Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

В Vivo щелочной Comet Assay и энзим-модифицированной щелочной Comet Анализ для Измерение разрывов ДНК и окислительный ДНК повреждений в печени крысы

15.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53833

⸱

4 мая 2016 г.

 ,  ,  ,  , 
1Division of Genetic and Molecular Toxicology, US FDA/National Center for Toxicological Research, 2Toxicologic Pathology Associates, US FDA/National Center for Toxicological Research

В этой статье

Краткое содержание

Щелочной анализ комет измеряет разрывы нитей ДНК в эукариотических клетках. Добавляя эндонуклеазу III или стадию расщепления 8-оксогуанин-ДНК-N-гликозилазы человека, анализ может эффективно обнаруживать окислительное повреждение ДНК. Мы описываем методы использования этих анализов для выявления повреждений ДНК в печени крыс.

Аннотация

Невосстановленное повреждение ДНК может привести к генетической нестабильности, что, в свою очередь, может ускорить развитие рака. Поэтому выявление потенциальных повреждающих агентов ДНК важно для защиты здоровья населения. Анализ щелочных комет in vivo, который обнаруживает повреждение ДНК при разрыве цепи, особенно актуален для оценки генотоксической опасности ксенобиотиков, поскольку его ответы отражают абсорбцию in vivo, распределение в тканях, метаболизм и экскрецию (ADME) химических веществ, а также процесс репарации ДНК. По сравнению с другими анализами повреждений ДНК in vivo, анализ является быстрым, чувствительным, наглядным и недорогим, и, преобразуя окислительное повреждение ДНК в разрывы цепи с использованием специфических ферментов репарации, анализ может измерить окислительное повреждение ДНК эффективным и относительно свободным от артефактов способом. Измерение повреждений ДНК с помощью анализа комет может быть выполнено с использованием как острых, так и субхронических токсикологических исследований, а благодаря интеграции анализа комет с другими токсикологическими оценками, анализ отвечает требованиям благополучия животных за счет максимального использования ресурсов животных. Еще одним важным преимуществом анализов является то, что для них требуется лишь небольшое количество клеток, и клетки не обязательно должны быть получены из пролиферирующих клеточных популяций. Анализы также могут быть выполнены с различными образцами человека, полученными от лиц, подвергшихся клиническому или профессиональному воздействию.

Введение

Щелочной метод ДНК-комет измеряет разрывы ДНК на уровне одной клетки. Суспензии отдельных клеток встроены в агарозном на предметное стекло микроскопа и клетки лизируют с образованием нуклеоиды, которые содержат суперспирализована петли ДНК. Электрофорез при рН> 13 приводит к потере суперспирализации в петлях ДНК, содержащих разрывы цепи, с освобожденными нитями ДНК мигрирующие к аноду, создавая кометоподобное структур, которые можно наблюдать с помощью флуоресцентной микроскопии. Фрагментированной ДНК мигрирует из «головы» кометы в «хвост» , на основании размера фрагмента и относительной флуоресценции кометного хвоста по сравнению с полной интенсивностью (голова и хвост) могут быть использованы для количественного определения ДНК поломки 1 , 2. Анализ прост, чувствительный, универсальный, быстрый и относительно недорогой 1. Обнаружение фрагментированной ДНК, вызванное повреждающих ДНК агентов использовали анализ для количественной оценки повреждения ДНК в клетках или изолированных ядер от IndiviДвойные ткани животных, обработанных с потенциально генотоксическому материала (ов). Благодаря своим преимуществам, анализ кометы в естественных условиях рекомендуется в качестве второго естественных условиях генотоксичности анализа в (спаренной с в естественных условиях микроядер анализа) для проведения оценки безопасности продукции в текущей Международной конференции по гармонизации (ICH) 3 и Европейский орган по безопасности пищевых продуктов (EFSA ) 4 нормативным требованиям. В нашей лаборатории, мы использовали анализ для оценки в естественных условиях повреждения ДНК , вызванного пищевых ингредиентов, фармацевтических препаратов и наноматериалов 5-10. Печени крысы, будет использоваться в качестве примера в данном протоколе, но кометы анализ может быть выполнен с другими тканей / органов экспериментальных животных, пока могут быть выделены из тканей интактных одиночных клеток.

