Эффективная и высокая Метод Выход для выделения мышиных дендритных клеток подмножествах

Summary

Различные субпопуляции дендритных клеток существуют как редкие популяции в лимфоидных органах, и поэтому их трудно выделить в достаточном количестве и чистоте для иммунологических экспериментов. В данной работе мы описываем высокоэффективный и высокопродуктивный метод выделения всех известных в настоящее время основных подмножеств дендритных клеток селезенки мышей.

Abstract

Дендритные клетки (ДК) являются профессиональными антиген-представляющих клеток, прежде всего, ответственные за сбора, обработки и представления антигенов на антиген-представляющих молекул для инициирования Т-клеточного иммунитета. Дендритные клетки могут быть разделены на несколько фенотипически и функционально разнородных подмножеств. Три важных подмножества селезеночных дендритных клеток плазмоцитов, CD8α ^Pos и CD8α ^Neg клетки. В плазмоцитов бездисковые натуральные производители типа интерферона и имеют важное значение для противовирусного Т-клеточного иммунитета. Подмножество CD8α ^отр DC специализирован для MHC класса II презентации антигена и центрально участвует в грунтования CD4 Т - клеток. CD8α ^Pos контроллеры домена в первую очередь ответственны за кросс-презентации экзогенных антигенов и клеток грунтования CD8 Т. В CD8α ^Pos РС были продемонстрированы наиболее эффективным на презентации антигенов гликолипидов молекулами CD1d специализированному Т CELл население известный как инвариант естественных киллеров Т (iNKT) клеток. Введение Flt-3 лиганд увеличивает частоту миграции дендритных клеток-предшественников клеток из костного мозга, в конечном счете, приводит к расширению дендритных клеток в периферических лимфоидных органах в мышиных моделях. Мы адаптировали эту модель , чтобы очистить большое количество функциональных дендритных клеток для использования в экспериментах по передаче клеток для сравнения знания в естественных условиях различных подмножеств DC.

Introduction

Дендритные клетки (ДК) были обнаружены почти сорок лет назад как "большой звездчатые (греческий дендрон) клетка" находится в лимфоидных органах ^1. Многие исследования показали , что контроллеры домена являются единственными антиген - представляющих клеток , которые могут эффективно стимулировать наивные Т - клетки ^2. Основная функция этих клеток является поглощение и презентацию антигенов и их эффективную обработку и загрузку их на антиген-представляющих молекул. В селезенке мыши, контроллеры домена могут быть разделены на плазмоцитов и обычных подмножеств. В плазмоцитов ДК характеризуются низкой экспрессии CD11c и высоких уровней B220 и Gr-1. Они также являются позитивными для поверхностного маркера mPDCA1 и секретируют типа интерферона в ответ на Толл-подобные рецепторы 9 (TLR9) лигандов. Обычные контроллеры домена являются высокими для CD11c и экспрессии МНС класса II. Они могут быть разделены на три отдельные подмножества на основе поверхностной экспрессии фенотипических маркеров, таких как CD4, CD8α, DEC205, компакт-диск11b и дендритных клеток ингибирующий рецептор 2 (DCIR2, распознается антителом 33D1) белки ^3,4. В CD8α ^Pos контроллеры домена также известны как cDC1, являются позитивными для DEC205, но отрицательный результат для миелоидных маркеров , таких как CD11b и 33D1. CD8α ^отр контроллеры домена, называемый также Cdc2, являются положительными для 33D1, CD11b и CD4 , но не имеют DEC205. Двойное отрицание подмножество (т.е. отрицательный как для CD4 и CD8α) относительно редко, и является негативной для DEC205 и 33D1. Это наименее отличающееся подмножество и может быть менее дифференцированными форма CD8α ^Neg DC.

