Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Количественное экспрессии белка и совместной локализации Использование Multiplexed иммуногистохимическое окрашиванием и мультиспектральных визуализации

12.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53837

⸱

8 апреля 2016 г.

 ,  ,  ,  , 
1Division of Urologic Surgery, Washington University in St. Louis School of Medicine, 2Department of Urology, University of Wisconsin School of Medicine and Public Health, 3Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of Wisconsin School of Medicine and Public Health, 4O’Brien Urology Research Center, University of Wisconsin School of Medicine and Public Health

В этой статье

Краткое содержание

Иммуногистохимия — это мощный лабораторный метод для оценки локализации и экспрессии белков в тканях. Современные полуавтоматические методы количественной оценки вносят субъективность и часто приводят к невоспроизводимым результатам. В данной работе мы описываем методы мультиплексной иммуногистохимии и объективного количественного определения экспрессии и колокализации белков с использованием мультиспектральной визуализации.

Аннотация

Иммуногистохимия — это широко используемый клинический и исследовательский лабораторный метод обнаружения для изучения экспрессии и локализации белков в тканях. Для оценки экспрессии с помощью иммуногистохимии было разработано множество полуколичественных систем, но присущая ей субъективность ограничивает воспроизводимость и точность результатов. Кроме того, исследование пространственно перекрывающихся биомаркеров, таких как ядерные факторы транскрипции, затруднено с помощью современных методов иммуногистохимии. Нами разработана и оптимизирована система для одновременного исследования нескольких белков с использованием высокопроизводительных методов мультиплексной иммуногистохимии и мультиспектральной визуализации. Мультиплексная иммуногистохимия проводится путем последовательного применения первичных антител вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена или щелочной фосфатазой. Для обнаружения каждого интересующего белка используются различные хромогены. Окрашенные слайды загружаются в автоматизированный сканер слайдов, и создается протокол для автоматического получения изображений. Спектральная библиотека создается путем окрашивания набора слайдов одним хромогеном на каждом. Подмножество репрезентативных окрашенных изображений импортируется в программное обеспечение для мультиспектральной визуализации, а алгоритм для различения типов тканей создается путем определения тканевых компартментов на изображениях. Субклеточные компартменты сегментируются с помощью гематоксилинового контрокрашивания и корректировки собственного алгоритма. Пороговое определение применяется для определения положительности и совместной локализации белка. Окончательный алгоритм затем применяется ко всему набору тканей. Полученные данные позволяют пользователю оценить экспрессию белка на основе типа ткани (например, эпителия или стромы) и субклеточного компартмента (ядро, цитоплазма или плазматическая мембрана). Ко-локализационный анализ позволяет исследовать двойные положительные, двойные отрицательные и одиночные положительные типы клеток. Сочетание мультиспектральной визуализации с мультиплексной иммуногистохимией и автоматическим получением изображений является объективным высокопроизводительным методом исследования биомаркеров в тканях.

Введение

Иммуногистохимия (IHC) является стандартным методом лаборатории для обнаружения белка в ткани, и IHC до сих пор широко используется в обоих исследованиях и диагностике патологий. Оценка IHC окрашивания часто полуколичественный, представляя потенциальную систематическую ошибку в интерпретации результатов. Многие Полуколичественные подходы были разработаны , которые включают как интенсивность окрашивания и окрашивания степени в окончательный диагноз 1-4. Другие системы включают балльной интенсивности и субклеточном положение для того , чтобы лучше локализовать выражение 5. Включение средних баллов из нескольких зрителей часто используется для того , чтобы свести к минимуму влияние единого зрителя смещения 6. Несмотря на эти усилия, субъективность в анализе до сих пор остается, в частности , при оценке степени окрашивания 7. стандартизации протокола и сведение к минимуму субъективность от человеческого фактора имеет первостепенное значение для создания точных и воспроизводимых результатов IHC.

Содержание "> Есть и другие варианты , кроме IHC для определения экспрессии белка в тканях. В условиях исследования, иммуногистохимии традиционно рассматривается как средство для изучения локализации белка 8, в то время как другие методы , такие как иммуноблоттинга рассматриваются как золотой стандарт для исследования экспрессии белка . Определение ткани или экспрессии компартмент клетки конкретных трудно без включающее в себя передовые методы , такие как фракционирования клеток или лазерной захвата микродиссекции 9,10. использование флуоресцентных антител на слайдах ткани предлагает разумный компромисс, но фон аутофлуоресценция из - за NADPH, lipofuscins, ретикулярная волокна, коллаген, эластин и может сделать точные количественное трудно 11.

Автоматизированная вычислительная патология платформы являются перспективным направлением для более объективной количественной оценки патологии окрашивания 12-15. Сочетание мультиспектральных изображений с микрочипов тканиспособствует высокой пропускной анализ экспрессии белка в больших размерах выборки. С помощью этих методов, анализ белка совместной локализации, окрашивая гетерогенности и ткани и внутриклеточной локализации возможно при существенном снижении как неотъемлемые уклоны и время , необходимое для анализа, при возвращении данных в непрерывном , а не категорическим формате 16. Таким образом, цель данного исследования состояла в том, чтобы продемонстрировать полезность и методологии для выполнения мультиплексированный иммуногистохимии с анализом, с использованием мультиспектральных изображений программного обеспечения.