Определенные типы повреждений ДНК трудно обнаружить, как разрывы ДНК пряди, не изменяя основной щелочной кометы анализа. В случае окислительного повреждения ДНК, прядь бreaks могут быть созданы при окислительных повреждений в ДНК перевариванием с ремонтными ферментами , такими как человека 8-оксогуанин-ДНК-N-гликозилаза 1 (hOGG1, что создает разрывы в 8-оксогуанина (8-oxoGua) и метил-fapy-гуанин 11. Кроме того , эндонуклеаза III (эндо - III) создает разрывы в основном в окисленных пиримидинов 1. Таким образом, добавление стадии ферментного расщепления делает пробирной специфический и чувствительный способ измерения окислительного повреждения ДНК в естественных условиях 12. при использовании этих анализов, мы показали , ядовито-индуцированного повреждения окислительного ДНК в печени крыс и мышей 6-8 и в сердце крыс 10.

Щелочную комет имеет множество применений в генетической токсикологии и биомониторинга человека: 1) в порядке выполнения в анализе естественных условиях для генотоксинов , определенных чувствительными в пробирке тесты 3,13, 2) для оценки механизмов ксенобиотиков-индуцированного повреждения ДНК во многих тканях 14, 3) , если исследоватьканцерогеном работает с использованием генотоксичен или не-генотоксическую способ действия (МОА) 7, 4) для оценки повреждения ДНК ремонт 15, 5) для изучения заболеваний человека и профессионального облучения 16 и 6) в качестве потенциального скринингового анализа с высокой пропускной способностью для органоспецифический генотоксичность 17.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Этика заявление: Процедуры с участием животных были одобрены Animal Care и использование комитета Institutional (IACUC) в FDA / Национальный центр США по токсикологических исследований с помощью.

Примечание: Дизайн исследования , описанная здесь, на основе протокола , разработанного японским Центром по валидации альтернативных методов (JaCVAM) для их проверки достоверности анализа в естественных условиях грызуны щелочной кометы 18, и далее модифицируется на основании рекомендаций , содержащихся в инструкции ОЭСР TG489 19 ,

1. Подготовка

  1. подготовка слайдов
    1. Растворите регулярные агарозе при 1% (вес / объем) в фосфатном буфере (Са 2+, Mg 2+ и свободный фенол красный свободный) путем нагревания в микроволновой печи.
    2. Поместите расплавленный 1% стандартного раствора агарозы в C водяной бане при 55 ° и уравновешивают температуру с ванной. Dip стекло микроскопа скользит в раствор агарозы, слейте excesS агарозы и протрите заднюю часть слайдов чистой. Поместите слайды прямо на ровной поверхности и позволяют слайды высохнуть при комнатной температуре; хранить слайды в сухом месте.
  2. Приготовление растворов кометы анализа
    1. Готовят 0,5% раствор агарозы с низкой температурой плавления. Растворите легкоплавким агарозы в фосфатном буфере (Ca 2+, Mg 2+, и фенол красный свободный) путем нагревания в микроволновой печи. Хранить раствор при 37-45 ° С во время кометной подготовки слайдов; отбрасывать любые оставшиеся агарозном решение впоследствии.
    2. Подготовка буфера для лизиса. Сделать 100 мМ раствором динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (динатриевой соли ЭДТА, г-н 372,24 г / моль), 2,5 М хлорида натрия (NaCl, г 58,44 г / моль), и 10 мМ трис-гидроксиметил аминометан (Трис-основание, г-н 121,14 г / моль) в очищенной воде, и доведения рН до 10 с помощью 10 н раствора гидроксида натрия (NaOH, г 40 г / моль). В день использования, добавьте Triton X100 и диметилсульфоксид (ДМСО, г-н 78,13 г / моль), к раствору, чтобы достичь окончательной КонцентратИоны 1% и 10%, соответственно, и перемешивают при 4-10 ° С в течение по меньшей мере 30 мин перед использованием.
    3. Сделать свежий буфер фермента в день использования. Готовят раствор, содержащий 40 мМ 2- [4- (2-гидроксиэтил) пиперазин-1-ил] этансульфоновой кислоты (HEPES, г-н 238,3 г / моль), 100 мМ хлорида калия (KCl, г-н 74,55 г / моль), 0,5 мМ динатрия ЭДТА, и 0,2% бычьего сывороточного альбумина (БСА, г-н 66463 г / моль) в очищенной воде. Доводят рН до 8,0 с помощью 10 н раствора гидроксида калия (КОН, 56,1 г / моль). Перемешивают при комнатной температуре и проверить полное растворение перед использованием.
    4. Готовят щелочной раствор буфера, содержащего 300 мМ NaOH и 1 мМ динатриевой соли ЭДТА в очищенной воде. Смесь перемешивают при 4-10 ° С в течение по меньшей мере 30 мин перед использованием. Измерьте рН раствора перед использованием и убедитесь, что рН> 13.
    5. Приготовьте раствор 0,4 М Трис базы в очищенной воде и доведения рН до 7,5 с помощью соляной кислоты (HCl, г-н 36,46). Хранить раствор при 4-10 ° С. Это буфер, нейтрализующий.
    6. Сделать преш мясорубки буфер на день использования. Готовят раствор , содержащий 20 мМ динатриевой соли ЭДТА и 10% ДМСО в Хэнкса сбалансированный солевой раствор (HBSS, Са 2+, Mg 2+ и фенол красный свободный). Храните на льду до использования.
    7. Для приготовления раствора для окрашивания, разбавленные флуоресцентный краситель кислоты маточного раствора нуклеиновой с трис-борат-ЭДТА (КЭ буфере) в соотношении 1: 10000 (об / об). Защищайте раствор от света с помощью алюминиевой фольги. Хранить при температуре 2-8 ° C и использовать с 24 ч.