Фенотипические различия в различных подмножеств DC также распространяются на их функции в естественных условиях. CD8α ^отр контроллеры домена обладают высокой фагоцитарной и , как полагают , чтобы представить экзогенный антиген в основном через МНС класса II к CD4 Т - клеток ^3. В противоположность этому , CD8α ^Pos контроллеры домена специализированы для представления растворимого белкового антигена на MHC класса Iв механизме называется кросс-презентации. Результаты перекрестной презентации зависит от состояния активации этих контроллеров домена ^5, и может привести либо к расширению цитотоксических Т - клеток (CTL) или развитие регуляторных Т - клеток , ^{6 2,7.} Нацеливание антигена CD8α ^Pos ГЦ с использованием анти-DEC205-антителоопосредуемый результатами доставки в основном к удалению Т - клеток , ^8, в то время как презентация антигенов , полученных из инфицированных апоптотических клеток индуцирует сильный CTL - ответ ^9.

В дополнение к признанию пептидных антигенов, иммунной системы млекопитающих эволюционировала распознавать липидный и гликолипидов антигены. Эти антигены представлены молекулами CD1, которые являются MHC класса I, как белки клеточной поверхности, которые существуют в нескольких связанных форм в различных млекопитающих. У мышей, один тип высококонсервативной молекулы CD1 называется CD1d отвечает за представление гликолипида антигенов ^10. Основным популяция Т-клеток, которые распознают CD1d / гликолипидов комплексы называют инвариантными клетки НКТ (iNKT клетки). Эти клетки экспрессируют полуинвариантом Т - клеточного рецептора (TCR) , состоящий из инвариантной TCRα цепи, которая в паре с TCR & beta ; цепи , которые имеют ограниченное разнообразие ^11. В отличие от обычных Т - клеток , которые должны размножаться и дифференцироваться , чтобы стать активированные эффекторные Т - клетки, клетки iNKT существуют как эффекторной популяции и начинают быстро отвечать на запросы после введения гликолипидов ^12. Идентификация физиологически соответствующих липидный антигенпрезентирующих клеток является активной областью исследований, а также несколько различных типов клеток, таких как В-клетки, макрофаги и ДК было предложено выполнить эту функцию. Тем не менее, было показано , что CD8α ^Pos подмножество ГЦ является первичной ячейкой опосредовать поглощение и представление липидных антигенов мыши iNKT клетки ¹³ и гликолипидов опосредованного перекрестного примирования CD8 Т - клеток ^14.

ove_content "> Для сравнения эффективности презентации антигена с помощью различных антиген-представляющих клеток, простой подход состоит в передаче различных типов очищенных АРС импульсными с эквивалентными количествами антигена в наивных хозяев. Эксперименты клеточного переноса этого типа часто выполняются для иммунологических исследований. Тем не менее, проведение исследований переноса с экс виво антиген обработанного ГЦ является сложной задачей, так как эти клетки существуют как редкие популяции в лимфоидных органах , где они составляют менее 2% от общего количества клеток ^15. поэтому необходимо усилить развитие этих клеток в животных - доноров для повышения эффективности протоколов изоляции.

Известно , что общий лимфоидной и миелоидной общие клетки - предшественники, которые необходимы для генерации Pdc, CD8 и ^Pos подмножеств CD8 ^отр DC, экспресс - FMS связанных с рецепторной тирозинкиназы 3 (Flt-3). При в естественных условиях Flt-3 лиганд (Flt-3L) введение, emigratион Flt-3 , экспрессирующих клеток - предшественников костного мозга увеличивается, что приводит к увеличению обсеменения периферических лимфоидных органах и расширение их зрелого потомстве DC ^16. Выражение FLT-3 теряется во время приверженности B, T или NK путей дифференцировки клеток. Таким образом, лишь минимальные изменения наблюдаются в этих клетках при введении Flt-3L. Подобное расширение в популяциях постоянного тока наблюдается у мышей , несущих опухоли путем имплантации клеточной линии В16-меланома , секретирующих мышиный FLT-3L, который обеспечивает простой и экономичный способ обеспечения устойчивые системные уровни FLT-3L ^17,18. Используя этот подход, мы разработали протокол, основанный на имплантации B16-клеток меланомы, секретирующих Flt-3L, чтобы стимулировать расширение всех нормальных подмножеств DC в селезенке мышей, тем самым значительно увеличивая урожаи этих клеток, которые могут быть выделены для последующих экспериментов , Мы последовательно находим, что в течение 10 - 14 дней после подкожного внутримышечноплантация опухоли, секретирующие Flt-3, мыши развивают спленомегалия с выраженным обогащением контроллеров домена составлять 40 - 60% от общего количества клеток селезенки. Из этих селезенке, различные подмножества DC могут быть выделены с высокой степенью чистоты с использованием стандартных коммерчески доступных наборов очистки клеток, которые используют подмножество специфических фенотипических маркеров.

