Method Article

Высокая пропускная способность CRISPR Конструирование вектора и характеристика ДНК Модификации генерацией Томатный волосистых корней

DOI:

10.3791/53843

⸱

April 30th, 2016

 , 
1Boyce Thompson Institute for Plant Research, 2Section of Plant Pathology & Plant-Microbe Biology, School of Integrative Plant Science, Cornell University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Используя сборку ДНК, несколько векторов CRISPR могут быть построены параллельно в одной реакции клонирования, что делает строительство большого числа CRISPR векторов простую задачу. Томатные волосатые корни отличная модель системы для проверки CRISPR векторов и генерировать мутантные материалы.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Целевые мутации ДНК, сгенерированные векторами с кластеризованными регулярно чередующимися короткими палиндромными повторами (CRISPR)/технологией Cas9, оказались полезными для исследований функциональной геномики. Несмотря на то, что большинство стратегий клонирования просты в исполнении, они, как правило, состоят из нескольких этапов и могут потребовать несколько дней для создания окончательных конструкций. Представленный здесь метод основан на сборке ДНК и может производить полнофункциональные векторы CRISPR за одну реакцию клонирования. Векторное построение также может быть объединено, что еще больше повышает эффективность и полезность процесса. Модификация метода используется для создания векторов CRISPR с несколькими генами-мишенями. Затем векторы CRISPR преобразуются в волосатые корни томата для получения трансгенных материалов с целевыми модификациями ДНК. Волосатые корни являются полезной системой для тестирования функциональности векторов, поскольку они технически просты в создании и поддаются крупномасштабному производству. Представленные здесь методы будут иметь широкое применение, поскольку они могут быть использованы для создания различных векторов CRISPR и использоваться для широкого спектра видов растений.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Способность генерировать адресные модификации ДНК с CRISPR / cas9 имеет большой потенциал для функциональной геномики исследований. Есть два компонента системы CRISPR / cas9; cas9 нуклеазы, полученный из Staphylococcus Пирролидонилпептидаза и приблизительно 100-нт руководство РНК (gRNA) молекулы , которая направляет cas9 на сайт целевой ДНК (ов) 1. Целевой показатель признания присуждается первым ~ 20-нт из gRNA, что позволяет продукции с высокой пропускной способностью адресности векторов 2,3. Большинство организмов , которые могут быть созданы, уже были с CRISPR технологии / cas9 4,5.

В растениях, конститутивные промоторы, такие как промотор CaMV 35S, которые обычно используются для управления экспрессией в cas9 нуклеазы 6. В gRNAs выражаются с помощью РНК-полимеразы III U6 или промоторы U3, который ограничивает первую базу gRNA либо к G, для U6 или для У3, для эффективной транскрипции. Однако РНК-полимеразы II выпускного вечераoters, которые свободны от этих ограничений, также были использованы 7,8.

Различные gRNAs вызывают мутации ДНК с различной эффективностью, и поэтому он может быть важно сначала проверить CRISPR векторов, прежде чем инвестировать в преобразования целого растения или создание обширных фенотипические экранов. Переходная экспрессия CRISPR конструкций в растениях, используя агроинфильтрации например, как правило , приводит к более низкой частоте модификации ДНК по сравнению с устойчивыми растениями 6, что делает обнаружение мутаций трудно и фенотипических анализов непрактичными с такими подходами. Так называемые волосатых корней являются удобной, альтернативная система, так как большое число независимых, стабильно трансформированных материалов могут быть получены в течение нескольких недель, в отличие от месяцев для стабильных растений. CRISPR векторы очень эффективны при индукции мутаций ДНК в волосатых корней 9,10.

методы сборки ДНК эффективно лигирования фрагменты ДНК, содержащие overlapping заканчивается 11. Основным преимуществом некоторых методов сборки ДНК является способность включать оцДНК (т.е. олиго) в собранных продуктах. Так как gRNAs только ~ 20-нт долго и новые цели могут быть сделаны с синтезированных олигонуклеотидов, эти методы сборки ДНК хорошо подходят для CRISPR клонирования. Протоколы , описанные здесь , основаны на P201 серии CRISPR векторов, которая успешно используется в сое 10, 12 тополя и теперь помидор. Процедура клонирования представлены предлагает несколько преимуществ по сравнению с текущим методом клонирования 10. А именно, полностью функциональные векторы могут быть получены в одной реакции клонирования в течение одного дня. Вектор строительства также могут быть объединены для создания нескольких векторов CRISPR параллельно, дальнейшее сокращение практического времени и материальных затрат. Мы также приводим протокол для генерации томатных волосатых корней как эффективный способ для получения трансгенных материалов с целевым делеции гена. Волосатые корни используются для действительныйели векторы CRISPR и дают материал для последующих экспериментов.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. РНК Руководство по проектированию и векторные Строительство