2. Подготовка одноклеточных суспензий из печени крысы

  1. Эвтаназии крыс с СО 2 газа следующих способов , рекомендуемых в медицинских Руководства Американской Ветеринарной для эвтаназии животных: 2013 20 -го издания.
    1. Установить расход CO 2 при 2,75. Поместите крысу в эвтаназии камере (например, эксикатор сосуд, клетка крысы с вентилируемым крышкой) и включите CO 2, открыв вентиль баллона. Подождите, от 1,5 до 2,5 мин до моментакрыса теряет сознание. Увеличение потока СО 2 к его максимальному. После прекращения дыхания, оставьте крыс в камере в течение приблизительно 1 мин, чтобы обеспечить эвтаназию. Проверьте эвтаназию пальпацией, чтобы подтвердить, что крыса не имеет сердцебиение, и зажимая пальцами ног, чтобы определить, что крыса не снимает свою конечность.
  2. Лечить волосого шкуру с 70% этанола. Откройте брюшной полости и удалить интактной печени с хирургическими ножницами. После удаления печени, снимите левую боковую лопасть из оставшейся печени с хирургическими ножницами. Поместите левую боковую лопасть на разделочной доске, и вырезать два смежных 3-4 мм толщиной поперечные срезы с помощью одноразового однолезвийные лезвие бритвы.
  3. Поместите один поперечный разрез на фильтровальную бумагу (для предотвращения скручивания секции), и поместите секцию в 10% нейтральный забуференный формалин (НСБ). Убедитесь, что соотношение 10% NBF в ткани составляет 10: 1 или больше. Через некоторое время фиксации, по меньшей мере, 72 ч, ProcESS печень для гистопатологии (смотри раздел 7, ниже).
  4. Поместите второй поперечный разрез печени в 5 мл охлажденного льдом буфера мясорубки (раздел 1.2.6) в чашке Петри 6 см и прополоскать 3 раза, чтобы удалить остатки крови.
  5. Перенести раздел печени в новую 2 мл центрифужную пробирку, содержащую 1 мл охлажденного льдом буфера мясорубки. Фарш хорошо промытый секцию печени с парой тонких ножниц, чтобы освободить клетки. Процедите клеточной суспензии через сито 40 клеток мкм для удаления комков ткани.
  6. Поместите одноклеточной суспензии на льду и используют для изготовления слайдов в течение 1 часа. Проверьте концентрацию клеток путем подсчета (например, с помощью гемоцитометра или электронного счетчика клеток) , чтобы гарантировать , что его концентрация составляет около 2 x10 6 клеток / мл.

