Развитие Лиофилизированный Loop опосредованных изотермических реагенты для амплификации для обнаружения Coxiella burnetii

Summary

Мы описали здесь простой метод петлевой изотермической амплификации (LAMP) с использованием лиофилизированных реагентов для обнаружения C. burnetii в образцах пациентов.

Abstract

Coxiella burnetii, агент , вызывающий лихорадку Q, является облигатным внутриклеточным бактерии. ПЦР - диагностические анализы , основанные были разработаны для обнаружения C. burnetii ДНК в клеточных культурах и клинических образцах. ПЦР требует специального оборудования и обширный обучение пользователей, и, следовательно, он не подходит для рутинной работы, особенно в ограниченных ресурсов области. Мы разработали цикл опосредованной изотермические амплификации (LAMP) анализа для обнаружения присутствия C. burnetii в образцах пациентов. Этот способ осуществляют при одной температуре около 60 ° С на водяной бане или нагревательном блоке. Чувствительность этой лампы анализа очень похож на ПЦР с пределом обнаружения около 25 копий на реакцию. Этот отчет описывает получение реакции с использованием лиофилизованных реагентов и визуализации результатов с использованием hydroxynaphthol синего (HNB) или УФ-лампы с люминесцентным интеркалирующего красителя в реакции. Лампа реагенты lyophiliзет и хранили при комнатной температуре (КТ) в течение одного месяца без потери чувствительности обнаружения. Эта лампа анализ особенно эффективен потому, что препарат реакционной смеси не включает в себя сложные шаги. Этот метод идеально подходит для использования в условиях ограниченных ресурсов, где Q лихорадка является эндемическим заболеванием.

Introduction

Небольшой грамотрицательная бактерия Coxiella burnetii является возбудителем лихорадки Ку, который является во всем мире зоонозов. В связи с распространением по всему миру лихорадки Ку и высокой инфекционности C. burnetii, американские военные и гражданский персонал , развернутые за рубежом находятся под угрозой заражения в эндемичных районах.

Q лихорадка проявляется в двух формах: острых и хронических инфекций. Острый Q-лихорадка представляет себя с симптомами гриппа, гепатита или пневмонии, и, как правило, самоограничения заболевание с низкой смертностью. Хронический Q-лихорадка, в то время как менее распространены, часто приводит к эндокардит, который имеет гораздо более высокий уровень смертности при отсутствии лечения ^1,2. Таким образом, ранняя диагностика, чтобы направлять соответствующее лечение имеет решающее значение для ухода за пациентами. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и количественный ПЦР в реальном времени (КПЦР) анализы были разработаны для обнаружения C. burnetii ДНК в клеточных культурах и клинических образцах ^{3-5 <}/ SUP>. Оба ПЦР и КПЦР являются дорогостоящими и часто не легко доступны в условиях ограниченных ресурсов областей для рутинной работы.

Первоначально описанный Notomi ^6, петля-опосредованной изотермические амплификации (LAMP) предлагает альтернативный метод амплификации ДНК. ЛАМПА использует Bst ДНК - полимеразы для синтеза ДНК замещения цепи вместе со специально разработанными наборов праймеров , которые распознают по меньшей мере , шесть независимых областей гена - мишени. Наиболее важным преимуществом является то, что ЛАМПА усиление происходит в изотермических условиях. Таким образом, только на водяной бане, нагревательный блок или инкубатор требуется. Этот метод был использован для обнаружения нескольких риккетсиозные патогены ^7-9. Визуализация продуктов амплификации ДНК с помощью гель-электрофореза является наиболее точным методом, который может отличить истинные срабатываний от ложных срабатываний за счет неспецифической амплификации. Однако процедуры, связанные с гель-электрофореза не практичны для ограниченных ресурсов арEAS. Было разработано несколько альтернативных методов для обнаружения продуктов реакции. Эти альтернативные, такие как помутнение полученный из формации пирофосфат магния ¹⁰ или с использованием флуоресцентного красителя интеркалирования быть визуализированы под действием УФ - света ^11,12 являются более благоприятными , чем при запуске геля. Лампа реагенты были стабильны в течение одного месяца при хранении при температуре 25 ° C и 37 ° C, которые являются температура окружающей среды в тропических и субтропических странах , где Q лихорадка является эндемическим ^13.