Protocol

Эксперименты на животных проводятся в соответствии с утвержденными руководящими принципами от институционального ухода за животными и использования комитета (IACUC). Все процедуры, требующие стерильности выполняются в кабинете биологической безопасности.

1. Имплантация B16.Flt3L Меланома у мышей

1. Культура Flt-3 экспрессирующих меланомы В16 линию клеток в колбы Т25 для культуры ткани при плотности 0,5 × 10 ⁶ клеток / мл в полной среде DMEM с добавлением 10% СО ₂ при 37 ° С. Расти, пока клетки не достигают ~ 90% слияния (~ 20 ч).
2. Сбора клеток путем усвоением трипсина. Аспирируйте среды для культивирования клеток и мыть прилипшие клетки с PBS. Добавьте 5 мл 0,05% трипсина и инкубировали в течение 5 мин при 37 ° С. Добавить холодную 20 мл полной среды DMEM (4 ° С), содержащую фетальной телячьей сыворотки (FCS), чтобы погасить перевариванию протеазы. Поднимите клетки от легким постукиванием с последующим осторожно пипеткой вверх и вниз.
3. Собирают клетки центрифугированием при 300XG в течение 10 мин при температуре 4 ° С. Граф клеток с использованием гемоцитометра или автоматического счетчика жизнеспособности клеток. Ресуспендируют до плотности 10 ⁸ клеток / мл в PBS.
4. Имплантаты мышей (C57BL / 6 или другой гистосовместимого штамм) с опухолевыми клетками путем подкожной инъекции , как описано Machholz и др. , ¹⁹ у основания шеи с помощью 100 мкл суспензии клеток (10 ⁷ клеток).
5. Разрешить опухоль расти до осязаемых или видимых (2 - 10 мм в диаметре, обычно 7 - 12 дней) перед жертвоприношением животных для извлечения органов.

2. Получение селезеночной одноклеточной суспензии от опухоли мышей, несущих

1. Обезболить мышей с передозировкой изофлуран (отрегулировать скорость потока изофлуран к> 5% и по-прежнему экспозиции по крайней мере, через 2 мин после остановки дыхания). Жертвуют Flt-3 опухоли меланома мыши подшипника шейки дислокации в соответствии с ведомственным руководящим принципам для эвтаназии.
2. диsinfect кожу с 70% этанола и урожая селезенки с использованием асептической техники с помощью стерильных ножниц ^20.
3. Поместите селезенку в стерильную чашку Петри для транспортировки в шкафу биологической безопасности. Выполните все шаги от здесь в стерильных условиях.
4. Передача селезенку в свежую чашку Петри и промывают RPMI средой. Вырезать селезенку на мелкие (~ 0,2 см ²⁾ части , используя скальпель. Инкубировать в течение 30 мин при температуре 37 ° С с 10 мл коллагеназы / ДНКазы раствора.
5. Налейте частично переваренной суспензии ткани селезенки на клеточный фильтр 70 мкм. Сжать оставшиеся фрагменты ткани через сетку сетчатого фильтра с помощью шприца 5 мл.
6. Промыть сетчатый фильтр с 10 мл свежей среды и выбросить фильтр. Центрифуга суспензии при 300 х г в течение 10 мин при 4 ° С для осаждения клеток.
7. Аспирируйте супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 2 мл буфера для лизиса эритроцитов. Инкубировать при RT Fили 10 мин. Гасят буфер для лизиса эритроцитов путем добавления 10 мл полной среды RPMI.
8. Гранул клетки центрифугированием при 300 х г в течение 5 мин при температуре 4 ° С. Ресуспендируют в соответствующем объеме для достижения плотности клеток 10 ⁸ клеток / мл в буфере сортировки клеток (например, MACS) , содержащей 20 мкг / мл Fc-блока антитела (2.4G2).

