Method Article

Количественное экспрессии белка и совместной локализации Использование Multiplexed иммуногистохимическое окрашиванием и мультиспектральных визуализации

DOI:

10.3791/53837

⸱

April 8th, 2016

 ,  ,  ,  , 
1Division of Urologic Surgery, Washington University in St. Louis School of Medicine, 2Department of Urology, University of Wisconsin School of Medicine and Public Health, 3Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of Wisconsin School of Medicine and Public Health, 4O’Brien Urology Research Center, University of Wisconsin School of Medicine and Public Health

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Иммуногистохимия — это мощный лабораторный метод для оценки локализации и экспрессии белков в тканях. Современные полуавтоматические методы количественной оценки вносят субъективность и часто приводят к невоспроизводимым результатам. В данной работе мы описываем методы мультиплексной иммуногистохимии и объективного количественного определения экспрессии и колокализации белков с использованием мультиспектральной визуализации.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Иммуногистохимия — это широко используемый клинический и исследовательский лабораторный метод обнаружения для изучения экспрессии и локализации белков в тканях. Для оценки экспрессии с помощью иммуногистохимии было разработано множество полуколичественных систем, но присущая ей субъективность ограничивает воспроизводимость и точность результатов. Кроме того, исследование пространственно перекрывающихся биомаркеров, таких как ядерные факторы транскрипции, затруднено с помощью современных методов иммуногистохимии. Нами разработана и оптимизирована система для одновременного исследования нескольких белков с использованием высокопроизводительных методов мультиплексной иммуногистохимии и мультиспектральной визуализации. Мультиплексная иммуногистохимия проводится путем последовательного применения первичных антител вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена или щелочной фосфатазой. Для обнаружения каждого интересующего белка используются различные хромогены. Окрашенные слайды загружаются в автоматизированный сканер слайдов, и создается протокол для автоматического получения изображений. Спектральная библиотека создается путем окрашивания набора слайдов одним хромогеном на каждом. Подмножество репрезентативных окрашенных изображений импортируется в программное обеспечение для мультиспектральной визуализации, а алгоритм для различения типов тканей создается путем определения тканевых компартментов на изображениях. Субклеточные компартменты сегментируются с помощью гематоксилинового контрокрашивания и корректировки собственного алгоритма. Пороговое определение применяется для определения положительности и совместной локализации белка. Окончательный алгоритм затем применяется ко всему набору тканей. Полученные данные позволяют пользователю оценить экспрессию белка на основе типа ткани (например, эпителия или стромы) и субклеточного компартмента (ядро, цитоплазма или плазматическая мембрана). Ко-локализационный анализ позволяет исследовать двойные положительные, двойные отрицательные и одиночные положительные типы клеток. Сочетание мультиспектральной визуализации с мультиплексной иммуногистохимией и автоматическим получением изображений является объективным высокопроизводительным методом исследования биомаркеров в тканях.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Иммуногистохимия (IHC) является стандартным методом лаборатории для обнаружения белка в ткани, и IHC до сих пор широко используется в обоих исследованиях и диагностике патологий. Оценка IHC окрашивания часто полуколичественный, представляя потенциальную систематическую ошибку в интерпретации результатов. Многие Полуколичественные подходы были разработаны , которые включают как интенсивность окрашивания и окрашивания степени в окончательный диагноз 1-4. Другие системы включают балльной интенсивности и субклеточном положение для того , чтобы лучше локализовать выражение 5. Включение средних баллов из нескольких зрителей часто используется дл....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Примечание: Протокол здесь , описывает окрашивание и анализ микрочипов ткани (TMA), описанный ранее 12,17,18. Толстая секция ТМА 4 мкм, была получена из парафинового блока с использованием стандартного микротом.

Примечание: Спектральный библиотека для 4 хромогенами и контрастирующая должны быть созданы для количественной оценки изображения. Для того чтобы сделать это, оптимизированный протокол для каждого отдельного антитела должны работать с одним антителом на слайд, за вычетом окончательной контрастирующая. Пятый слайд должен быть окрашивали гематоксилином, чтобы генерировать 5 изображений, необходимых для создания спектральной библиотеки.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

На рисунке 1, обучение проводится на ткани простаты к изображениям сегментов в эпителиальных и стромальных участках, наряду с отделением без ткани. При использовании эпителиальной мембраны маркер E-кадгерин, сегментации клеток проводили для разделения ядра, цитоплазмы и мембраны частей, показанных на рисунке 2.