3. Подготовка кометы Слайды

  1. Смешайте один объем одноклеточной суспензии с 10 объемами расплавлен, 37 ° С, 0,5% раствор агарозы с низкой плавления (раздел 1.2.1).Немедленно пипеткой 100 мкл на слайд с покрытием регулярной точкой плавления агарозы (раздел 1.1). Сразу же место покровное стекло над клеточно-агарозы смеси. Сделать по крайней мере 8 слайдов для каждого образца.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все слайды должны быть идентифицированы с помощью ряда или аналогичного кода и их идентичность записаны, так что слайды могут быть забит слепым методом (см 6.2.2, ниже).
  2. Положите слайды плоские и охлаждают до 4 ° С в течение 30 мин.
  3. После того, как гель затвердеет, осторожно снимите крышку слипы и погрузить слайды в предварительно охлажденном буфере для лизиса (раздел 1.2.2). Защита слайды от света и сохранить слайды в буфере для лизиса при температуре 4 ° С от 1 часа (минимум) до O / N (максимум).

4. Обработка энзимами кометы Слайды

  1. Удалить 6 из 8 слайдов, приготовленных из каждого образца ткани из буфера для лизиса и промойте их 3 раза в течение 5 мин каждый с ферментом буфера (раздел 1.2.3) при комнатной температуре. Используйте оставшиеся два слайда для щелочной кометы анализа шез фермент лечение (см 5.1, ниже). После промывки, удаления избытка жидкости путем слива и промокания слайды с тканями.
  2. Развести запасы фермента hOGG1 и Эндо III с буфером фермента в соотношении 1: 1000 (об / об). Поместите на льду до использования.
  3. Применить 200 мкл следующих растворов к слайдам, приготовленных из каждой группы обработки: 200 мкл только ферментного буфера (2 слайдов, используемых в качестве эталонных слайдов), 200 мкл раствора hOGG1 (2 слайда) или 200 мкл Эндо раствора III (2 горки).
  4. Поместите слайды в чашках Петри, покрытые увлажненной бумажные полотенца, покрывают слайдам с помощью Parafilm, и инкубируют при температуре 37 ° С в течение 45 мин для Эндо III обработанных и контрольных слайдов и 30 мин для hOGG1 обработанных слайдами.
  5. После инкубации промойте слайды с дистиллированной водой и продолжить обработку, как описано в 5.2, ниже.

5. разматывать и электрофорез

  1. Для горок не обрабатывают ферментами, удалите слайды из буфера для лизисаСлить слайды и прополоскать один раз холодным нейтрализующего буфера (раздел 1.2.5), в течение 5 мин для удаления остатков моющего средства и соли.
  2. Место слайды из шагов 4.5 и 5.1 случайным образом в горизонтальной гель-электрофореза бак, избегая каких-либо пробелов. Залить в бак с свежеприготовленный рН> 13 буфер для электрофореза (раздел 1.2.4), пока уровень жидкости не только покрывает слайды (избежать пузырей над агарозы и убедитесь, что бак уровень). Записывают буфера рН и температуры в начале раскручивания ДНК.
  3. Пусть слайды остаются в буфере щелочную в течение 20 мин, чтобы позволить раскручиванию ДНК и экспрессии щелочно-ответственного повреждения.
  4. Во время разматывания, программа питания для производства 0,7 В / см в электрофорез резервуаре (V / см = вольты, деленное на расстояние в см между положительными и отрицательными электродами).
  5. После того, как раскручивание, нажмите кнопку запуска на блоке питания. При необходимости, регулировать ток до 300 мА путем повышения или понижения уровня буфера. Keep-ее уровня буфера непосредственно над поверхностью слайдах. Выполните электрофорезу при 4 ° С в течение 20 мин. Запись слайд-размещение, температура буфера и ток (в амперах) в начале и в конце электрофореза.
    Примечание: Слишком много буфера приведет к снижению напряжения, которые могут препятствовать миграции ДНК.
  6. После электрофореза нейтрализации избытка щелочи, осторожно поднимая слайды из резервуара и погружения в нейтрализации буфера (раздел 1.2.5) в течение 5 мин. Слить слайды и повторить еще два раза.
  7. Закрепить слайды, погружая в холодном 100% этаноле в течение 5 мин. Разрешить слайды высохнуть на воздухе и место в сухом месте для хранения.