3. Очистка плазмоцитов, контроллеры домена CD8α ^Pos ГЦ и CD8α ^Neg контроллеры домена от селезеночной одноклеточной суспензии

Примечание: Выделение селезеночной подмножеств DC от одной клеточной суспензии является процедура многоступенчатая , как показано на рисунке 1 Выполните все шаги с использованием предварительно охлажденного буфера и водяной бане лед для поддержания температуры на 4 - 8 ° C.. Все объемы реагента в следующем разделе протокола рассчитаны на первоначальный ввод 200 мкл суспензии клеток селезенки в 10 ⁸ клеток / мл). Это может быть увеличен илипонижаться в зависимости от Вашей потребности путем изменения объема клеточной суспензии (всегда при плотности 1 х 10 ⁸ клеток / мл) и другие реагенты пропорционально на начальном этапе (3.1.1 и 3.2.1). Отрегулируйте объемы реагентов во всех последующих этапах соответственно. Например, если , начиная с 100 мкл суспензии клеток селезенки при напряжении 1 х 10 ⁸ / мл, используют половину объемов реагентов , указанных на всех этапах.

1. Выделение плазмоцитов контроллеров домена (PDC)
   1. Добавьте 300 мкл меченных биотином коктейль антител можно найти в комплекте изоляции плазмоцитов DC к 200 мкл суспензии клеток селезенки.
   2. Тщательно перемешать и инкубировать на водяной бане со льдом в течение 15 мин. Нажмите пробирку каждые 3 мин, чтобы держать клетки приостановленных и максимизировать связывание антитела.
   3. Добавить 12 мл буфера сортировки клеток и осаждения клеток центрифугированием при 300 х г в течение 5 мин при 4 ° C. Отберите супернатант для удаления несвязанных биотинилированных антител.
   4. Ресуспендируют клеткиосадок в 500 мкл буфера для сортировки клеток. Добавьте 300 мкл анти-биотин антитела конъюгированные с бусинами. Повторите шаг 3.1.2 и 3.1.3.
   5. Удалите супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 2 мл буфера сортировки клеток. Выполните все шаги, начиная с этого момента при комнатной температуре с использованием предварительно охлажденный буферов.
   6. Поместите свежий магнитный активированный сортировки клеток колонку LS в магнитном стенде. Промыть и уравновешивают колонку с 5 мл буфера сортировки клеток.
   7. Пипетировать клеточной суспензии на колонку, применяя его осторожно к центру поверхности слоя колонны. Собирают поток через.
   8. Промыть колонку с 10 мл буфера сортировки клеток. Собирают этот поток через и объединить с потоком через с этапа 3.1.7. В PDCs обогащены в этом потоке через колонку (FT1).
   9. Гранул клетки из FT1 центрифугированием при 300 х г в течение 5 мин при температуре 4 ° С, в Ресуспендируют 2 буфере сортировочного мл клеток и проходят клетки через свежий колонки LSповторяя шаги 3.1.6 - 3.1.8. Это использование двух последовательных колонках дает повышенную чистоту изолированных клеток.
   10. Гранул клетки центрифугированием при 300 х г в течение 5 мин при 4 ° С и ресуспендируют с 2 мл полной RPMI. Место на льду, пока не понадобится.
2. Выделение CD8α ^Pos и CD8α ^Neg ГЦ
   Примечание: Первым шагом в этой процедуре является истощение B, Pdc, Т и NK-клеток.