Этот протокол написан для ручного, мультиплекс иммуногистохимического окрашивания одной секции ткани слайде с четырьмя оптимизированными моноклональных антител. В качестве показательного эксперимента, ядерный анти-кроличий альфа-рецептора эстрогена (ERα) и рецептор андрогена (AR) мультиплексируются с мембраной анти-мышиного CD147 и мембраносвязанного анти-мышиного Е-кадгерина. Любое антитело выбора может быть substitutе изд антител, перечисленных в данном описании, но каждая комбинация антител требует отдельной оптимизации. Предварительная обработка для всех антител, должны быть идентичными. АР и CD147 антитела должны быть оптимизированы индивидуально, а затем в виде коктейля. Каждое антитело обнаруживают с использованием биотин-свободной полимерной системы, и один из 4-х уникальных хромогенами.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Примечание: Протокол здесь , описывает окрашивание и анализ микрочипов ткани (TMA), описанный ранее 12,17,18. Толстая секция ТМА 4 мкм, была получена из парафинового блока с использованием стандартного микротом.

Примечание: Спектральный библиотека для 4 хромогенами и контрастирующая должны быть созданы для количественной оценки изображения. Для того чтобы сделать это, оптимизированный протокол для каждого отдельного антитела должны работать с одним антителом на слайд, за вычетом окончательной контрастирующая. Пятый слайд должен быть окрашивали гематоксилином, чтобы генерировать 5 изображений, необходимых для создания спектральной библиотеки.