6. ДНК Окрашивание, Comet Визуализация и анализ

  1. окрашивание ДНК
    1. Поместите слайды на картон или металлический поднос и добавить 200 мкл нуклеиновой кислоты флуоресцентный краситель рабочего раствора (раздел 1.2.7) для каждого слайда и накройте покровным стеклом. Защитите слайды изсвет позволяют слайды оставаться в контакте с красящим раствором в течение по крайней мере 30 минут до взятия ворот. Пятно слайды в партиях от 20 одновременно.
    2. Перед чтением каждого слайда, аккуратно промокните излишки окрашивание раствора, стараясь не мешать покровного стекла.
  2. Комета Визуализация и Scoring
    1. Используйте видеокамеру, прикрепленную к флуоресцентным микроскопом для просмотра живого изображения кометы слайд на мониторе компьютера.
    2. Произвольно выбрать поле микроскопа, содержащий клетки. С помощью мыши, выберите ячейку. Нажмите на центр "головы кометы" с левой кнопки мыши.
      Примечание: Программное обеспечение компьютера вычисляет все параметры измерения для ячейки и добавляет данные в файл данных.
    3. Результат все ячейки в текущей области (см шаг 6.2.4), а затем использовать элементы управления этапе микроскопа и видео на экране, чтобы найти другой набор ячеек. Оценка этих клеток, как описано в разделе 6.2.2.
    4. Оценка слайд-пром справа налево и снизу вверх. Выберите около 10 полей в случайном порядке. Во время этого процесса, любая подходящая комета клетка, которая появляется в поле зрения должен быть забит без смещения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не забить кометы, если любой из следующих условий: 1) оно расположено на любом из краев слайда; 2) два или более комет перекрываются; 3) есть мусор в хвосте; 4) программное обеспечение не может различать между головой и хвостом; или 5) Окрашивание ядер и / или хвоста значительно отличается от других комет на слайде.
      Примечание: Кометы с почти всех их ДНК флуоресценции в хвосте часто называют кометы "ежа". Ежик кометы не должны быть засчитан, но количество ежей, обнаруженных во время слайд скоринг должен быть записан и в виде процента от общего числа комет.
    5. Анализ по меньшей мере, 75 комет на слайд, чтение двух слайдов на органа / ткани, чтобы получить, по меньшей мере, 150 клеток / кометы образца в общей сложности. После необходимого количества клеток из ползуна имеют бытьан забил, результат сохраняется в виде файла электронной таблицы для последующего анализа данных.

7. Анализ гистопатология

  1. После того, как минимум 72 ч фиксации в 10% НСБ, а затем ткани обрезки 21, регулярно обрабатывать и вставлять левую боковую лопасть печени образцов в парафиновый воск на основе среды 22. Раздел образцы примерно 5 мкм и собирают на стеклах.
  2. Пятно секции с гематоксилином и эозином (H & E):
    1. Нагреть слайды с парафиновых срезах ткани в печи C 60 ° в течение 2 ч до процедуры окрашивания.
    2. С помощью ксилола deparaffinize стороны. Увлажняет слайды с градуированной этанолом (EtOH) к работающему ополаскивания водопроводной воды.
    3. Поместите слайды в 450 мл гематоксилином в течение 2 мин и 40 сек. Полоскание слайды с кислотой (2 мл ледяной уксусной кислоты в 450 мл деионизированной воды) в течение 4 сек следуя по 5 мин проточной водопроводной водой полоскании.
    4. Поместите соскользнулЕ. С. в 450 мл 70% этанола, содержащего 1 мл гидроксида аммония в течение 2 мин, а затем проточной водопроводной водой полоскание в течение 2 мин и 30 сек и 70% этанола полоскание в течение 1 мин.
    5. Инкубируйте слайды с 450 мл эозин Y раствора, содержащего 4 мл ледяной уксусной кислоты в течение 3 мин.
    6. Обезвоживают слайды с градуированной этанола. Очистить слайды с ксилолом (три раза по 1 мин каждый), и провести слайды в ксилоле, пока не покровные стекла помещены на слайдах.
  3. Осмотрите слайды с помощью световой микроскопии, записывать выводы и класса неопухолевых поражений для тяжести как 1 (минимальное), 2 (мягкий), 3 (средний уровень) или 4 (маркированные).
    Примечание: Тяжесть класс применяется для конкретного поражения основана на относительной доле печени с поражением (минимальная = <1-15%, мягкому = 16-35%, умеренная = 36-60%, а также отмечены = 61- 100%).