   1. Начиная со всей суспензии клеток селезенки (1 мл 10 ⁸ клеток / мл , полученной на стадии 2.8), добавляют 100 мкл биотин-конъюгированные смесь антител можно найти в комплекте изоляции CD8α ^Поз DC.
   2. Хорошо перемешать и инкубировать на водяной бане со льдом в течение 15 мин. Нажмите трубу на мягко через каждые 3 мин, чтобы максимизировать связывание меченного биотином антитела к их клетки-мишени.
   3. Добавить 12 мл буфера сортировки клеток и осаждения клеток центрифугированием при 300 х г в течение 5 мин при 4 ° C. Отберите суперплавучий для удаления несвязанных биотинилированных антител.
   4. Добавьте 150 мкл буфера сортировки клеток и 100 мкл анти-биотин шариков , предусмотренных в комплекте изоляции CD8α ^Pos DC. Хорошо перемешать и инкубировать на водяной бане со льдом в течение 15 мин.
   5. Добавляют 10 мл буфера сортировки клеток и осаждения клеток центрифугированием при 300 х г в течение 5 мин при 4 ° C.
   6. Ресуспендируют клеток в буфере сортировки 1 мл клеток и перейти на свежую колонку LS в соответствии с процедурой, описанной в шагах 3.1.6 через 3.1.8.
   7. Соберите немеченого поток через 2 (FT2) и удалите столбец ретентата. Эта непомеченная фракция обогащена для CD8α ^Pos и CD8α ^Neg контроллеры домена.
   8. Гранул клетки в FT2 центрифугированием при 300 х г в течение 5 мин при температуре 4 ° С.
   9. Ресуспендируют клеток в буфере сортировки 1 мл клеток и добавляют 200 мкл анти-CD8α конъюгированных магнитных шариков можно найти в комплекте изоляции CD8α ^Pos DC.
   10. репседят шаги 3.2.2 через 3.2.6. Поток через колонку обогащена CD8α ^Neg контроллеров домена и обедненного для CD8α ^Pos контроллеров домена. Это помечена поток через 3 (FT3).
   11. Для элюирования CD8α ^Поз контроллеры домена сохраняется в колонке, удалить столбец из магнита, добавляют 5 мл буфера сортировки клеток и очистить матрицу столбцов , используя поршень , снабженный колонки LS.
   12. Гранул клетки центрифугированием при 300 х г в течение 5 мин при температуре 4 ° С. Отберите супернатант и ресуспендируют в буфере сортировки 1 мл клеток. Для повышения чистоты, запустить элюированный клетки снова через свежий колонки LS, повторяя шаги 3.1.6 на 3.1.8, за исключением того, отбросить поток через и собирают нераспределенной клетки как в 3.2.11.
   13. Для очистки CD8α ^Neg контроллеры домена из FT3 подвески, осаждени FT3 центрифугированием при 300 х г в течение 5 мин при 4 ° С и ресуспендируют в 300 мкл буфера для сортировки клеток.
   14. Добавьте 100 мкл анти-CD11c МАГмагнитные шарики. Хорошо перемешать и инкубировать на водяной бане со льдом в течение 15 мин.
   15. Добавить 10 мл буфера сортировки клеток и гранул клетки центрифугированием при 300 х г в течение 5 мин при 4 ° C.
   16. Повторите шаги 3.1.5 через 3.1.8. CD8α ^отр ДК положительно выбраны с CD11c бус и привязаны к колонке. Поток через может быть отброшен.
   17. Элюируйте клетки , сохраняемых в колонке , как описано в шаге 3.2.11 для сбора очищенного CD8α ^Neg ДКБ.

