Эффективная и высокая Метод Выход для выделения мышиных дендритных клеток подмножествах

Summary

Различные субпопуляции дендритных клеток существуют как редкие популяции в лимфоидных органах, и поэтому их трудно выделить в достаточном количестве и чистоте для иммунологических экспериментов. В данной работе мы описываем высокоэффективный и высокопродуктивный метод выделения всех известных в настоящее время основных подмножеств дендритных клеток селезенки мышей.

Abstract

Дендритные клетки (ДК) являются профессиональными антиген-представляющих клеток, прежде всего, ответственные за сбора, обработки и представления антигенов на антиген-представляющих молекул для инициирования Т-клеточного иммунитета. Дендритные клетки могут быть разделены на несколько фенотипически и функционально разнородных подмножеств. Три важных подмножества селезеночных дендритных клеток плазмоцитов, CD8α ^Pos и CD8α ^Neg клетки. В плазмоцитов бездисковые натуральные производители типа интерферона и имеют важное значение для противовирусного Т-клеточного иммунитета. Подмножество CD8α ^отр DC специализирован для MHC класса II презентации антигена и центрально участвует в грунтования CD4 Т - клеток. CD8α ^Pos контроллеры домена в первую очередь ответственны за кросс-презентации экзогенных антигенов и клеток грунтования CD8 Т. В CD8α ^Pos РС были продемонстрированы наиболее эффективным на презентации антигенов гликолипидов молекулами CD1d специализированному Т CELл население известный как инвариант естественных киллеров Т (iNKT) клеток. Введение Flt-3 лиганд увеличивает частоту миграции дендритных клеток-предшественников клеток из костного мозга, в конечном счете, приводит к расширению дендритных клеток в периферических лимфоидных органах в мышиных моделях. Мы адаптировали эту модель , чтобы очистить большое количество функциональных дендритных клеток для использования в экспериментах по передаче клеток для сравнения знания в естественных условиях различных подмножеств DC.

Introduction

Дендритные клетки (ДК) были обнаружены почти сорок лет назад как "большой звездчатые (греческий дендрон) клетка" находится в лимфоидных органах ^1. Многие исследования показали , что контроллеры домена являются единственными антиген - представляющих клеток , которые могут эффективно стимулировать наивные Т - клетки ^2. Основная функция этих клеток является поглощение и презентацию антигенов и их эффективную обработку и загрузку их на антиген-представляющих молекул. В селезенке мыши, контроллеры домена могут быть разделены на плазмоцитов и обычных подмножеств. В плазмоцитов ДК характеризуются низкой экспрессии CD11c и высоких уровней B220 ....

Protocol

Эксперименты на животных проводятся в соответствии с утвержденными руководящими принципами от институционального ухода за животными и использования комитета (IACUC). Все процедуры, требующие стерильности выполняются в кабинете биологической безопасности.

1. Имплантация B16.Flt3L Меланома у мышей

1. Культура Flt-3 экспрессирующих меланомы В16 линию клеток в колбы Т25 для культуры ткани при плотности 0,5 × 10 ⁶ клеток / мл в полной среде DMEM с добавлением 10% СО ₂ при 37 ° С. Расти, пока клетки не достигают ~ 90% слияния (~ 20 ч).
2. Сбора клеток путем усвоением трипсина. Аспирируйте среды для культивир....

Results

Результатом этой процедуры зависит от расширения подмножеств DC мышиным Flt-3L, выраженной имплантированных клеток меланомы. Опухоль B16.Flt3L была получена из C57BL / 6 мышей, и должны быть имплантированы животным с этим штаммом фон для того, чтобы избежать выхода из строя опухоли укоренились, из-за отказа. В некоторых случаях может быть желательным использование генетически модифицированных мышей для получения ОДК известными дефектами сигнальных путей или рецепторов, представляющих инт.......