В одном эксперименте мы использовали мультиплексированный IHC для исследования эксп.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Использование традиционных иммуногистохимии для оценки экспрессии белка ограничивается субъективными, полуколичественного методов анализа 22,23. Advance платформы были созданы для высокой пропускной способности анализа экспрессии биомаркеров и локализации. Подробный сегментация как ткани и субклеточных отсеков позволяет пользователям изучать экспрессию биомаркеров, локализации и совместной локализации с другими маркерами интерес. В предыдущих исследованиях мы показали полезность IHC и мультиспектральных изобр.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы благодарят Университета штата Висконсин трансляционных исследований инициатив в лаборатории патологии, в частности при поддержке UW кафедры патологии и лабораторной медицины и грант UWCCC P30 CA014520, для использования его объектов и услуг.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
КсилолFisher ChemicalX3F1GALNFPA рейтинг: Здоровье – 2, Огонь – 3 , Реакционная способность – 0
Этиловый спирт-200 proofFisher Scientific4355223NFPA рейтинг: Здоровье – 0, Огонь – 3 , Реакционная способность – 0
Tris BaseFisher ScientificBP152-500NFPA рейтинг: Здоровье – 2, Огонь – 0 , Реактивность – 0
Трис гидроксиметиламинометан HClFisher ScientificBP153-1NFPA рейтинг: Здоровье – 2, Огонь – 0 , Реакционная способность – 0
Подросток 20Chem-Impex1512NFPA рейтинг: Здоровье – 0, Огонь – 1 , Реакционная способность – 0
Фосфатно-солевой буферFisher ScientificBP2944-100Рейтинг NFPA: Здоровье – 1, Огонь – 0 , Реактивность – 0
PeroxidazedBiocare MedicalPX968Избегайте попадания на кожу и в глаза. Может вызвать раздражение кожи и повреждение глаз.
Рецептор эстрогена альфаThermo Fisher Scientific-LabvisionRM9101Не классифицируется как опасный
Андрогенный рецепторSCBTsc-816Не классифицируется как опасный
CD147BiodesignP87535MНе классифицируется как опасный
E-кадгеринDakoM3612Не классифицируется как опасный
Renoir Red Andibody DiluentBiocare MedicalPD904Он специально разработан для работы с антителами на основе Tris
DeCloaking Chamber Biocare MedicalModel DC2002Примите обычные меры предосторожности при использовании скороварки
Barrier pen-Immuno Edge Vector LabsH-4000
Денатурирующий набор-Elution stepBiocare MedicalDNS001HНе классифицируется как опасный
Mach 2 Goat Anti-Rabbit HRP PolymerBiocare MedicalRHRP520Не классифицируется как опасный
Mach 2 Goat Anti-Rabbit AP PolymerBiocare MedicalRALP525Не классифицируется как опасный
Mach 2 Goat Anti-Mouse HRP PolymerBiocare MedicalM3M530Не классифицируется как опасный
бетазоид DAB Chromogen Kit BiocareMedicalBDB20041. Известно, что DAB является подозреваемым канцерогеном.
2. Не подвергайте компоненты DAB воздействию яркого света или прямых солнечных лучей.
3. Носите соответствующие средства индивидуальной защиты и одежду.
4. DAB может вызывать сенсибилизацию кожи. Избегайте попадания на кожу и в глаза.
5. Соблюдайте все федеральные, государственные и местные экологические нормы в отношении утилизации
Warp Red Chromogen KitBiocare MedicalWR806Corrosive. Кислота, которая может вызвать раздражение кожи или повреждение глаз.
Vina Green Chromogen KitBiocare MedicalBRR807Вреден при проглатывании
Bajoran Purple Chromogen KitBiocare MedicalBJP807Легковоспламеняющаяся жидкость. Беречь от источников тепла, пламени и искр. Вреден при проглатывании или всасывании. Избегайте попадания на кожу или в глаза, а также избегайте вдыхания.
Кошачий гематоксилинBiocare MedicalCATHEPurple   Решение   с   А   мягкая   уксусная   кислота   (уксус)   запах.   Май   be
  раздражающий   к   Скин   или   взор.   Избегайте   Контакты   с   Скин   и   взор.   Избегайте   проглатывание.
Монтажный носитель XYLRichard Allen8312-4NFPA рейтинг: Здоровье – 2, Пожар – 3 , Реакционная способность – 0
1.5 Покровные стеклаFisher Brand22266858Острые края
Инкубация (Влажность)КамераустаревшаяустаревшаяДоступно несколько поставщиков
Конвекционная печьStabil- ThermC-4008-Q
Предыстория Реагент для блокировки карателяBiocare MedicalBP974Этот продукт не классифицируется как опасный.
Программное обеспечениеinForm PerkinElmerCLS135781Программное обеспечение первичной мультиспектральной визуализации, используемое в рукописи
Программное обеспечение NuancePerkinElmerNuance EXПрограммное обеспечение, используемое для создания спектральных библиотек в рукописи
Vectra микроскоп и слайдовый сканер PerkinElmerVECTRAАвтоматизированный слайдовый сканер и микроскоп для получения кубов изображения IM3

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Valdman, A., et al. Expression of redox pathway enzymes in human prostatic tissue. Anal Quant Cytol Histol. 31 (6), 367-374 (2009).
  2. Rimm, D. L., Camp, R. L., Charette, L. A., Olsen, D. A., Provost, E. Amplification of tissue by construction of tissue microarrays. E....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Multiplexed ImmunohistochemistryMultispectral ImagingProtein Expression QuantitationProtein Co localization AnalysisTissue Segmentation AlgorithmSpectral Library CreationChromogen Detection MethodsAutomated Image AcquisitionSubcellular Compartment AnalysisBiomarker Investigation Tissues

Related Articles