1. Мультиплекс Immunohistochemistry

  1. Выпечка скользит в печи 60 ° С в течение 20 мин. Использование химического вытяжку, погрузите слайд в 100% ксилола. Повторите эти действия для 2 смены ксилола. Погрузите слайд в 100% этаноле в течение 5 мин. Повторите со свежим 100% -ным этанолом.
  2. Погрузите слайд в 95% этаноле в течение 3 мин. Повторите со свежими95% -ного этилового спирта. Погрузите слайд в 70% этаноле в течение 3 мин. Погрузите слайд в дистиллированной воде в течение 3 мин. Повторите со свежей дистиллированной водой. Нажмите слайд вертикально, чтобы слить воду из слайда. Применить 200 мкл готового к употреблению эндогенной пероксидазы блокирующим в течение 5 мин.
  3. Слив пероксидазной блокиратор от ползуна и погружают в 45 мл готового к использованию буфера извлечения (рН менее 7,0). Место слайд-контейнер в скороварке и начать программу установить до 124 ° С в течение 4 мин. Дайте скороварке остыть в течение 20 мин. перед открытием.
  4. Удалить контейнер поиска информации буфера и дайте ему остыть еще 10 мин. Промыть слайд в дистиллированной воде в течение 10 мин. Слить воду из ползуна и тщательно разграничить ткани на слайде с гидрофобным барьерного ручкой.
  5. Добавьте 200 мкл фосфатно-солевого буферного раствора (PBS) .Transfer горкой на плоскую емкость с крышкой (инкубационной камере), содержащей влажную марлю.
  6. Готовят 1 л 1x Трис-солевой буферный раствор с Tween-20 (TBST), путем разбавления 50 мл 20х Трис-солевой буферный раствор, содержащий 1% Tween-20 и 950 мл дистиллированной воды.
  7. Слить PBS с горкой и применять 200 мкл 1x TBST. Выдержите 2 мин. Слить TBST из слайдов и возврата слайд в инкубационной камере. Применить 200 мкл готового к употреблению блок универсального белка, близкой камере и инкубировать в течение 7 мин.
  8. Дренажный блок белка и вернуть слайд в инкубационной камере. Развести анти-ERα антитела 1: 400 путем добавления 0,6 мкл антител к 239,4 мкл разбавителя антител. Применить 200 мкл разведенного антитела к скользят и тесной камере.
  9. Инкубировать слайд при комнатной температуре в течение 2-х часов. Слив антитела из ползуна и полоскание с TBST с последующим погружением на 5 минут в TBST.
  10. Слить TBST из слайдов и возврата слайд в инкубационной камере. Применить 200 мкл готового к употреблению козы против кролика пероксидазы полимера и тесной камере. Инкубировать в течение 30 мин. при комнатной температуре. Полоскание слайд с TBST и место слайда в контейнер TBST в течение 5 мин.
  11. Приготовьте коричневый пероксидаза хрена-3,3'-диаминобензидина (HRP-DAB) хромогена путем добавления 8 мкл хромогена DAB в 250 мкл буфера для субстрата ДАБ и хорошо перемешивая.
  12. Слить TBST из слайда, обратного слайда к инкубационной камере и применять 200 мкл коричневого хромогена HRP-DAB в течение 6 мин. Тщательно промойте слайд дистиллированной водой и поместите горкой в ​​сосуд с дистиллированной водой.
  13. Смешайте денатурирующего раствора путем объединения 50 мкл первого элюирования реагента 150 мкл второго реактива буфера. Слить воду с горкой и применять разбавленный раствор денатурации к слайду в течение 3 мин. при комнатной температуре. Слейте и промойте денатурирующих реагента с TBST. Погрузите слайд в TBST в течение 5 мин.
  14. Готовят AR / CD147 антитела коктейль разбавлением 4,2 мкл анти-AR антитела и 2,8 мкл анти-CD147 антитела с 203 мкл разбавителя антитела. Слить TBST из слайда, вернуть слайд в инкубационной камере и применять 200 мкл AR / CD147 Cocktail к слайду. Закрыть камера и инкубировать в течение 1 часа при комнатной температуре. Полоскание слайд с TBST и погружают в TBST в течение 5 мин.
  15. Слить TBST, обратный сползания к инкубационной камере и применять 200 мкл готового к употреблению козы против кролика щелочной фосфатазы полимера. Закрыть камеру и инкубировать слайд в течение 30 мин. при комнатной температуре. Полоскание слайд с TBST и погружают в TBST в течение 5 мин.
  16. Подготовить красный щелочной фосфатазы хромогена путем добавления 3,2 мкл красного хромогена до 250 мкл красного хромогена буфера и хорошо перемешать.
  17. Слить TBST из слайдов и возврата слайд в инкубационной камере. Применить 200 мкл разбавленного красного хромогена щелочной фосфатазы в слайд, близкой камере и инкубировать в течение 7 мин.
  18. Слить хромогена и тщательно промойте слайд дистиллированной водой. Поместите слайд в сосуд с дистиллированной водой в течение 5 мин. Слить воду из слайда, промыть TBST и вернуться к инкубационной камере. Применить 200 мкл козьего антитела против мышиных-HRP полимера к слайду и Клосаэлектронной камеры. Инкубировать в течение 30 мин. при комнатной температуре.
  19. Слить полимера из слайда и смыть TBST. Поместите слайд в TBST в течение 5 мин. Подготовьте 200 мкл HRP-фиолетовой связаны хромогена добавлением 3,2 мкл стабилизирующего реагента к 250 мкл буфера и хорошо перемешать. Добавить 3,2 мкл фиолетовый хромогена и хорошо перемешать, затем 3,2 мкл реагента пероксида водорода и хорошо перемешать.
  20. Слить TBST от слайда и применить 200 мкл приготовленного фиолетового хромогена, чтобы скользить и инкубировать в течение 7 мин. при комнатной температуре. Полоскание слайд с дистиллированной водой и поместите горкой в ​​сосуд с дистиллированной водой в течение 5 мин.
  21. Смешайте денатурирующего раствора путем смешивания 50 мкл первого элюирования реагента 150 мкл второго реактива буфера. Слить воду с горкой и применять разбавленный раствор денатурации к слайду в течение 3 мин. при комнатной температуре.
  22. Полоскание денатурирующих реагент прочь с TBST. Поместите слайд в контейнер TBST в течение 5 мин. Развести анти-Е-кадгерин антителдо 1: 200 путем добавления 1,1 мкл антитела к 218,9 мкл разбавителя антитела. Слить TBST с горкой, обратного слайда к инкубационной камере и применять 200 мкл Е-кадгерина к слайду. Закрыть камеру и инкубировать 30 мин. при комнатной температуре.
  23. Полоскание слайд с TBST и место слайда в контейнер TBST в течение 5 мин. Слить TBST из слайда, возвращают слайд в инкубационной камере и применять 200 мкл козьего против мышиного HRP полимера. Инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин. Полоскание слайд с TBST и место слайда в контейнер TBST в течение 5 мин.
  24. Подготовьте черный HRP-связанный хромоген добавлением 8 мкл хромогена 250 мкл буфера. Применить 200 мкл хромогена, чтобы скользить и развиваться в течение 2 мин. Тщательно промойте слайд дистиллированной водой и погружают в сосуд с дистиллированной водой.
  25. Развести гематоксилин путем добавления 40 мкл гематоксилином в 200 мкл дистиллированной воды. Слить воду из слайде и применять 200 мкл разведенной гематоксилином скользить в течение 30 секунд. Полоскание слайдтщательно проточной водопроводной водой в течение 2 мин., а затем промыть в дистиллированной воде в течение 30 секунд. Поместите слайд в печи C 60 ° в течение 15-30 мин.
  26. Погрузите слайд в свежеприготовленного 100% ксилола в течение 30 секунд, вытрите избыток ксилола от и добавить одну каплю постоянных монтажных средств массовой информации. Покровное с п 1.5 покровное.

