мкл разбавленных клеточной суспензии. Граф клеток в 4-х квадратов, расположенных в углах, каждый из которых состоит из 16 маленьких квадратов. Подсчитать количество клеток на мл:
         
   3. Семенной ADSC (как это описано в пункте 2.2) в 12-луночные культуральные планшеты и выращивать культуру до слияния около 70 до 80% (достигается после 4-х до 6-ти дней).
   4. Побудить adipogeНИК дифференцировки путем добавления 5 мкг / мл инсулина, 1 мкМ дексаметазон и 5 мкМ 3-изобутил-1-метилксантина (ИБМК) к культурам. Заменить среду каждые 2 дня. Клетки будут полностью дифференцированы через 7 дней.
5. Для анализа Adipogenic дифференциации, пятно с масляным красным O, который окрашивает триглицериды зрелых адипоцитов.
   Примечание: Работа должна выполняться под вытяжкой!
   1. Удалите среду, вымыть адипоциты осторожно PBS и фиксации клеток в течение 60 мин с 2 мл 10% -ного формалина.
   2. Для того, чтобы приготовить раствор масла окрашивания Красный O, смешайте 3 части исходного раствора O - красного масла (300 мг масла красного цвета O порошка , растворенного в 100 мл 99% -ного раствора изопропанола) с 2 -х частей дистиллированной Н ₂ O и инкубировать в течение 10 мин при комнатной температуре. Фильтр рабочего раствора масла Красный O через нагнетательные фильтр 0,2 мкм.
      Примечание: Рабочий раствор стабилен в течение 2 часов.
   3. Для окрашивания масла Red O, удалите формалина, моют адипоцитов с H ₂
   4. Оценка пластины под фазового контрастного микроскопа с 100-кратным увеличением. Липиды адипоцитов будет выглядеть красным, а ядра будут появляться синий.
6. Необязательный шаг: Silence интересующего гена путем трансфекции с shRNA.
   1. Изменение среды и добавьте бессывороточной среды.
   2. Для трансфекции адипоцитов, используют липофекцию. Следуйте инструкциям производителя и использовать 1 мкг shRNA на пластинах ткани 12-а. После добавления липидной-ДНК-комплекса, инкубировать адипоциты в течение 48 ч при 37 ° С.
7. Для анализа адипоциты, подвергнутых гипоксии, использовать гипоксического рабочую станцию ​​или гипоксического инкубатор для поддержания клеток в условиях гипоксии. В зависимости от исследования, гипоксия сульд быть 0,5, 1 или 2% кислорода.
   1. Анализировать апоптоз FITC-меченого аннексина V и последующей проточной цитометрии анализов.
      1. Соберите адипоцитов с дополнительным мягким клеточным скребком, промывают PBS и добавляют 1 × 10 ⁶ клеток в 100 мкл аннексина V-связывающего буфера (10 мМ Hepes / NaOH, рН 7,4, 140 мМ NaCl, 2,5 мМ CaCl _2). Добавьте количество аннексина V-FITC, рекомендованные производителем и инкубировать при комнатной температуре в течение 15 мин.
      2. Для проточной цитометрии измерения, добавьте 200 мкл буфера аннексина V-связывания и 1 мкМ ядерной контрастирующая. Определить флуоресценцию в зеленом и фиолетовом канале. Аннексина V ⁺ / ядерный контрастное ⁺ клетки определяются как вторичные некротические и аннексина V ⁺ / ядерный контрастное ^- клетки определяются как апоптотических клеток (рисунок 5).
   2. Количественно анализ уровня РНК адипоцитов для определения гомеостаза в условиях гипоксии.
      1. Добавить1 мл однофазный раствор гуанидинизотиоцианата и фенола в каждую лунку и изолируют РНК [ с использованием метода пошагового по Chomczynski и Sacchi ¹⁷ (этап 1.3.2)] и продолжить , как на этапах 1.3.2.1) до 1.3.5.2) ,

Рисунок 5: Adipocyte анализ апоптоза методом проточной цитометрии. Dot сюжет презентации FACS для аннексина V-FITC и TO-PRO-3 окрашивание адипоцитов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Мы покажем , как определить адипоцитов гомеостаза в естественных условиях и в пробирке , используя пример Fra-2 эт / фл Fabp4-CreERT мышей по сравнению с однопометные дикого типа. Наш протокол определяет, как повышенная экспрессия HIF гипоксией коррелирует с адипоцитов дисфункции, как показано увеличением адипоцитов апоптоза.

Увеличение размера адипоцитов и области в высоким содержанием жиров (HFD) обработанных мышей

Избыточное питание, наряду с другими факторами, приводит к гипертрофии адипоцитов, вызванное чрезмерным накоплением энергии в липидных капель. Размер адипоцитов и область является показателем гипертрофии. Разделы жировой ткани от нормального (ND; Рисунок 6а) и с высоким содержанием жиров (HFD, рисунок 6б) мышей, а также количественными от размера адипоцитов и области ясно показывают адипоцитов гипертрофия после 6 неделье годы HFD, что указывает увеличенный размер адипоцитов в HFD обработанных мышей (рис 6с и г).

