Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Высокая пропускная способность CRISPR Конструирование вектора и характеристика ДНК Модификации генерацией Томатный волосистых корней

17.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53843

⸱

30 апреля 2016 г.

 , 
1Boyce Thompson Institute for Plant Research, 2Section of Plant Pathology & Plant-Microbe Biology, School of Integrative Plant Science, Cornell University

В этой статье

Краткое содержание

Используя сборку ДНК, несколько векторов CRISPR могут быть построены параллельно в одной реакции клонирования, что делает строительство большого числа CRISPR векторов простую задачу. Томатные волосатые корни отличная модель системы для проверки CRISPR векторов и генерировать мутантные материалы.

Аннотация

Целевые мутации ДНК, сгенерированные векторами с кластеризованными регулярно чередующимися короткими палиндромными повторами (CRISPR)/технологией Cas9, оказались полезными для исследований функциональной геномики. Несмотря на то, что большинство стратегий клонирования просты в исполнении, они, как правило, состоят из нескольких этапов и могут потребовать несколько дней для создания окончательных конструкций. Представленный здесь метод основан на сборке ДНК и может производить полнофункциональные векторы CRISPR за одну реакцию клонирования. Векторное построение также может быть объединено, что еще больше повышает эффективность и полезность процесса. Модификация метода используется для создания векторов CRISPR с несколькими генами-мишенями. Затем векторы CRISPR преобразуются в волосатые корни томата для получения трансгенных материалов с целевыми модификациями ДНК. Волосатые корни являются полезной системой для тестирования функциональности векторов, поскольку они технически просты в создании и поддаются крупномасштабному производству. Представленные здесь методы будут иметь широкое применение, поскольку они могут быть использованы для создания различных векторов CRISPR и использоваться для широкого спектра видов растений.

Введение

Способность генерировать адресные модификации ДНК с CRISPR / cas9 имеет большой потенциал для функциональной геномики исследований. Есть два компонента системы CRISPR / cas9; cas9 нуклеазы, полученный из Staphylococcus Пирролидонилпептидаза и приблизительно 100-нт руководство РНК (gRNA) молекулы , которая направляет cas9 на сайт целевой ДНК (ов) 1. Целевой показатель признания присуждается первым ~ 20-нт из gRNA, что позволяет продукции с высокой пропускной способностью адресности векторов 2,3. Большинство организмов , которые могут быть созданы, уже были с CRISPR технологии / cas9 4,5.

В растениях, конститутивные промоторы, такие как промотор CaMV 35S, которые обычно используются для управления экспрессией в cas9 нуклеазы 6. В gRNAs выражаются с помощью РНК-полимеразы III U6 или промоторы U3, который ограничивает первую базу gRNA либо к G, для U6 или для У3, для эффективной транскрипции. Однако РНК-полимеразы II выпускного вечераoters, которые свободны от этих ограничений, также были использованы 7,8.

Различные gRNAs вызывают мутации ДНК с различной эффективностью, и поэтому он может быть важно сначала проверить CRISPR векторов, прежде чем инвестировать в преобразования целого растения или создание обширных фенотипические экранов. Переходная экспрессия CRISPR конструкций в растениях, используя агроинфильтрации например, как правило , приводит к более низкой частоте модификации ДНК по сравнению с устойчивыми растениями 6, что делает обнаружение мутаций трудно и фенотипических анализов непрактичными с такими подходами. Так называемые волосатых корней являются удобной, альтернативная система, так как большое число независимых, стабильно трансформированных материалов могут быть получены в течение нескольких недель, в отличие от месяцев для стабильных растений. CRISPR векторы очень эффективны при индукции мутаций ДНК в волосатых корней 9,10.

методы сборки ДНК эффективно лигирования фрагменты ДНК, содержащие overlapping заканчивается 11. Основным преимуществом некоторых методов сборки ДНК является способность включать оцДНК (т.е. олиго) в собранных продуктах. Так как gRNAs только ~ 20-нт долго и новые цели могут быть сделаны с синтезированных олигонуклеотидов, эти методы сборки ДНК хорошо подходят для CRISPR клонирования. Протоколы , описанные здесь , основаны на P201 серии CRISPR векторов, которая успешно используется в сое 10, 12 тополя и теперь помидор. Процедура клонирования представлены предлагает несколько преимуществ по сравнению с текущим методом клонирования 10. А именно, полностью функциональные векторы могут быть получены в одной реакции клонирования в течение одного дня. Вектор строительства также могут быть объединены для создания нескольких векторов CRISPR параллельно, дальнейшее сокращение практического времени и материальных затрат. Мы также приводим протокол для генерации томатных волосатых корней как эффективный способ для получения трансгенных материалов с целевым делеции гена. Волосатые корни используются для действительныйели векторы CRISPR и дают материал для последующих экспериментов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. РНК Руководство по проектированию и векторные Строительство