2. Автоматическое Получение изображения и анализ

  1. Загрузите запятнанные слайды на автоматизированный сканер слайдов. На основе диаметра, разделения и количества ядер ТМА, создать автоматизированный протокол сканирования согласно инструкции по эксплуатации завода-изготовителя.
  2. Открытое программное обеспечение мультиспектральных изображений для построения спектральной библиотеки из контрольных слайдов, окрашенных с отдельными хромогенами и гематоксилин окрашивали слайд. Открыть куб изображение, полученное с помощью ползунка и выбрать четыре-пять положительно окрашенных областей, чтобы определить, что оптически хромогена. Повторите с изображением кубиков из других слайдах управления до полной спектральной библиотеки representiнг все хромогены создается, а затем сохранить спектральную библиотеку.
  3. Начните новый проект в рамках мультиспектральных ПО для обработки изображений. Выберите "мультиспектральных (.im3)" для опции формата изображения и "Светлое" для формата образца. Во-первых, настроить проект, выбрав нужные параметры: "Сегмент ткань", "Найти функций", "фенотипа", "Оценка" и "Экспорт". На данный момент, разрешение изображения может быть изменено, чтобы ускорить время проведения анализа, при желании.

3. Ткань Сегментация

  1. Импорт ранее созданную спектральную библиотеку и выбрать все хромогены, которые будут включены в анализ.
  2. Открытые кубы изображения, которые будут включены в учебные набора данных, выбрав опцию "Открыть куб изображения". Для обеспечения точности обучения, выбрать по крайней мере 18% от общего количества изображений, которые будут проанализированы. Выберите изображения, которые представляют все болезненные состояния, чтобы повысить точность сегментации. Эта часть изображений яs называется тренировочный набор изображений.
  3. Белые изображения баланс в обучающей выборки, выбрав инструмент Пипетка и выбрать область в одном изображении, что белый.
  4. Выберите кнопку "Advance" для перехода к сегментации ткани. Используйте "Tissue Категории" панели , чтобы выбрать типы тканей для анализа (т.е. "ткань" и "не-ткань"). Для более точного локализации белка ткани, множественные категории ткани могут быть использованы (например. "Эпителий", "строма" и "не-ткань").
  5. Начните создание алгоритма и определения категорий ткани, нарисовав вокруг группы ячеек в тренировочных образов. Закончив с одной категории ткани, повторяют для других категорий ткани. Не забудьте выбрать группы ячеек в пределах изображений, характерных для данного типа ткани категории.
  6. Повторите эту процедуру для всех изображений в рамках тренировочного набора изображений.
  7. Выбор компонентов (Хромогены), которые будут включены в Traiнин для "Tissue Сегментер". При выполнении анализа изображений иммуногистохимических светлого, все компоненты, как правило, включены в обучение. Включите обильные отрицательные образы окрашивания в обучающей выборки, чтобы избежать предвзятости во время этого шага.
  8. Выберите подходящий шаблон "Масштаб" для тренировки Сегментер ткани. Под 20X увеличении, большая картина масштаба, как правило, необходимо. При работе с тканями с прекрасной архитектурой под большим увеличением, меньший масштаб модели является более целесообразным.
  9. Нажмите кнопку "Поезд Tissue Сегментер", чтобы начать обучение Сегментер ткани. Обратите внимание на всплывающее окно, отображающее точность, отражающий долю пикселей в учебных регионах, которые должным образом классифицированы.
    Примечание: Программное обеспечение постоянно пытается улучшить точность алгоритма, пока вручную не будет остановлено. Ранее мы показали , что обучение на 18% изображений приводит к 97% точности учебной 12.
  10. После того, как Сегментер ткани обучен, выбрать соответствующее разрешение сегмента. Разрешение по сегментам соответствует времени, необходимому для изображений сегмента с низкой разрешающей способностью, требующей меньше времени и высокое разрешение, требующее больше времени.
  11. Сегмент весь учебный набор изображений, нажав кнопку "Сегмент изображения". Разрешить программное обеспечение достаточно времени, чтобы применить алгоритм для всех тренировочных образов. По завершении обзора обучающей выборки, чтобы найти какой-либо неправильно классифицирован ткани с текущим алгоритмом обучения.
  12. Для точной настройки процесса сегментации ткани, добавлять, редактировать или удалять ткани учебные регионы. Используйте опцию "Trim края", если пиксели распространяются по краям одной категории ткани в другую. Если небольшие группы пикселов неправильно классифицирован, отрегулируйте порог по минимальному размеру сегмента.
  13. Когда редактирование завершены, выберите "Сегмент изображения", это будет повторно обучить Сегментер ткани, чтобы создать новый алгоритм сегментации ткани. Предыдущий алгоритмавтоматически сохраняется и может быть возвращен при необходимости.
  14. Когда уверенно с результатами сегментации ткани алгоритма, перейти к сегментации ячейки, выбрав кнопку "Advance".