Пробирного лампа была разработана в нашей лаборатории , чтобы обнаружить присутствие C. burnetii в образцах ¹⁴ плазмы. Здесь мы опишем простой протокол для приготовления реакционной смеси в количестве от ЛАМПА лиофилизированных реагентов. Лиофилизированные реагенты стабильны в течение одного месяца при хранении при комнатной температуре. В сочетании с легким методом визуализации, это идеальный способ , чтобы использовать для обнаружения C. burnetii в установлении ограниченных ресурсов.

Protocol

1. Подготовить плазмидной ДНК разведений в качестве стандарта для LAMP-реакции

1. С помощью спектрофотометра для измерения оптической плотности (OD) при 260 нм , чтобы определить плазмиду (содержащую гена - мишени IS1111a 493 С. burnetii RSA) концентрации ДНК. OD ₂₆₀ 1 приравнивает до 50 мкг / мкл ДНК.
2. Преобразование количества плазмидной ДНК в количестве копий. Поскольку размер плазмиды составляет 6330 п.н., молекулярная масса этой плазмиды 4,1 х 10 ⁶ г (6330 п.о. х 649 г / BP). Концентрацию ДНК плазмиды составляет 34,2 нг / мкл (как определено из шага 1.1). 1 мкл этого образца ДНК содержит 34,2 нг ДНК плазмиды, приравнивая к 5 × 10 ⁹ копий (34,2 х 10 ^-9 г / 4,1 х 10 ⁶ Gx 6,02 × 10 ²³⁾ ДНК.
3. Добавить 10 мкл ДНК плазмиды (5 × 10 ⁹ копий / мкл) в 90 мкл воды в течение 10-кратного разведения , чтобы сделать образец ДНК из 5 х 10 ⁸ копий / мкл,
4. Повторите шаг 1.3 подготовить образцы ДНК 5 х 10 ^7, 5 × 10 ^6, 5 × 10 ^5, 5 × 10 ^4, 5 × 10 ^3, 5 х 10 ^2, 5 х 10 ^1, и 5 х 10 ⁰ копий / мкл.

2. Подготовка шаблона ДНК из образцов для LAMP-реакции

1. Выполните извлечение ДНК из образцов плазмы крови человека с использованием коммерческого набора ДНК мини в соответствии с протоколом производителя. Используйте в общей сложности 200 мкл образца для экстракции и элюции извлеченную ДНК в объеме 20 мкл.

3. Подготовьте 2x буфера ЛАМПА Реакция

1. Смешайте 200 мкл 10 - кратного буфера для Pol, 320 мкл 5 М триметилглицина, 12 мкл 1 М MgSO _4, 280 мкл смеси дНТФ (10 мМ каждый) и 188 мкл воды , чтобы 1 мл буфера 2х лампы. Смешайте импульсно-встряхиванием в течение 10 сек.

4. Выполните стандартную лампу Реакция

1. Смешайте 12,5 мкл 2x LAБуфер МП (как полученного на стадии 3, 40 мМ Трис-HCl (рН 8,8), 20 мМ КСl, 16 мМ MgSO _4, 20 мМ (NH _{4) 2} SO _4, 0,2% Тритон Х-100, 1,6 М триметилглицин, 1,4 мМ дНТФ смесь), 1,2 мкл смеси праймера, 1 мкл ДНК - полимеразы Bst (8 ед / мкл) и 5,3 мкл воды для приготовления реакционной смеси (20 мкл) в 0,2 мл ПЦР - пробирку.
2. Добавьте 5 мкл ДНК (со стадии 1 или 2) в 20 мкл реакционной смеси и хорошо перемешать.
3. Закрыть трубки и инкубировать при 60 ° С в течение 60 мин на водяной бане или нагревательном блоке. Это оптимальная температура реакции определяется ранее.
4. Добавьте 5 мкл 10х гель загрузочного буфера для остановки реакции.
5. Нагрузка 5 мкл продуктов реакции в агарозном геле 2%, окрашенном интеркаляции пятно нуклеиновой кислоты.
6. Выполнить гель при 100 В в течение 35 мин в буфере 1x КЭ.
7. Визуализируйте результаты от УФ-излучения.