  1. Определение целевых последовательностей для генов, представляющих интерес. Есть множество онлайн CRISPR целевых ознакомительных программ , пригодных для этого шага 13,14.
    Примечание: При этом мы используем GN 20 GG целевой мотив, но и другие конструкции могут быть пригодны в зависимости от прикладной системы или используемого вектора.
  2. Дизайн 60-мерный gRNA олиго , чтобы включать в себя часть целевой мотивов , фланкированных 5 'и 3' 20-нт последовательности, которые необходимы для сборки ДНК Г.Н. 19. Окончательный 60-мерный мотив: 5'-TCAAGCGAACCAGTAGGCTT-GN 19 -GTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3 '.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Стандартный, обессоливают праймеры работают отлично.
  3. Подготовьте четыре ДНК для сборки (Рисунок 1). См дополнительный файл для ДНК-последовательностей.
    1. Дайджест 1 - 5 мкг p201N: cas9 10 плазмиды с ферментом рестрикции Spe I в 1X буфера 4 при 37 ° С в течение 2 часов. Колонка-очистить дайджестогласно инструкциям изготовителя. Ресуспендируют в ~ 15 мкл 10 мМ Трис-HCl, и количественно с помощью УФ-спектрофотометрии.
    2. Выполнение второго переваривания ферментом рестрикции Сва I в 1х буфере 3,1 при 25 ° C в течение 2 часов. Проверка 100 - 200 нг на агарозном геле 0,8%, чтобы подтвердить полное переваривание.
      Примечание: Правильно переваривают плазмиду будет иметь одну полосу на 14,313 б.п.. Примечание: Тепло инактивации фермента и дефосфорилирование не требуются. Расщепленную плазмиду можно хранить при -20 ° С.
    3. ПЦР - амплификации truncatula Medicago (Mt) U6 промотора и эшафот ДНК из 10 плазмиды МПУЕ gRNA Shuttle с использованием праймеров Сва I_MtU6F / MtU6R и ScaffoldF / Spe I_ScaffoldR соответственно. Используйте высококачественную полимеразу с условиями ПЦР: 95 ° C в течение 3 мин; 31 циклов (98 ° С в течение 20 сек, 60 ° С в течение 15 сек, 72 ° С в течение 30 сек); и 72 ° С в течение 5 мин.
      1. Визуализируйте ~ 3 мкл аликвоты ПЦР-прoducts на агарозном геле 1% для подтверждения амплификации. MtU6 ампликона составляет 377 пар оснований и подмости ампликона составляет 106 пар оснований. Колонка-очистить оставшиеся продукты ПЦР в соответствии с инструкциями производителя, количественно с помощью УФ-спектрофотометрии и хранят при -20 ° С.
    4. Ресуспендируют всю трубу gRNA олигомеров до 100 мкМ в лаборатории класса воды. Добавляют 1 мкл 100 мкМ олиго до 500 мкл буфера 1x 2.1. Хорошо перемешать. Если объединение нескольких олигонуклеотиды, добавить 1 мкл каждого 100 мкМ олиго к 1x буфера 2.1 трубы. Разведенные олигонуклеотиды можно хранить при -20 ° С.
  4. Программирование амплификатор для хранения при 50 ° С, с использованием нагретой крышкой. Смешайте 100 нг (0,011 пмоль) из линеаризованного вектора, 50 нг (0,2 пмоль) из MtU6 промотора, 12 нг (0,2 пмоль) из помост, 1 мкл (0,2 пмоль), разбавленного gRNA олиго (ов), а также воду до объема 5 мкл. Добавьте 5 мкл 2x высокой точности сборки ДНК мастер-смеси, хорошо перемешать и спин вниз. Инкубируйте реакции в течение 60 мин в50 ° C Термоциклер. Затем поместите реакцию на льду.
    Примечание: объемы реакции может быть увеличено, чтобы покрыть низкий выход ДНК.
  5. Transform 2 мкл реакционной смеси в компетентную E. палочка клеток с использованием стандартных методик и пластину на LB , дополненной 50 мг L -1 канамицина (Kan 50). Grow плакированные-клеток при 37 ° С в течение ночи. Сохранить оставшуюся ДНК реакцию сборки при -20 ° C.