4. Сегментация Cell

  1. Выберите субклеточных отсеков, которые будут включены в сегментации клеток. Убедитесь в том, что "Ядра" уже выбран, чтобы выбрать "цитоплазмы" или "мембрана".
    Примечание: сегментация "Мембрана" следует выбирать только тогда, когда мембрана-специфический белок маркер был включен в IHC, такие как E-кадгерина.
  2. На вкладке "ядра", есть несколько вариантов. Начните с выбора соответствующих настроек для ядерной сегментации (см шаг 4.3). Выберите, будет ли включать отдельные или все категории ткани в сегментации.
  3. Выберите подход к ядерной сегментации
    1. Выберите "контрастное основе пикселей (Threshold)" подход для упрощенного способа получения хорошоРезультаты не зная много о параметрах обработки изображений.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это часто делает хороший первый выбор. При выборе подхода, "Pixel-Based (Threshold)" является более подходящим, когда есть надежный ядерный счетчик-пятно, в то время как "объектно-ориентированный" следует использовать, если есть отсутствие последовательной ядерной контрастирующая.
    2. Выберите "пиксельный метод (Threshold)" подход, когда есть надежный ядерный контрастирующая.
      Примечание: Этот подход является чисто на основе пикселей. Такой подход может также использоваться для других целей анализа изображений, которые могут быть удовлетворены с помощью простого порогового значения, например, обнаруживать все пиксели в пределах категории ткани, окрашивать положительным для окрашивания IHC.
    3. Выберите подход объектно-ориентированный, если ядерная контрастирующая не обеспечивает последовательное и специфическое окрашивание ядерных объектов, а также более продвинутые подходы морфометрия на основе необходимы для обнаружения ядер.
    4. Выберите "Компоненты для ядерных Сегментация", "Nuclуха Размер "и" Очистка ", если пользователь желает дальнейшего определения ядер параметров сегментации.
  4. Выберите цитоплазме параметры формы
    1. Нажмите кнопку "Advance", чтобы перейти к цитоплазме сегментации.
      Примечание: Есть несколько вариантов сегментации в пределах цитоплазмы на выбор. Опция называется «внутреннее расстояние до ядра" пиксель на основе. Это отражает расстояние между внешней стороны ядра и внутренней части цитоплазмы. Увеличение этого значения уменьшает вероятность того, что ядерный сигнал пересекает в цитоплазму отсек.
    2. Далее выберите "внешнее расстояние до ядра".
      Примечание: Это также пикселя на основе. Внешнее расстояние до ядра отражает расстояние между внешней стороны ядра и внешней стороне клетки. Это значение может быть установлено большим или достаточно мал, чтобы включить или исключить мембранные сигналы при желании.
    3. Далее выберите "минимальный размер".
      Примечание: Минимальный размер, PIXEл на основе, отражает минимальный размер цитоплазма выборки должны быть включены в анализ. Если размер цитоплазма меньше в конкретной клетке, например, когда клетки плотно упакованы вместе, сегментация цитоплазма исключен из анализа.
    4. Выберите следующий параметр, "компонент" с "Primary", "Secondary", и выберите "третичном" в качестве вторичных вариантов.
      Примечание: Здесь можно выбрать конкретный цитоплазмы маркер. Подобно ядерной сегментации, если был использован специфический цитоплазматический ВВК маркер, этот компонент может быть использован для определения цитоплазму путем нахождения минимального порогового значения. Это помогает в определении цитоплазму, но не является необходимым для приемлемой точностью.
    5. Переход к последней из трех вкладках опций "Мембрана". Здесь, пользователь определяет мембранный отсек с протеином маркером. Выберите "Primary", "Secondary", и / или "третичный" для каждого мембранного специфического маркера, используемого. Adjust "Full Scale OD ", чтобы найти минимальный порог или положительный для каждого маркера на клеточные мембраны.
    6. Продолжение на вкладке "пленочного" и выберите опцию "Максимальный размер ячейки".
      Примечание: Это расстояние до значения мембраны, в пикселях, которая определяет максимальный размер ячеек. Значение 12, как правило, подходит для снимков, сделанных при увеличении 20Х.
    7. После выбора всех параметров выберите "Сегмент изображения" или "Сегмент всех". Применить настройки к изображениям и наблюдать их «по отдельности» или в режиме "Галерея".
      Примечание: Настройка параметров и пороговых значений, при необходимости, и повторно сегмент до удовлетворен результатами сегментации клеток в обучающем наборе изображений.

5. Фенотипирование клеток

Примечание: Точная сегментации клеток требуется для того, чтобы получить точные ячейки фенотипирования, а функция Фенотипирование обучаемостью.

  1. Используйте кнопку "Добавить &# 34; Кнопка для добавления фенотипы в список "фенотипов". Пользователи могут выбрать цвет для фенотипа.
  2. Нажмите на кнопку "Редактировать" фенотипов назначить фенотип клетки. Нажмите на конкретную ячейку, чтобы вызвать выпадающее меню, что позволяет пользователю выбрать фенотип, а затем двигаться дальше. Определить по крайней мере, пять (5) клеток в каждом фенотипа, чтобы продолжить. Выбор 25 или более клеток каждого фенотипа необходима для достижения оптимальных результатов.