5. Выполните ЛАМПЫ реакции с водостойкихРеагенты

1. Смешайте 125 мкл 10 - кратного буфера для Pol 200 мкл 5 М триметилглицина, 7,5 мкл 1 М MgSO _4, 667,5 мкл воды , чтобы 1 мл восстанавливающий буфер. Смешайте импульсно-встряхиванием в течение 10 сек.
2. Снимите трубки, которые содержат лиофилизированные реагенты из запечатанном пакете из алюминиевой фольги. Не следует использовать трубы, если мешок алюминиевой фольги не запечатан или если он поврежден.
3. Добавьте 20 мкл восстанавливающий буфер в каждую пробирку, чтобы повторно приостанавливать лиофилизированные реагенты.
4. Смешайте с помощью пипетки буфера вверх и вниз 5 раз. Посмотрите, чтобы убедиться, что лиофилизированные реагенты полностью ресуспендировали. Белый порошок должен исчезнуть в трубке.
5. Добавьте 5 мкл ДНК-матрицы (от стадии 1 или 2) реконструированных реагентов и хорошо перемешать.
6. Закрыть трубки и инкубировать при 60 ° С в течение 60 мин на водяной бане или нагревательном блоке.
7. Добавьте 5 мкл 10х гель загрузочного буфера для остановки реакции.
8. Нагрузка 5 мкл реакцииПродуктами агарозном геле 2%, окрашенном интеркаляции пятно нуклеиновой кислоты.
9. Выполнить гель при 100 В в течение 35 мин в буфере 1x КЭ.
10. Визуализируйте результаты от УФ-излучения.

6. Выполните ЛАМПЫ реакции с Воссоздание буфером, содержащим HNB или флуоресцентная интеркалирования Dye

1. Смешайте 125 мкл 10х Pol буфера, 200 мкл 5 М триметилглицина, 7,5 мкл 1 М MgSO _4, 7,5 мкл 20 мМ HNB (или 12,5 мкл 100x флуоресцентного интеркалирующего красителя) и 660 мкл (или 655 мкл) , воды для составляют 1 мл восстанавливающей буфера. Смешайте импульсно-встряхиванием в течение 10 сек.
2. Используйте водостойких буфер, приготовленный в разделе 6, чтобы повторить шаги 5.2 - 5.6.
3. Визуализируйте результаты невооруженным глазом (реакционной смеси, содержащей HNB) или УФ-света (реакционной смеси, содержащей флуоресцентный краситель интеркалирования).

7. Выполнить в режиме реального времени ЛАМПЫ реакции с сканера Tube

1. Добавьте 5 мкл ДНК к reconstitutе изд реагенты, содержащие флуоресцентный краситель интеркалирования, закройте трубку и вставить его к сканеру трубки.
2. Заданная температура инкубации при 60 ° С. Измерение флуоресценции при длине волны 520 нм в течение 60 мин.

Results

Лиофилизированные ЛАМПЫ реагенты внутри 0,2 мл трубки содержит Bst ДНК - полимеразы, праймеров и дНТФ. 20 мкл восстанавливающий буфер используется для повторной приостанавливают лиофилизированные реагенты. На рисунке 1 показаны результаты реакции лампа на агарозном геле с свежеприготовленными реагентами и лиофилизированных реагентов. Лиофилизированный реагент не снижает его активность. ЛАМПА реакции , полученные обоими реагентами может обнаружить 25 копий ДНК ша...

Discussion

Ранее мы разработали чувствительный и специфический анализ ЛАМПЫ таргетирования вставки элемента IS1111a ^14. Элемент IS1111 был выбран потому , что он высоко консервативна среди различных штаммов C. burnetii и его высокое число копий ( от 7 до 110) в бактериях (Кли 2006). Наши результаты показали , что ЛАМПА может обнаружить около 25 копий IS1111 элемента, который может коррелировать до всего лишь одной хромосомной копии Coxiella ДНК. В этом исследовании, Bst

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
LAMP праймеры	Eurofins MWG operon	10 нмоль, бессолевые Последовательность	разработана заказчиком
Bst ДНК-полимераза	New England Biolabs	M0275L	8 единиц/мл
10x Термо пол буфер	Новая Англия Biolabs	B9004S
dNTP смесь	New England Biolabs	N0447L	10 мМ каждый Бетаин
	Sigma-Aldrich	B0300	5 М, Триметилглицин
Сульфат магния	Sigma-Aldrich	M3409-1ML	1 м
10x Bluejuice	Invitrogen	10816-015	гелевый загрузочный буфер
SYBR зеленый	Invitrogen	S7585	10,000x, визуализировать продукты в тубах
GelRed	Phenix Research Products	RGB-4103	10,000x, визуализировать продукты в гелях
Лиофилизированные реагенты	Gene Reach
Гидроксинафтол синий	Fluka	33936-10G
ESEКуантный сканер трубок	Qiagen		для обнаружения в реальном времени