Discussion

Дендритные клетки принимаются быть основным профессиональным антигенпрезентирующая клеток, участвующих в грунтования Т-клеточных ответов. Их основная функция состоит в обследовании микросреду тканей путем принятия и обработки антигенов для презентации Т-клеткам. Для изучения функции специфических подмножеств DC, они должны быть выделены в достаточном количестве, используя подход, который поддерживает их нормальный фенотип и функции. Большинство протоколов полагаться на изоляцию конкретного подмножества постоянного тока .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,05% Трипсин-ЭДТА	Life Technologies, Gibco	25300-054
Изофлуран	Сигма-Олдрич	CDS019936-250 мг
коллагеназа D	Roche Diagnostics	11088858001
DNase I (сухой порошок)	QIAGEN	79254
200 proof этанол	Thermo Fisher Scientific	9-6705-004-220	Используется для приготовления 70% этанола
для лизиса эритроцитов	Sigma-Aldrich	R7757
RPMI-1640 с L-глутамином	Life Technologies, Gibco	11875-119
DMEM среда с L-глутамином	Life Technologies, Gibco	11995-073
200 мМ L-глутамина	Life Technologies	25030081
заменимые аминокислоты MEM	Life Technologies, Gibco	11140-050
MEM незаменимые аминокислоты	Технологии Жизни	11130-051
&бета;-меркаптоэтанол	Life Technologies, Инвитроген	21985-023
Пируват натрия	Life Technologies	11360-070
HEPES	Life Technologies, Invitrogen	15630
Фосфатный буферный раствор (PBS Ca2+ и Mg2+ свободный pH 7,2)	Life Technologies, Invitrogen	20012-050
Dulbecco' s PBS (DPBS с Ca2+ и Mg2+)	Life Technologies, Gibco	14040-182
0,5 М раствор этилендиаминтетраацетата (ЭДТА)	Life Technologies	15575-020
Бычий сывороточный альбумин (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153
Сыворотка для телят плода	Atlanta Biologicals	S11050
Пенициллин/стрептомицин	Life Technologies, Инвитроген	15140-163
Трипан синий (сухой порошок)	Сигма-Олдрич	T6146-5G	Приготовьте 0,08% с PBS
Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit II, мышь	Miltenyi Biotech	130-092-786
Магнитные шарики, конъюгированные с антимышиным CD11c	Милтеньи Биотех	130-152-001
CD8&альфа; Pos комплект для изоляции постоянного тока мыши	Miltenyi Biotech	130-091-169
Антитело, блокирующее Fc-гамма-рецептор (клон 2.4G2)	BD Biosciences	553141
Антимышиный CD11c-FITC	BD Biosciences	553801
Антимышиный CD8α-PerCP	BD Biosciences	553036
Антимышиный B220-PE	BD Biosciences	553090
1 мл шприцы	BD	26048
23 игла G1	Чашки Петри BD	305145
100 мм	Thermo Fisher Scientific	875712
Хирургические инструменты	Kent Scientific	INSMOUSEKIT
Клеточный фильтр (70 & микро; m)	BD	352350
Большие пластины Петри	Thermo Fisher Scientific	FB0875712
(500 мл (0,22 &; m))	Corning	431097
колонки LS	Miltenyi	130-042-401
Магнитный стенд MACS сепаратор	Miltenyi Biotec	130-042-302
Широкоугольный 200 μ l наконечники для пипеток	PerkinElmer	111623
Corning 96-луночные планшеты со сверхнизкой насадкой	Corning	CLS3474-24EA
6-8-недельная самка мышей C57BL/6	Jackson Research Laboratories, Jax
Murine B16.Flt3L клеточная линия			, описанная Mach et al., 2000
сывороточносывороточно DMEM и RPMI media 500 мл DMEM с L-глутамином или 500 мл RPMI-1640 с L-глутамином 5 мл заменимых аминокислот MEM (100x, 10  mM) 5 мл HEPES Buffer (1 M) 5 мл L-глутамин (200  mM) 0,5 мл 2-меркаптоэтанол (5,5 x 10-2 M)			Смешайте все ингредиенты в биобезопасном шкафу с помощью среды DMEM или RPMI в зависимости от ваших потребностей. Фильтр стерилизует фильтрующий материал, пропуская через 0,22 & микро; m вакуумная система фильтрации.
Complete RPMI и DMEM media			Добавьте 50 мл термоинактивированной эмбриональной сыворотки теленка к бессывороточным средам RPMI или DMEM для получения полной среды.
MACS buffer			Добавьте 2 мл 0,5 M EDTA и 10 мл термоинактивированной эмбриональной сыворотки телят к 500 мл фосфатно-солевого буфера (PBS, Ca2+ и Mg2+ Free, pH 7,2) и 2  &микро; г/мл 2,4G2 (антитело Fc-блока).
<сильно>FACS окрашивающий буфер			Растворите азид натрия до 0,05% (0,25 г на 500 мл) в буфере MACS для получения окрашивающего буфера FACS
<сильный>10x Коллагеназа D и ДНКаза 1 стоковый раствор Растворите 1 г коллагеназы D и 0,2 мл запаса ДНКазы 1 (1 мг/мл, 100x) в 20 мл PBS, содержащего Ca2+ и Mg2+ получения раствора примерно 1000-2000 единиц активности коллагеназы на мл.			Этот 10-кратный складской раствор может быть приготовлен заранее и храниться при температуре -20 °°С; C в течение нескольких недель. Разбавьте 1 мл этого с 9 мл RPMI без сыворотки непосредственно перед использованием.