6. Подсчет очков IHC и совместной локализации

  1. Выберите "Advance" для перехода к "Счет IHC или IF" шаг. Выберите "Tissue Категория", чтобы забить.
    Примечание: только одна категория ткани может быть засчитан в течение конкретного анализа, но если результаты скоринга в другую категорию ткани желательно, анализ можно повторить позже с различными настройками.
  2. Выберите нужный тип "Scoring".
    Примечание: Позитивность создает два бункера (положительные и отрицательные) для компонента интереса, В то время как двойной положительность используется для анализа совместной локализации. Другие варианты включают 4-бен, 10-бен, и 50-бен анализы для маркера выбора.
  3. Выберите ячейку "купе", который будет использоваться в выигрыше анализа.
  4. Аналогично найти минимальный порог для первичного ядерного компонента выберите "View Component Data" и переместить курсор на тренировочных образов, чтобы найти соответствующие оптическую плотность минимальные пороги окрашивания для положительных клеток для компонента (ов), представляющие интерес.
  5. Если интенсивно окрашенные клетки должны быть исключены, снизить порог макс до соответствующего уровня. В противном случае, используйте кнопку автоматического выбора порогового максимума для анализа.
  6. Выберите тренировки изображения, чтобы набрать для того, чтобы подтвердить значения пороговых значений.
    Примечание: Процент клеток в пределах конкретного бункера будут возвращены и их можно сравнить с помощью визуального осмотра или ручного подсчета. После завершения выберите "Advance", чтобы перейти к шагу "Экспорт".
<р класс = "jove_title"> 7. Применение алгоритма и пакетный анализ

  1. Тестирование алгоритма сегментации, созданный с помощью ткани, сегментации клеток и значений скоринговых путем экспорта данных для обучающей выборки. Следуйте инструкциям, чтобы создать новую папку для каталога экспорта. Выберите изображения и таблицы, которые будут созданы и включены в анализ. Выполните анализ, выбрав "Экспорт для всех».
  2. Таблицы экспортируются в закладке разделенных текстовых файлов и могут быть открыты в большинстве программ анализа данных.
  3. Когда анализ завершен, вид сегментации клеток и скоринга данных для изображений с высокой и низкой окрашивания для оценки точности настройки.
  4. Когда удовлетворены настройками, применить алгоритм, созданный из тренировочного набора изображений для всего набора изображений с помощью пакетного анализа. Нажмите на вкладку "Пакетный анализ" и открыт алгоритм будет скопирован из активного проекта.
  5. Выберите новый каталог для экспорта и выбрать изображения и TABLES должны быть включены в анализ. Под опцией входных файлов, выберите "Добавить изображения" и выберите все изображения, которые будут включены в пакетном анализе.
  6. Проведение анализа, выбрав опцию "Выполнить". Как и в случае анализа обучающей выборки, то этот шаг будет требовать различное время, в зависимости от конкретных параметров и количества изображений, включенных в анализ.
  7. После завершения перехода к вкладке "Обзор / слияния". Значения по умолчанию пакетный каталог в каталог экспорта из пакетного анализа и могут быть изменены при желании. Выберите "Включить все" и выберите "Объединить" для создания таблиц данных с помощью сводных данных для анализа.

8. Анализ экспортированных данных

  1. Открыть экспортируемые таблицы в области программного обеспечения для анализа данных и удалить или скрыть столбцы данных, которые не имеют отношения к анализу, например, минимальных и максимальных значений для каждого компонента. В качестве первичных данных в анализе находится в средней оптической плотности Column для каждого компонента.
  2. Обзор экспортироваться карты сегментации и необработанных изображений, чтобы определить, какие образцы или ядра ТМА должны быть исключены из анализа. Значения в процентах ткани помочь в определении, следует ли включать образец или нет, с произвольным обрезанию <5% наиболее часто используемых критериев исключения.
  3. Удалите ненужные данные или строки, содержащие образцы, которые будут исключены из анализа данных.
  4. Использование данных белков количественной оценки для исследования изменений в состоянии болезни или отношения с клинико-патологическими характеристиками заболевания 12,18-21.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

На рисунке 1, обучение проводится на ткани простаты к изображениям сегментов в эпителиальных и стромальных участках, наряду с отделением без ткани. При использовании эпителиальной мембраны маркер E-кадгерин, сегментации клеток проводили для разделения ядра, цитоплазмы и мембраны частей, показанных на рисунке 2.