  6. Экран колонии с помощью ПЦР с использованием праймеров StUbi3P218R и ISceIR. Развести аликвоту оставшейся ДНК реакции сборки с водой в соотношении 1: 5. Используйте 1 мкл в качестве положительного контроля для экрана колонии и 1 нг круговой p201N: cas9 плазмиды в качестве контроля нет-вставки.
    1. ПЦР-амплификации с условиями; 95 ° С в течение 3 мин; 31 циклов (95 ° С в течение 30 сек, 58 ° С в течение 30 сек, 72 ° С в течение 30 сек); и при 72 ° С в течение 5 мин. Визуализируйте продуктов ПЦР на 1% -ном агарозном геле. Убедитесь в том, что правильные вставки имеют полосу в 725 п.о. и векторы остроумияХаут вставки (например, режиссерский вектор) будет иметь 310 п.н. полосу.
  7. Grow положительные колонии в LB Кан 50 жидких культур в течение ночи при температуре 37 ° С и очищают плазмид в соответствии с инструкциями изготовителя. Последовательность Sanger плазмид с праймером StUbi3P218R и выравнивать хроматограммы к MtU6 промотор, цели и каркасных последовательностей для обеспечения не были введены никакие ошибки в процессе клонирования.
  8. Выполните диагностику переваривать расщеплением ~ 1 мкг плазмиды с Eco RV и Sty I. Визуализируйте на 0,8% -ном агарозном геле. Фрагменты (в п.н.) являются: 4192, 2001, 1743, 1544, 1381, 995, 831, 702, 460, 423, 318, и 174.
  9. Используйте сборку ДНК для построения векторов с несколькими gRNAs.
    1. Чтобы построить вектор с двумя кассетами gRNA, ПЦР - амплификации первого положения gRNA с праймерами Сва I_MtU6F / UNS1_ScaffoldR и второе положение gRNA с праймерами UNS1_MtU6F / Spe I_ScaffoldR от 1 нг каждого из соответствующихПлазмиды построены с шагом 1,1 - 1,8. Используйте условия ПЦР на этапе 1.3.3. Визуализируйте ~ 3 мкл аликвоты ПЦР-продуктов на агарозном геле 1% для подтверждения амплификации. Ампликоны ~ 500 пар оснований.
    2. Объединить и смешать примерно равное количество оон очищенных продуктов ПЦР в 200 мкл трубки (как правило, 3 - 4 мкл каждого). Для сборки, добавьте 1 мкл комбинированные продукты ПЦР, 50 нг SWA I и Spe I линеаризуется p201N: cas9, лабораторно-класса воды до 2,5 мкл и 2,5 мкл 2x высокой точности сборки ДНК мастер - микс. Выдержите в амплификатор 50 ° C в течение 15 мин.
      Примечание: Сборочные ДНК руководства рекомендует 15 мин инкубации в течение 2 - 3 фрагментов.
    3. Transform 1 - 2 мкл в компетентные E. клетки палочки и пластины на LB Кан 50. Grow высевания клеток при 37 ° С в течение ночи. Сохранить оставшуюся реакционную смесь при -20 ° С.
    4. Экран колонии с помощью ПЦР с использованием праймеров StUbi3P218R и ISceIR при тех же условиях, как на стадии 1.6. Правильно сциклоны будут ампликона в 1200 пар оснований. Grow положительные колонии в LB Кан 50 жидких культур в течение ночи и очищают плазмиды.
    5. Последовательность плазмиды Sanger с StUbi3P218R праймеров (охватывает первого положения gRNA) и p201R (занимает второе место gRNA). Совместите хроматограммы к MtU6 последовательностей промотора, целевых и строительных лесов. Диагностический дайджест с Eco RV и Sty я приведу в следующих фрагментов (в п.н.): 4192, 2476, 1743, 1544, 1381, 995, 831, 702, 460, 423, 318, 174. Bolded фрагмент содержит второй gRNA.
  10. После встречи все ожидания контроля качества, преобразование плазмид в Agrobacterium rhizogenes штамм ARqua1 15. Добавить 1 мкл плазмиды преп к 50 мкл электрокомпетентных клеток и электропорации в 1 мм кювету с параметрами: 2,4 кВ, 25 мкФ и 200 Ом. Восстановление клеток в ~ 500 мкл SOC и встряхивают при температуре 28 ° С в течение 2 ч. Тарелка на LB Кан 50 и ггрести при 28 ° С в течение 2-х дней. Выполнение экрана колоний с использованием тех же праймеров и условия ПЦР, как 1.3.3. Сделать запасы глицерина из положительных клонов.