Анализ 8. Данные

  1. Животное считается экспериментальной единицей для статистических оценок. Повреждение ДНК выражается в% DNА на хвосте.
  2. Окислительное повреждение ДНК рассчитывается следующим образом: опорные слайды (без обработки ферментом) обеспечивают оценку разрывов фона цепи ДНК (SB).
    ПРИМЕЧАНИЕ: обработанную ферментом горок обеспечивают измерение разрывов нитей и окисленные основания (SB + Ox). Предполагая линейную характеристику дозы для% ДНК в хвосте в зависимости от повреждения ДНК, вычитание SB от SB + ОХ дает оценку разрывы ДНК пряди из окисленных пиримидинов / пуринов измененными 23.
  3. Анализ% ДНК в хвосте в зависимости от дозы с помощью одностороннего ANOVA с последующим тестом Даннетта для попарных сравнений из ответов на обработанных животных к управления транспортным средством.
    Примечание: Все тесты один хвостами и р-значение менее 0,05 устанавливается в качестве критерия статистической значимости.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Щелочной метод ДНК - комет в естественных условиях проводили в сочетании с модифицированном ферментом кометы анализа для измерения прямой и окислительное повреждение ДНК в печени крыс , получавших ципротерона ацетат (CPA) 5. CPA является синтетическим гормональный препарат , который вызывает опухоли печени крысы таким образом , секс-специфический, с пятикратным более высокие дозы , необходимые для индукции опухолей печени у самцов крыс по сравнению с женщинами 24...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Этот протокол описывает одновременное измерение прямого и окислительного повреждения ДНК в печени крыс на уровне одной клетки. Общий протокол применим к любой ткани , из которой отдельные клетки или ядра могут быть изолированы с минимальным повреждением ДНК обработки индуцированный (т.е. повреждение ДНК индуцируется не тестируемым агентом, но при обработке и обработке тканей животных). В нашем исследовании мы провели щелочные кометы анализы на клетки из костного мозга, желудка 7,9- 6,

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Ни у одного из авторов нет конкурирующих или конфликтующих интересов. Информация, содержащаяся в этих материалах, не является официальным распространением информации FDA и не отражает позицию или политику агентства.

Благодарности

Эта работа была поддержана Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США. Мы выражаем признательность за оригинальную публикацию исследования CPA компании Elsevier B.V.: Ding W, Bishop ME, Peace MG, Davis KJ, White GA, Lyn-Cook LE, Manjanatha MG. Анализ дозы-реакции на пол у крыс F344, обработанных ципротероном ацетатом. Mutation Research 774: 1-7, 2014 (PMID: 25440904)

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Покровные стекла (No1, 24 x 50 мм)Фишер12-544-14
Предметные стекла для микроскопаФишер12-550-123
Диметилсульфоксид (ДМСО) Fisher67-68-5
EDTA, DisodiumFisherBP120-1
Фосфат буферизованный солевым растворомFisherICN1860454
1x Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) (Ca2+, Mg2+ free)HyCloneSH30588.02
HEPESFisherBP310-1
Низкая температура плавления Агароза ( LMP)Lonza50081NuSieve GTG Агароза
нормального плавления Агароза (NMA) FisherBP1356-100
Тестовые полоски для измерения pH (pH 7,5-14)FisherM95873
Хлорид калияFisher7447-40-7
Гидроксид калияFisher1310-58-3
слайд-этикетки (0,94 x 0,5 дюйма)Хлорид
NaCl) Fisher7647-14-5
Гидроксид натрия (NaOH)  Фишер1310-73-2
СИБР&трейд; Золото InvitrogenS11494
Triton X-100 Фишер9002-93-1
База Тризма Fisher77-86-1
Микроцентрифужные пробирки 2,0 млFisher05-402-6
Сетчатый фильтр для клеток (40 & микро; m)Фишер22363547
Эндонуклеаза III (Nth) New England BiolabsM0268Sразведение 1:1,000
hOGG1 Новая Англия BiolabsM0241SРазведение 1:1,000
натрия Фишера NC9822036 (