В одном эксперименте мы использовали мультиплексированный IHC для исследования эксп...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Использование традиционных иммуногистохимии для оценки экспрессии белка ограничивается субъективными, полуколичественного методов анализа 22,23. Advance платформы были созданы для высокой пропускной способности анализа экспрессии биомаркеров и локализации. Подробный сегментация как ткани и субклеточных отсеков позволяет пользователям изучать экспрессию биомаркеров, локализации и совместной локализации с другими маркерами интерес. В предыдущих исследованиях мы показали полезность IHC и мультиспектральных изобр...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Авторы благодарят Университета штата Висконсин трансляционных исследований инициатив в лаборатории патологии, в частности при поддержке UW кафедры патологии и лабораторной медицины и грант UWCCC P30 CA014520, для использования его объектов и услуг.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
КсилолFisher ChemicalX3F1GALNFPA рейтинг: Здоровье – 2, Огонь – 3 , Реакционная способность – 0
Этиловый спирт-200 proofFisher Scientific4355223NFPA рейтинг: Здоровье – 0, Огонь – 3 , Реакционная способность – 0
Tris BaseFisher ScientificBP152-500NFPA рейтинг: Здоровье – 2, Огонь – 0 , Реактивность – 0
Трис гидроксиметиламинометан HClFisher ScientificBP153-1NFPA рейтинг: Здоровье – 2, Огонь – 0 , Реакционная способность – 0
Подросток 20Chem-Impex1512NFPA рейтинг: Здоровье – 0, Огонь – 1 , Реакционная способность – 0
Фосфатно-солевой буферFisher ScientificBP2944-100Рейтинг NFPA: Здоровье – 1, Огонь – 0 , Реактивность – 0
PeroxidazedBiocare MedicalPX968Избегайте попадания на кожу и в глаза. Может вызвать раздражение кожи и повреждение глаз.
Рецептор эстрогена альфаThermo Fisher Scientific-LabvisionRM9101Не классифицируется как опасный
Андрогенный рецепторSCBTsc-816Не классифицируется как опасный
CD147BiodesignP87535MНе классифицируется как опасный
E-кадгеринDakoM3612Не классифицируется как опасный
Renoir Red Andibody DiluentBiocare MedicalPD904Он специально разработан для работы с антителами на основе Tris
DeCloaking Chamber Biocare MedicalModel DC2002Примите обычные меры предосторожности при использовании скороварки
Barrier pen-Immuno Edge Vector LabsH-4000
Денатурирующий набор-Elution stepBiocare MedicalDNS001HНе классифицируется как опасный
Mach 2 Goat Anti-Rabbit HRP PolymerBiocare MedicalRHRP520Не классифицируется как опасный
Mach 2 Goat Anti-Rabbit AP PolymerBiocare MedicalRALP525Не классифицируется как опасный
Mach 2 Goat Anti-Mouse HRP PolymerBiocare MedicalM3M530Не классифицируется как опасный
бетазоид DAB Chromogen Kit BiocareMedicalBDB20041. Известно, что DAB является подозреваемым канцерогеном.
2. Не подвергайте компоненты DAB воздействию яркого света или прямых солнечных лучей.
3. Носите соответствующие средства индивидуальной защиты и одежду.
4. DAB может вызывать сенсибилизацию кожи. Избегайте попадания на кожу и в глаза.
5. Соблюдайте все федеральные, государственные и местные экологические нормы в отношении утилизации
Warp Red Chromogen KitBiocare MedicalWR806Corrosive. Кислота, которая может вызвать раздражение кожи или повреждение глаз.
Vina Green Chromogen KitBiocare MedicalBRR807Вреден при проглатывании
Bajoran Purple Chromogen KitBiocare MedicalBJP807Легковоспламеняющаяся жидкость. Беречь от источников тепла, пламени и искр. Вреден при проглатывании или всасывании. Избегайте попадания на кожу или в глаза, а также избегайте вдыхания.
Кошачий гематоксилинBiocare MedicalCATHEPurple   Решение   с   А   мягкая   уксусная   кислота   (уксус)   запах.   Май   be
  раздражающий   к   Скин   или   взор.   Избегайте   Контакты   с   Скин   и   взор.   Избегайте   проглатывание.
Монтажный носитель XYLRichard Allen8312-4NFPA рейтинг: Здоровье – 2, Пожар – 3 , Реакционная способность – 0
1.5 Покровные стеклаFisher Brand22266858Острые края
Инкубация (Влажность)КамераустаревшаяустаревшаяДоступно несколько поставщиков
Конвекционная печьStabil- ThermC-4008-Q
Предыстория Реагент для блокировки карателяBiocare MedicalBP974Этот продукт не классифицируется как опасный.
Программное обеспечениеinForm PerkinElmerCLS135781Программное обеспечение первичной мультиспектральной визуализации, используемое в рукописи
Программное обеспечение NuancePerkinElmerNuance EXПрограммное обеспечение, используемое для создания спектральных библиотек в рукописи
Vectra микроскоп и слайдовый сканер PerkinElmerVECTRAАвтоматизированный слайдовый сканер и микроскоп для получения кубов изображения IM3