4. Пульсирующий БТРы с антигенами и Cell Transfer

1. Подсчитывают живые клетки после очистки с использованием трипанового синего ²¹ , чтобы отличить живых и мертвых клеток.
2. Инкубируйте клетки с антигеном выбора. Используйте аналоги гликолипида антигена называется альфа-галактозил керамиды (αGalCer) при концентрации 100 нМ ^13. Как правило, пластина 10 ⁶ жизнеспособных клеток / лунку в полной среде RPMI с использованием ультра-низким АТТАКhment U-дном 96-луночные планшеты для минимизации прикрепление клеток. Инкубацию клеток в атмосфере 5% СО ₂ при 37 ° С в течение 1 - 4 ч.
3. Урожай клетки осторожно пипеткой несколько раз. Используйте широкие подсказки отверстие пипетки, чтобы минимизировать повреждения клеток от поперечных сил. Вымойте скважин с PBS и объединить эти промывок, чтобы максимизировать урожай клеток.
4. Гранул клетки при 300 мкг в течение 5 мин при 4 ° С и ресуспендируют до желаемой плотности в PBS. Как правило, вводят 1 миллион клеток в 200 мкл на животного-реципиента. Держите клетки на льду, чтобы максимизировать жизнеспособность перед введением в животных-хозяев.
5. Вводят клетки внутривенно мышам либо через латеральную хвостовую напрасными или ретро-орбитального венозного сплетения ^19. С помощью 27 г иглы на шприц емкостью 1 мл, и вводят максимальный объем 0,1 мл на мышь.

Results

Результатом этой процедуры зависит от расширения подмножеств DC мышиным Flt-3L, выраженной имплантированных клеток меланомы. Опухоль B16.Flt3L была получена из C57BL / 6 мышей, и должны быть имплантированы животным с этим штаммом фон для того, чтобы избежать выхода из строя опухоли укоренились, из-за отказа. В некоторых случаях может быть желательным использование генетически модифицированных мышей для получения ОДК известными дефектами сигнальных путей или рецепторов, представляющих инт...