Увеличение гипоксия в жировой ткани (AT) взрослых Фра-2 фл / фл Fabp4-CreERT мышей приводит к повышению уровня HIF-1 и адипоцитов апоптоза

Для определения состояния в естественных условиях гипоксии в AT, Fra-2 эт / фл мышей Fabp4-CreERT анализируются через 6 недель после того, как Фра-2 удаления в возрасте 12 недель и по сравнению с однопометные дикого типа. Pimonidazole вводят мышам внутрибрюшинно в качестве эффективного гипоксией маркера; он не токсичен и способен распределять в AT. Гипоксических адипоциты в AT в естественных условиях определяются иммуногистохимического окрашивания антителами (рис 7а). Кроме того, повышенный статус гипоксическая АТ у мышей сопровождается увеличением HIF-1 положительной ADIPocytes как обозначено иммуногистохимического окрашивания Рисунок 7b), что подтверждается количественной оценки уровней экспрессии HIF-1α и его цели генов 9. Кроме того, TUNEL , окрашивание срезов при температурах от Fra-2 эт / фл Fabp4-CreERT мышей и Однопометники управления (фиг.7С) показывает , что увеличение адипоцитов апоптоз коррелирует с наличием гипоксии и HIF-1α экспрессии.

Увеличение HIF-1α экспрессию в первичных адипоцитов через гипоксия индуцированных адипоцитов апоптоза

Для анализа адипоцитов апоптоз в лабораторных условиях , мы используем адипоциты , сгенерированные из подкожной жировой ткани , как описано в другом месте 20. Как и ожидалось, HIF-1α выражение в адипоцитах увеличивается после того, как 24 ч гипоксией (рис 8а). Для дальнейшего анализа HIF-1α деятельности, уровни РНК мишени HIFгены , такие как Inos (индуцибельной синтазы оксида азота) количественно КПЦР. Рисунок 8b показывает , что повышенная экспрессия HIF-1 в условиях гипоксии приводит к повышению уровня Inos мРНК. Так как мы уже показали в естественных условиях (рисунок 8) , что увеличение HIF-1α выражение в адипоциты коррелирует с повышенной адипоцитов апоптоза, апоптоза также количественно в культурах в пробирке путем аннексина V окрашивания в условиях гипоксии. В соответствии с данными в естественных условиях (рисунок 7), повышенный уровень HIF-1α сопровождается усилением адипоцитов апоптоза , индуцированный гипоксических условиях (рис 8b). Более того, чтобы доказать, что гипоксическая-индуцированный апоптоз является HIF-зависимой; HIF-1α или HIF-2α замолчать с помощью РНК-интерференции в адипоцитах, полученных из дикого типа или Fra-2 дефицитных мышей. Увеличение адипоцитов апоптоз восстанавливается глушителей HIF-1 или HIF-2Л, как показано аннексином V окрашивание на рисунке 8b, доказывая , что датчик гипоксия HIF-α регулирует адипоцитов апоптоз.

Рисунок 6: Увеличение размера адипоцитов и области в с высоким содержанием жиров (HFD) мышей (а, б) H & E окрашивание срезов от perigonadal жировой ткани самцов мышей дикого типа , которых кормили нормальной диеты (ND) (а) или высокий. -fat диета (HFD) (б) в течение 6 недель. Полосы представляют 500 мкм. (С, d) количественными размера адипоцитов (с) и области (d) от perigonadal жировой ткани мышей дикого типа , получавших ND (а) или HFD (б) в течение 6 недель. N = 10. Данные приведены в виде среднего значения ± SEM. Статистический анализ проводился с использованием Student's т -TEST. *** Р <0,0001.: //www.jove.com/files/ftp_upload/53822/53822fig6large.jpg "Целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 7: Повышение уровня HIF-1α и апоптоз в адипоцитах взрослых от Fra-2 эт / эт мышей Fabp4-CreERT. Гипоксия (а) и HIF-1α (б) окрашивание в AT мужской Fra-2 фл / фл Fabp4-creERT мышей и Однопометники мужчина из контрольной группы через 6 недель после инъекции тамоксифена. Увеличение 20X, 40X вставки. Черные стрелки указывают на гипоксические области и HIF-1α положительных клеток. (С) TUNEL окрашивание в Fra-2 эт / фл Fabp4-CreERT мышей и Однопометники контроль через 6 недель после инъекции тамоксифена. Увеличение 20X, 40X вставки. Черные стрелки указывают на TUNEL-положительных клеток. Эта цифра была изменена от Лютера и дри др. 9. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 8:. Увеличение HIF-1α экспрессии и адипоцитов апоптоз в первичных адипоцитов , индуцированных гипоксией (а) ПЦР в реальном времени анализ HIF-1 и целевых HIFs уровней Inos мРНК в первичных адипоцитов , помещенных в гипоксических камерах проанализированы в указанные моменты времени. (Б) Количественное апоптоза аннексина V FACS окрашивания в первичных адипоцитов , выделенных из Fra-2 эт / фл мышей Fabp4-CreERT или контрольных мышей дикого типа , трансфицированные с контролем ш или ш плазмиды против HIF-1 или HIF-2Л и помещенные в условиях гипоксии (1% O 2) в течение 24 ч. Эта цифра была изменена от Лютера и др. t- критерия Стьюдента. * P <0,05 и ** P <0,01 были приняты в качестве значимой. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Авторы не имеют ничего раскрывать.