Ссылки

  1. Valdman, A., et al. Expression of redox pathway enzymes in human prostatic tissue. Anal Quant Cytol Histol. 31 (6), 367-374 (2009).
  2. Rimm, D. L., Camp, R. L., Charette, L. A., Olsen, D. A., Provost, E. Amplification of tissue by construction of tissue microarrays. Exp Mol Pathol. 70 (3), 255-264 (2001).
  3. Jonmarker, S., et al. Expression of PDX-1 in prostate cancer, prostatic intraepithelial neoplasia and benign prostatic tissue. APMIS. 116 (6), 491-498 (2008).
  4. McCarty, K. S., Miller, L. S., Cox, E. B., Konrath, J., McCarty, K. S. Sr Estrogen receptor analyses. Correlation of biochemical and immunohistochemical methods using monoclonal antireceptor antibodies. Arch Pathol Lab Med. 109 (8), 716-721 (1985).
  5. Volante, M., et al. Somatostatin receptor type 2A immunohistochemistry in neuroendocrine tumors: a proposal of scoring system correlated with somatostatin receptor scintigraphy. Mod Pathol. 20 (11), 1172-1182 (2007).
  6. Muris, J. J., et al. Immunohistochemical profiling of caspase signaling pathways predicts clinical response to chemotherapy in primary nodal diffuse large B-cell lymphomas. Blood. 105 (7), 2916-2923 (2005).
  7. Jaraj, S. J., et al. Intra- and interobserver reproducibility of interpretation of immunohistochemical stains of prostate cancer. Virchows Arch. 455 (4), 375-381 (2009).
  8. Nakane, P. K., Pierce, G. B. Enzyme-labeled antibodies: preparation and application for the localization of antigens. J Histochem Cytochem. 14 (12), 929-931 (1966).
  9. Peters, T. J. Investigation of tissue organelles by a combination of analytical subcellular fractionation and enzymic microanalysis: a new approach to pathology. J Clin Pathol. 34 (1), 1-12 (1981).
  10. Emmert-Buck, M. R., et al. Laser Capture Microdissection. Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).
  11. Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. J Cell Biol. 185 (7), 1135-1148 (2009).
  12. Huang, W., Hennrick, K., Drew, S. A colorful future of quantitative pathology: validation of Vectra technology using chromogenic multiplexed immunohistochemistry and prostate tissue microarrays. Hum Pathol. 44 (1), 29-38 (2013).
  13. Rimm, D. L. C-Path: A Watson-Like Visit to the Pathology Lab. Science Translational Medicine. 3 (108), (2011).
  14. Fiore, C., et al. Utility of multispectral imaging in automated quantitative scoring of immunohistochemistry. J Clin Pathol. 65 (6), 496-502 (2012).
  15. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: A review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
  16. Rizzardi, A. E., et al. Quantitative comparison of immunohistochemical staining measured by digital image analysis versus pathologist visual scoring. Diagn Pathol. 7, 42(2012).
  17. Bauman, T. M., et al. Characterization of fibrillar collagens and extracellular matrix of glandular benign prostatic hyperplasia nodules. PLoS One. 9 (10), e109102(2014).
  18. Bauman, T. M., et al. Beta-catenin is elevated in human benign prostatic hyperplasia specimens compared to histologically normal prostate tissue. Am J Clin Exp Urol. 2 (4), 313-322 (2014).
  19. Bauman, T. M., Ewald, J. A., Huang, W., Ricke, W. A. CD147 expression predicts biochemical recurrence after prostatectomy independent of histologic and pathologic features. BMC Cancer. 15 (1), 549(2015).
  20. Bauman, T. M., et al. Finasteride treatment alters tissue specific androgen receptor expression in prostate tissues. Prostate. 74 (9), 923-932 (2014).
  21. Nicholson, T. M., Sehgal, P. D., Drew, S. A., Huang, W., Ricke, W. A. Sex steroid receptor expression and localization in benign prostatic hyperplasia varies with tissue compartment. Differentiation. 85 (4-5), 140-149 (2013).
  22. Taylor, C. R., Levenson, R. M. Quantification of immunohistochemistry--issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment II. Histopathology. 49 (4), 411-424 (2006).
  23. Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomark Insights. 5, 9-20 (2010).
  24. Kononen, J., et al. Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens. Nat Med. 4 (7), 844-847 (1998).
  25. Ong, C. W., et al. Computer-assisted pathological immunohistochemistry scoring is more time-effective than conventional scoring, but provides no analytical advantage. Histopathology. 56 (4), 523-529 (2010).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Мультиплексный иммуногистохимический анализколичественное определение экспрессии белкованализ колокализации белковалгоритм сегментации тканейсоздание спектральной библиотекиметоды детектирования хромогеновавтоматизированный сбор изображенийанализ субклеточных компартментовисследование биомаркеров в тканях
Количественное экспрессии белка и совместной локализации Использование Multiplexed иммуногистохимическое окрашиванием и мультиспектральных визуализации
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.