Discussion

Дендритные клетки принимаются быть основным профессиональным антигенпрезентирующая клеток, участвующих в грунтования Т-клеточных ответов. Их основная функция состоит в обследовании микросреду тканей путем принятия и обработки антигенов для презентации Т-клеткам. Для изучения функции специфических подмножеств DC, они должны быть выделены в достаточном количестве, используя подход, который поддерживает их нормальный фенотип и функции. Большинство протоколов полагаться на изоляцию конкретного подмножества постоянного тока ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,05% Трипсин-ЭДТА	Life Technologies, Gibco	25300-054
Изофлуран	Сигма-Олдрич	CDS019936-250 мг
коллагеназа D	Roche Diagnostics	11088858001
DNase I (сухой порошок)	QIAGEN	79254
200 proof этанол	Thermo Fisher Scientific	9-6705-004-220	Используется для приготовления 70% этанола
для лизиса эритроцитов	Sigma-Aldrich	R7757
RPMI-1640 с L-глутамином	Life Technologies, Gibco	11875-119
DMEM среда с L-глутамином	Life Technologies, Gibco	11995-073
200 мМ L-глутамина	Life Technologies	25030081
заменимые аминокислоты MEM	Life Technologies, Gibco	11140-050
MEM незаменимые аминокислоты	Технологии Жизни	11130-051
&бета;-меркаптоэтанол	Life Technologies, Инвитроген	21985-023
Пируват натрия	Life Technologies	11360-070
HEPES	Life Technologies, Invitrogen	15630
Фосфатный буферный раствор (PBS Ca2+ и Mg2+ свободный pH 7,2)	Life Technologies, Invitrogen	20012-050
Dulbecco' s PBS (DPBS с Ca2+ и Mg2+)	Life Technologies, Gibco	14040-182
0,5 М раствор этилендиаминтетраацетата (ЭДТА)	Life Technologies	15575-020
Бычий сывороточный альбумин (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153
Сыворотка для телят плода	Atlanta Biologicals	S11050
Пенициллин/стрептомицин	Life Technologies, Инвитроген	15140-163
Трипан синий (сухой порошок)	Сигма-Олдрич	T6146-5G	Приготовьте 0,08% с PBS
Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II, мышь	Miltenyi Biotech	130-092-786
Магнитные шарики, конъюгированные с антимышиным CD11c	Милтеньи Биотех	130-152-001
CD8&альфа; Pos комплект для изоляции постоянного тока мыши	Miltenyi Biotech	130-091-169
Антитело, блокирующее Fc-гамма-рецептор (клон 2.4G2)	BD Biosciences	553141
Антимышиный CD11c-FITC	BD Biosciences	553801
Антимышиный CD8α-PerCP	BD Biosciences	553036
Антимышиный B220-PE	BD Biosciences	553090
1 мл шприцы	BD	26048
23 игла G1	Чашки Петри BD	305145
100 мм	Thermo Fisher Scientific	875712
Хирургические инструменты	Kent Scientific	INSMOUSEKIT
Клеточный фильтр (70 & микро; m)	BD	352350
Большие пластины Петри	Thermo Fisher Scientific	FB0875712
(500 мл (0,22 &; m))	Corning	431097
колонки LS	Miltenyi	130-042-401
Магнитный стенд MACS сепаратор	Miltenyi Biotec	130-042-302
Широкоугольный 200 μ l наконечники для пипеток	PerkinElmer	111623
Corning 96-луночные планшеты со сверхнизкой насадкой	Corning	CLS3474-24EA
6-8-недельная самка мышей C57BL/6	Jackson Research Laboratories, Jax
Murine B16.Flt3L клеточная линия			, описанная Mach et al., 2000
сывороточносывороточно DMEM и RPMI media 500 мл DMEM с L-глутамином или 500 мл RPMI-1640 с L-глутамином 5 мл заменимых аминокислот MEM (100x, 10  mM) 5 мл HEPES Buffer (1 M) 5 мл L-глутамин (200  mM) 0,5 мл 2-меркаптоэтанол (5,5 x 10-2 M)			Смешайте все ингредиенты в биобезопасном шкафу с помощью среды DMEM или RPMI в зависимости от ваших потребностей. Фильтр стерилизует фильтрующий материал, пропуская через 0,22 & микро; m вакуумная система фильтрации.
Complete RPMI и DMEM media			Добавьте 50 мл термоинактивированной эмбриональной сыворотки теленка к бессывороточным средам RPMI или DMEM для получения полной среды.
MACS buffer			Добавьте 2 мл 0,5 M EDTA и 10 мл термоинактивированной эмбриональной сыворотки телят к 500 мл фосфатно-солевого буфера (PBS, Ca2+ и Mg2+ Free, pH 7,2) и 2  &микро; г/мл 2,4G2 (антитело Fc-блока).
<сильно>FACS окрашивающий буфер			Растворите азид натрия до 0,05% (0,25 г на 500 мл) в буфере MACS для получения окрашивающего буфера FACS
<сильный>10x Коллагеназа D и ДНКаза 1 стоковый раствор Растворите 1 г коллагеназы D и 0,2 мл запаса ДНКазы 1 (1 мг/мл, 100x) в 20 мл PBS, содержащего Ca2+ и Mg2+ получения раствора примерно 1000-2000 единиц активности коллагеназы на мл.			Этот 10-кратный складской раствор может быть приготовлен заранее и храниться при температуре -20 °°С; C в течение нескольких недель. Разбавьте 1 мл этого с 9 мл RPMI без сыворотки непосредственно перед использованием.