Трансформация 2. Волосатые Root

  1. Стерилизовать семена томатов в 20% хлорной извести в течение 15 мин, при постоянном перемешивании. В ламинарном потоке, удалите отбеливатель и стирать в стерильной лаборатории класса воды 3 раза.
  2. Пластина 30 семян в коробке GA-7 , содержащие ½ MS носитель (2,22 г L -1 MS соли + Gamborg Витамины, 10 г L -1 сахарозы, 3 г L -1 геллановая камедь, рН 5,8). Прорастают на ~ 2 дней в темноте, а затем переместите GA-7 коробок к свету. Вырастить рассаду для ~ более 4-х дней в свете.
  3. За день до этого преобразования, полоса из А. rhizogenes культуры на твердой LB Кан 50 и расти при температуре 28 ° С в течение ночи.
  4. День не трансформации, в ламинарный собрать стерильных материалов: 12 мл культуральной пробирки, 50 мл коническую трубку, ½ MS жидкость (не геллановая гмкм), 200 мкМ ацетосирингона, фильтровальная бумага, чашки Петри, пинцет и скальпель, пипетки и наконечники пипеток. Добавьте 25 мкл ацетосирингона до 50 мл ½ МС и влить ~ 6 мл в каждую пробирку.
  5. Используйте изогнутый наконечник 200 мкл , чтобы скоблить A. rhizogenes клетки от пластины и ресуспендируют в 6 мл ½ MS жидкости. Вихревая трубка полностью ресуспендирования клеток. После ресуспендирования клеток из каждого вектора, измеряют оптическую плотность (ОП) в 1 мл клеток, при фиксированной длине волны 600 нм. Убедитесь, что OD находится в интервале от 0,2 до 0,4; разбавить или добавить больше клеток по мере необходимости. Повторите эти действия для каждой конструкции.
  6. Добавить ~ 2 мл ½ MS жидкости в чашку Петри с стерильной фильтровальной бумагой. Акцизные семядоли из сеянцев и места на увлажненную фильтровальную бумагу. После того, как все семядоли были собраны, вырезать дистальных ~ 1 см от семядолей, в результате чего семядольных куски с двумя концами разреза. Добавить эксплантов А. растворы rhizogenes, перемешать и инкубировать в течение 20 минс редкими переворачивая.
    Примечание: Приблизительно 12 эксплантатов на конструкции , которые обычно используются, хотя и больше, чем 80 эксплантов была сделана прививка в 6 мл А. Решение rhizogenes.
  7. Во время А. rhizogenes инкубации, добавьте фильтровальную бумагу в чашки Петри, по одному на конструкцию трансформировали. Также установлено ½ MS твердых сред, ни антибиотики, в ламинарном шкафу для просушки.
  8. Совок семядоли из A. Раствор rhizogenes с стерильным пинцетом и поместить на сухой фильтровальной бумаге. Накройте крышкой Петри, чтобы обеспечить ткани не высыхают в то время как перейти к следующему преобразованию. Блот семядоли на фильтровальную бумагу и передачи, абаксиальной стороной вверх, на ½ MS СМИ. Оберните плиты с хирургической лентой и со-культивируют в темноте при комнатной температуре в течение 2-х дней.
  9. После совместного культивирования, переноса семядолей, абаксиальный стороной вверх, к ½ MS дополненной 300 мг L -1 Ticarcillin / клавулановой кислоты (Tim 300, чтобы предотвратить рост RESIDUAL А. rhizogenes) и Кан 50 (для селекции растений) и завернуть с хирургической лентой. Поддержание культуры под лампами дневного света при комнатной температуре с 16-часовой фотопериод.
  10. После того, как ~ 1.5 - 2 недели корни по крайней мере , 2 см в длину вырезают из семядолей с помощью стерильного пинцета и скальпеля и переносили на ½ MS Кан 50 Тим 300 средств массовой информации. Передача от 10 до 15 корней к одной пластине. Отметьте положение кончиков корней с маркером, обертывание с хирургической лентой, а также поддерживать в комнатной культуре.
  11. После одной недели, трансформированные корни замечены растет на селективной среде. Заготавливают подвыборки трансформированных корней для экстракции ДНК с использованием предпочтительного способа ДНК-экстракции. Примечание: Пластины с семядолей могут храниться в течение 2 - 3 еженедельных урожая, после чего указывают корни растут в запутанную беспорядок и трудно выделить. Номера заготовленные ткани корня может сохраняться неопределенно долго. Различные тесты могут быть выполнены на образце Выделенная ДНКдля того чтобы определить частоту мутаций ДНК и тип. Результаты нескольких таких анализов описаны ниже.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

