Amplification, следующего поколения Секвенирование и геномную ДНК Mapping ретровирусных интеграции сайты

Summary

Мы описываем протокол для амплификации сайтов интеграции ретровирусной инфекции из геномной ДНК инфицированных клеток, секвенирования амплифицированных соединений вирус-хозяин, а затем картирования этих последовательностей на референсный геном. Мы также описываем методы количественной оценки распределения сайтов интеграции относительно различных геномных аннотаций с помощью BEDTools.

Abstract

Ретровирусы проявляют предпочтения интеграции подписи на местном и глобальном масштабах. Здесь мы представляем подробный протокол для (1) генерации различных библиотек ретровирусных сайтов интеграции с использованием лигирования-опосредованной PCR (LM-ПЦР) и следующего поколения секвенирования (NGS), (2), отображающую геномную расположение каждого вирусоподобные принимающей узел с использованием BEDTools, и (3) анализ данных для статистической значимости. Геномную ДНК, выделенную из инфицированных клеток, раздроблена перевариванием ферментами рестрикции или с помощью ультразвука. После того, как подходящий ДНК конечного ремонта двухцепочечную линкеры лигировали на концы ДНК, и полупрозрачные, гнездовую ПЦР проводят с использованием праймеров, комплементарных как длинный концевой повтор (LTR), конец вируса и сшита ДНК линкера. ПЦР-праймеры несут последовательности, необходимые для кластеризации ДНК во время NGS, отрицая требование для отдельного адаптера перевязки. Контроль качества (QC) проводится с целью оценки распределения размера фрагмента ДНК и адаптироватьэр включение ДНК до начала NGS. Выходные файлы последовательности фильтруются для LTR-содержащих читает, и последовательности, определяющие LTR и компоновщик обрезаются прочь. Обрезанные последовательности клеток-хозяев отображаются на референсный геном с использованием BLAT и фильтруются для минимально 97% идентичности к единственной точке, в эталонном геноме. Уникальные сайты интеграции тщательно изучаются для смежных нуклеотидов (нт) последовательности и распределения по отношению к различным геномных особенностей. Используя этот протокол, библиотеки интеграции сайтов высокой сложности могут быть построены из геномной ДНК в течение трех дней. Таким образом, весь протокол, который включает в себя экзогенный вирусная инфекция клеток восприимчивых тканевых культур к анализу интеграции сайта может быть проведена в приблизительно одной до двух недель. Последние применения этой технологии относятся к продольной анализу интеграционных участков от ВИЧ-инфицированных пациентов.

Introduction

Интеграция вирусной ДНК (vDNA) в геном клетки-хозяина является важным шагом в жизненном цикле ретровирусов. Интеграция осуществляется с помощью вирусного фермента интегразы (IN), которая осуществляет два различных каталитических процессов , которые приводят к созданию стабильно вставленной провирусом ^1. В субъединицы участвовать концы линейного vDNA , который генерируется с помощью обратной транскрипции, образуя intasome высшего порядка с vDNA концы скрепляются с помощью IN мультимеров ^2-4. В расщепляет 'концы vDNA вниз по течению от инвариантных 5'-СА-3' 3 последовательностей в процессе , известном как 3'-обработки, в результате....

Protocol

1. Сформировать запасов вируса

Примечание: Блок - схема мокрого стендовых аспекту данного протокола показан на рисунке 1 Детали вирусной животноводческой продукции и последующей инфекции культуры ткани клеток, как правило , относятся к различным видам ретровирусов.. Для некоторых экспериментов, клетка - мишень не может выразить эндогенный вирусный рецептор (ы), и в таких случаях строительство pseudotyped ретровирусных частиц , несущих гетерологичные вирусный гликопротеин оболочки, например, G гликопротеин от вируса везикулярного стоматита (VSV-G), будет требуется для инфекции ^44,45.

Results

В таблице 4 приведены результаты типичного эксперимента , чтобы проиллюстрировать чувствительность NGS для восстановления интеграции сайтов из культуры инфицированных клеток. Незараженных клеточной ДНК использовали для серийно разбавленных геномную ДНК от инфекции , в которой каждая ячейка в среднем содержала один интеграции ^40. Разведения были подготовлены на этапах от пяти до максимального разведении 1: 15625. Геномную ДНК в серии титрование затем фрагментир.......