Ссылки

  1. Collins, A. R. The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations. Mol Biotechnol. 26 (3), 249-261 (2004).
  2. Olive, P. L., Banath, J. P., Durand, R. E. Heterogeneity in radiation-induced DNA damage and repair in tumor and normal cells measured using the 'comet' assay. Radiat Res. 122 (1), 86-94 (1990).
  3. Guidance on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended for Human Use S2(R1). ICH. , Available from: http://www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/Safety/S2_R1/Step4/S2R1_Step4.pdf (2011).
  4. Committee, E. S. Scientific opinion on genotoxicity testing strategies applicable to food and feed safety assessment. EFSA Journal. 9 (9), 2379(2011).
  5. Ding, W., et al. Sex-specific dose-response analysis of genotoxicity in cyproterone acetate-treated F344 rats. Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen. 774, 1-7 (2014).
  6. Ding, W., et al. In vivo genotoxicity of estragole in male F344 rats. Environ Mol Mutagen. 56 (4), 356-365 (2015).
  7. Ding, W., et al. In vivo genotoxicity of furan in F344 rats at cancer bioassay doses. Toxicol Appl Pharmacol. 261 (2), 164-171 (2012).
  8. Li, Y., et al. Cytotoxicity and genotoxicity assessment of silver nanoparticles in mouse. Nanotoxicology. 8 (suppl 1), 36-45 (2014).
  9. Ding, W., et al. Methyleugenol genotoxicity in the Fischer 344 rat using the comet assay and pathway-focused gene expression profiling. Toxicol Sci. 123 (1), 103-112 (2011).
  10. Manjanatha, M. G., et al. Genotoxicity of doxorubicin in F344 rats by combining the comet assay, flow-cytometric peripheral blood micronucleus test, and pathway-focused gene expression profiling. Environ Mol Mutagen. 55 (1), 24-34 (2014).
  11. Smith, C. C., O'Donovan, M. R., Martin, E. A. hOGG1 recognizes oxidative damage using the comet assay with greater specificity than FPG or ENDOIII. Mutagenesis. 21 (3), 185-190 (2006).
  12. Collins, A. R. Measuring oxidative damage to DNA and its repair with the comet assay. Biochim Biophys Acta. 1840 (2), 794-800 (2014).
  13. Brendler-Schwaab, S., Hartmann, A., Pfuhler, S., Speit, G. The in vivo comet assay: use and status in genotoxicity testing. Mutagenesis. 20 (4), 245-254 (2005).
  14. Hartmann, A., et al. Recommendations for conducting the in vivo alkaline Comet assay. 4th International Comet Assay Workshop. Mutagenesis. 18, 45-51 (2003).
  15. Collins, A. R. Investigating oxidative DNA damage and its repair using the comet assay. Mutat Res. 681, 24-32 (2009).
  16. Collins, A. R., et al. Comet assay in human biomonitoring studies: reliability, validation, and applications. Environ Mol Mutagen. 30 (2), 139-146 (1997).
  17. Gutzkow, K. B., et al. High-throughput comet assay using 96 minigels. Mutagenesis. 28 (3), 333-340 (2013).
  18. International Validation of The in vivo Rodent Alkaline Comet Assay For the Detection of Genotoxic Carcinogens. JaCVAM. , Available from: http://cometassay.com/JaCVAM.pdf (2009).
  19. Test Guideline (TG) No. 489 In Vivo Mammalian Alkaline Comet Assay. OECD. , Available from: http://www.oecd-ilibrary.org/environment/test-no-489-in-vivo-mammalian-alkaline-comet-assay_9789264224179-en;jsessionid=m5560j16hf1r.x-oecd-live-02 (2014).
  20. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. AVMA Panel on Euthanasia. , Available from: https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf (2013).
  21. Ruehl-Fehlert, C., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 1. Exp Toxicol Pathol. 55 (2-3), 91-106 (2003).
  22. Carson, F. A Self-Instrumental Text. Histotechnology. , 25-37 (1996).
  23. Dusinska, M. THE COMET ASSAY, modified for detection of oxidised bases with the use of bacterial repair endonucleases. Dusinska Protocol [Internet]. , Available from: http://www.cometassayindia.org/Dusinska-protocol.PDF (2000).
  24. Schuppler, J., Gunzel, P. Liver tumors and steroid hormones in rats and mice. Arch Toxicol Suppl. 2, 181-195 (1979).
  25. Hobkirk, R. Steroid sulfotransferases and steroid sulfate sulfatases: characteristics and biological roles. Can J Biochem Cell Biol. 63 (11), 1127-1144 (1985).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

ткань печени крысысуспензия одиночных клетокгель-электрофорезфлуоресцентная микроскопияферменты hOGG1 и Endo IIIповреждение ДНКиндуцированное CPA
В Vivo щелочной Comet Assay и энзим-модифицированной щелочной Comet Анализ для Измерение разрывов ДНК и окислительный ДНК повреждений в печени крысы
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.