CRISPR вектор строительства с блоком ДНК, как правило, создает десятки и сотни независимых клонов. Скрининг колоний с помощью ПЦР легко идентифицирует правильные клоны и могут различать плазмид с и без вставок (рис 2А) , которая полезна для поиска и устранения неисправностей. Как правило, все из клонов содержат вставку, и пользователь может выбрать, чтобы пропустить шаги скрининга колонии в целом. Диагностические дайджесты (рис 2В) и Sanger секвенировани...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Поскольку сборка ДНК используется для рекомбинации любых перекрывающихся последовательностей ДНК, этот метод клонирования может быть применен к любой векторной конструкции CRISPR. В большинстве схем клонирования CRISPR используется либо синтез генов гРНК, ферментов рестрикции типа IIS17,18, либо ПЦР19 с перекрывающимся расширением. Каждый из этих методов имеет свои преимущества и недостатки, но обычно они требуют нескольких практических этапов клонирования. Основное преимущество представленного здес...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

Это исследование было поддержано грантом Национального научного фонда IOS-1025642 (GBM). Мы благодарим Марию Харрисона за предоставление штамма ARqua1.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
NEBuilder® (Микс сборки HiFi DNA)New England BiolabsE5520
p201N:Cas9Addgene59175Плазмида p201H:Cas9 (59176) также совместима с зарегистрированными перекрытиями и ферментами.
pUC gRNA ShuttleAddgene47024
SwaINew England BiolabsR0604S
SpeINew England BiolabsR0133S
Zymo clean и концентратор-5 очистка колонкиZymo ResearchD4003
NEB Buffer 2.1New England BiolabsB7202S
NEB CutSmart (Буфер 4)New England BiolabsB7204S
NEB Buffer 3.1New England BiolabsB7203S
EconoSpin Mini Spin Spin Column (подготовка к плазмиде)Epoch Life Sciences1910-050/250
EcoRV-HF®Биолаборатории Новой АнглииR3195S
StyI-HF®New England BiolabsR3500S
MS Salts + Gamborg VitaminsPhytotechnology LaboratoriesM404
Phytagel™ (Геллановая камедь)Sigma AldrichP8169
GA-7 КоробкиSigma AldrichV8505
Микропоры хирургическая лента3M1535-0
Timentin® (Тикарциллин/клавулановая кислота)Различные0029-6571-26
Грунтовки 5' → 3'SwaI_MtU6F
 GATATTAATCTCTTCGATGA
AATTTATGCCTATCTTATAT
GATCAATGAGG
MtU6R   AAGCCTACTGGTTCGCTTG
AAG
ScaffoldF GTTTTAGAGCTAGAAATAGC
AAGTT<
em>SpeI_Scaffold RGTCATGAATTAATACGACTC
AAAAAAAAGCACCGACTCGGTG
StUbi3P218R ACATGCACCTAATTTCACTA
GATGT
ISceIRGTGATCGATTACCCTTAT
CCCTAG		Не может быть использован для секвенирования по Сэнгеру, так как на плазмиде
UNS1_Scaffold R GAGAATGGATGCGAGTAATGAA
AAAAAGCACCGACTCGGTG
UNS1_MtU6 F   CATTACTCGCATCCATTCTCAT
GCCTATCTTATATGATCAATGAGG
p201R CGCGCCGAATTCTAGTGATCG
Выделенные полужирным шрифтом последовательности обозначают 20-нт перекрытия с линеаризованными p201N:Cas9.
есть второй сайт связывания