Discussion

Протокол для анализа ретровирусных сайтов интеграции, от начальной стадии вирусной инфекции с помощью картирования геномных схем распределения, описан. Этот протокол применим к любому ретровируса и любого заражае- типа клеток. Кроме того, трубопровод анализа весьма чувствителен, с потенциалом , чтобы восстановить удовлетворительное количество уникальных сайтов интеграции с серийными разведениями геномного эквивалента ДНК , что инфекции , инициированного с MOI 6,4 х 10 ^-5. Эта чувствительность делает протокол .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Gibco	11965-084	Стандартная среда для культивирования клеток, совместимая с клетками
HEK293T Фетальная бычья сыворотка	Thermo Scientific	SH 30088.03	Может потребоваться предварительный скрининг различных партий сыворотки для оптимальной вирусной продукции
Пенициллин/стрептомицин	Corning	30-002-Cl	Антибиотики для добавления в DMEM
Фосфат-буферизованный физиологический раствор	Mediatech	21-040-CV	Используется для промывания клеток
Trypsin EDTA	Corning	25-053-CI	Используется для отделения адгезивных клеток от планшетов для культуры тканей
PolyJet	SignaGen Laboratories	SL100688	реагентом для трансфекции ДНК
0,45 &; m Фильтры	Thermo Scientific	09-740-35B	Используются для фильтрации вируссодержащих частиц клеточных культур
Turbo DNase	Ambion	AM2239	Используются для разложения переносимой плазмидной ДНК из вирусных акций
HIV-1 p24 Antigen Capture Assay	ABL Inc.	5447	Используется для количественной оценки выхода производства вируса
DNeasy Blood & Набор для салфеток	Qiagen	69506	Используется для очистки геномной ДНК из клеток
Ультразвуковой аппарат	Covaris	S2	С помощью этой модели ультразвукового аппарата выполняются два цикла заполнения, 5%; интенсивность, 3; циклы на всплеск, 200; время, 80 секунд
Безнуклеазная вода	GeneMate	G-3250-125	Коммерчески доступная вода рекомендуется для снижения вероятности перекрестного загрязнения образцов
QIAQuick PCR Purification Набор	Qiagen	28106	Используется для очистки ДНК во время создания библиотеки
End-It DNA End-End Repair Kit	Epicentre	ER81050	Используется для восстановления концов ДНК образцов ДНК, обработанных ультразвуком
, Klenow Fragment (3'-5' exo–)	New England Biolabs (NEB)	M0212S	Используется с dATP для репарированных фрагментов ДНК A-tail
dATP	Thermo Scientific	R0141	Дезоксиаденозинтрифосфат
MseI	NEB	R0525L	Эндонуклеаза рестрикции для расщепления геномной ДНК
BglII	NEB	R0144L	Эндонуклеаза рестрикции для подавления амплификации восходящей последовательности HIV-1 U5
T4 DNA Ligase	NEB	M0202L/6218	Фермент для ковалентного соединения совместимых концов
ДНК Олигонуклеотиды ДНК	Интегрированные технологии ДНК	на заказ	Попросите компанию очистить олигонуклеотиды. Достаточно очистки ВЭЖХ для ДНК < 30 нуклеотидов; ПЕЙДЖ более длинные ДНК
Преимущество 2 Полимеразная смесь	Clontech	639202	Коммерческая смесь, содержащая ДНК-полимеразу для ПЦР
dNTP (100 мМ растворы)	Thermo Scientific	R0181	Разбавьте четыре химических вещества на льду стерильной водой до достижения промежуточных концентраций 2,5 мМ каждое dNTP
NanoDrop Thermo	Scientific	NanoDrop 2000	Spectrophotometer для определения концентрации ДНК
Флуориметр Qubit	Life Technologies	Qubit® 3.0	Флуориметр, используемый для подтверждения концентрации ДНК библиотеки сайтов интеграции
2200 Система TapeStation	Agilent	G2964AA	Ленточный анализ для подтверждения распределения размеров ДНК библиотеки сайтов
интеграции MiSeq	Illumina	SY-410-1003	Используется для NGS