Ссылки

  1. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  2. Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
  3. Zhou, Y. X., et al. High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells. Nature. 509 (509), 487-491 (2014).
  4. Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), (2014).
  5. Belhaj, K., Chaparro-Garcia, A., Kamoun, S., Patron, N. J., Nekrasov, V. Editing plant genomes with CRISPR/Cas9. Current Opinion in Biotechnology. 32, 76-84 (2015).
  6. Bortesi, L., Fischer, R. The CRISPR/Cas9 system for plant genome editing and beyond. Biotechnology Advances. 33 (1), 41-52 (2015).
  7. Jia, H. G., Wang, N. Targeted genome editing of sweet orange using Cas9/sgRNA. Plos One. 9, (2014).
  8. Upadhyay, S. K., Kumar, J., Alok, A., Tuli, R. RNA-Guided Genome Editing for Target Gene Mutations in Wheat. G3-Genes Genomes Genetics. 3 (12), 2233-2238 (2013).
  9. Ron, M., et al. Hairy root transformation using Agrobacterium rhizogenes. as a tool for exploring cell type-specific gene expression and function using tomato as a model. Plant Physiology. 166 (2), 455-U4442 (2014).
  10. Jacobs, T. B., LaFayette, P. R., Schmitz, R. J., Parrott, W. A. Targeted genome modifications in soybean with CRISPR/Cas9. BMC Biotechnology. 15, (2015).
  11. Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome. Nature Methods. 7 (11), 901-903 (2010).
  12. Zhou, X., Jacobs, T. B., Xue, L. J., Harding, S. A., Tsai, C. J. Exploiting SNPs for biallelic CRISPR mutations in the outcrossing woody perennial Populus reveals 4-coumarate:CoA ligase specificity and redundancy. New Phytologist. , (2015).
  13. Stemmer, M., Thumberger, T., Keyer, M. D., Wittbrodt, J., Mateo, J. L. CCTop: An Intuitive, Flexible and Reliable CRISPR/Cas9 Target Prediction Tool. Plos One. 10, (2015).
  14. Lei, Y., et al. CRISPR-P: A Web Tool for Synthetic Single-Guide RNA Design of CRISPR-System in Plants. Molecular Plant. 7 (9), 1494-1496 (2014).
  15. Quandt, H. J., Puhler, A., Broer, I. TRANSGENIC ROOT-NODULES OF VICIA-HIRSUTA - A FAST AND EFFICIENT SYSTEM FOR THE STUDY OF GENE-EXPRESSION IN INDETERMINATE-TYPE NODULES. Molecular Plant-Microbe Interactions. 6, 699-706 (1993).
  16. Zhu, X. X., et al. An efficient genotyping method for genome-modified animals and human cells generated with CRISPR/Cas9 system. Scientific Reports. 4 (8), (2014).
  17. Belhaj, K., Chaparro-Garcia, A., Kamoun, S., Nekrasov, V. Plant genome editing made easy: targeted mutagenesis in model and crop plants using the CRISPR/Cas system. Plant Methods. 9 (1), 39(2013).
  18. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  19. Li, J. F., et al. Multiplex and homologous recombination-mediated genome editing in Arabidopsis and Nicotiana benthamiana using guide RNA and Cas9. Nat Biotech. 31 (8), 688-691 (2013).
  20. Fu, Y. F., Sander, J. D., Reyon, D., Cascio, V. M., Joung, J. K. Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. Nature Biotechnology. 32 (3), 279-284 (2014).
  21. Torella, J. P., et al. Unique nucleotide sequence-guided assembly of repetitive DNA parts for synthetic biology applications. Nat Protoc. 9 (9), 2075-2089 (2014).
  22. Ono, N. N., Tian, L. The multiplicity of hairy root cultures: Prolific possibilities. Plant Science. 180 (3), 439-446 (2011).
  23. Tepfer, D. Transformation of several species of higher plants by Agrobacterium rhizogenes.: sexual transmission of the transformed genotype and phenotype. Cell. 37 (3), 959-967 (1984).
  24. Li, H., Deng, Y., Wu, T. L., Subramanian, S., Yu, O. Misexpression of miR482, miR1512, and miR1515 Increases Soybean Nodulation. Plant Physiology. 153 (4), 1759-1770 (2010).
  25. Boisson-Dernier, A., et al. Agrobacterium rhizogenes-transformed roots of Medicago truncatula for the study of nitrogen-fixing and endomycorrhizal symbiotic associations. Molecular Plant-Microbe Interactions. 14 (6), 695-700 (2001).
  26. Collier, R., Fuchs, B., Walter, N., Kevin Lutke, W., Taylor, C. G. Ex vitro. composite plants: an inexpensive, rapid method for root biology. Plant Journal. 43 (3), 449-457 (2005).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Метод сборки ДНКдизайн направляющей РНКрестрикция с помощью рестриктазамплификация ДНК методом ПЦРочистка плазмидтрансформация Agrobacteriumанализ генетических мутацийисследования в области функциональной геномики
Высокая пропускная способность CRISPR Конструирование вектора и характеристика ДНК Модификации генерацией Томатный волосистых корней
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.