  1. Определение целевых последовательностей для генов, представляющих интерес. Есть множество онлайн CRISPR целевых ознакомительных программ , пригодных для этого шага 13,14.
    Примечание: При этом мы используем GN 20 GG целевой мотив, но и другие конструкции могут быть пригодны в зависимости от прикладной системы или используемого вектора.
  2. Дизайн 60-мерный gRNA олиго , чтобы включать в себя часть целевой мотивов , фланкированных 5 'и 3' 20-нт последовательности, которые необходимы для сборки ДНК Г.Н. 19. Окончательный 60-мерный мотив: 5'-TCAAGCGAACCAGTAGGCTT-GN 19 -GTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3 '.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Стандартный, обессоливают праймеры работают отлично.
  3. Подготовьте четыре ДНК для сборки (Рисунок 1). См дополнительный файл для ДНК-последовательностей.
    1. Дайджест 1 - 5 мкг p201N: cas9 10 плазмиды с ферментом рестрикции Spe I в 1X буфера 4 при 37 ° С в течение 2 часов. Колонка-очистить дайджестогласно инструкциям изготовителя. Ресуспендируют в ~ 15 мкл 10 мМ Трис-HCl, и количественно с помощью УФ-спектрофотометрии.
    2. Выполнение второго переваривания ферментом рестрикции Сва I в 1х буфере 3,1 при 25 ° C в течение 2 часов. Проверка 100 - 200 нг на агарозном геле 0,8%, чтобы подтвердить полное переваривание.
      Примечание: Правильно переваривают плазмиду будет иметь одну полосу на 14,313 б.п.. Примечание: Тепло инактивации фермента и дефосфорилирование не требуются. Расщепленную плазмиду можно хранить при -20 ° С.
    3. ПЦР - амплификации truncatula Medicago (Mt) U6 промотора и эшафот ДНК из 10 плазмиды МПУЕ gRNA Shuttle с использованием праймеров Сва I_MtU6F / MtU6R и ScaffoldF / Spe I_ScaffoldR соответственно. Используйте высококачественную полимеразу с условиями ПЦР: 95 ° C в течение 3 мин; 31 циклов (98 ° С в течение 20 сек, 60 ° С в течение 15 сек, 72 ° С в течение 30 сек); и 72 ° С в течение 5 мин.
      1. Визуализируйте ~ 3 мкл аликвоты ПЦР-прoducts на агарозном геле 1% для подтверждения амплификации. MtU6 ампликона составляет 377 пар оснований и подмости ампликона составляет 106 пар оснований. Колонка-очистить оставшиеся продукты ПЦР в соответствии с инструкциями производителя, количественно с помощью УФ-спектрофотометрии и хранят при -20 ° С.
    4. Ресуспендируют всю трубу gRNA олигомеров до 100 мкМ в лаборатории класса воды. Добавляют 1 мкл 100 мкМ олиго до 500 мкл буфера 1x 2.1. Хорошо перемешать. Если объединение нескольких олигонуклеотиды, добавить 1 мкл каждого 100 мкМ олиго к 1x буфера 2.1 трубы. Разведенные олигонуклеотиды можно хранить при -20 ° С.
  4. Программирование амплификатор для хранения при 50 ° С, с использованием нагретой крышкой. Смешайте 100 нг (0,011 пмоль) из линеаризованного вектора, 50 нг (0,2 пмоль) из MtU6 промотора, 12 нг (0,2 пмоль) из помост, 1 мкл (0,2 пмоль), разбавленного gRNA олиго (ов), а также воду до объема 5 мкл. Добавьте 5 мкл 2x высокой точности сборки ДНК мастер-смеси, хорошо перемешать и спин вниз. Инкубируйте реакции в течение 60 мин в50 ° C Термоциклер. Затем поместите реакцию на льду.
    Примечание: объемы реакции может быть увеличено, чтобы покрыть низкий выход ДНК.
  5. Transform 2 мкл реакционной смеси в компетентную E. палочка клеток с использованием стандартных методик и пластину на LB , дополненной 50 мг L -1 канамицина (Kan 50). Grow плакированные-клеток при 37 ° С в течение ночи. Сохранить оставшуюся ДНК реакцию сборки при -20 ° C.
  6. Экран колонии с помощью ПЦР с использованием праймеров StUbi3P218R и ISceIR. Развести аликвоту оставшейся ДНК реакции сборки с водой в соотношении 1: 5. Используйте 1 мкл в качестве положительного контроля для экрана колонии и 1 нг круговой p201N: cas9 плазмиды в качестве контроля нет-вставки.
    1. ПЦР-амплификации с условиями; 95 ° С в течение 3 мин; 31 циклов (95 ° С в течение 30 сек, 58 ° С в течение 30 сек, 72 ° С в течение 30 сек); и при 72 ° С в течение 5 мин. Визуализируйте продуктов ПЦР на 1% -ном агарозном геле. Убедитесь в том, что правильные вставки имеют полосу в 725 п.о. и векторы остроумияХаут вставки (например, режиссерский вектор) будет иметь 310 п.н. полосу.
  7. Grow положительные колонии в LB Кан 50 жидких культур в течение ночи при температуре 37 ° С и очищают плазмид в соответствии с инструкциями изготовителя. Последовательность Sanger плазмид с праймером StUbi3P218R и выравнивать хроматограммы к MtU6 промотор, цели и каркасных последовательностей для обеспечения не были введены никакие ошибки в процессе клонирования.
  8. Выполните диагностику переваривать расщеплением ~ 1 мкг плазмиды с Eco RV и Sty I. Визуализируйте на 0,8% -ном агарозном геле. Фрагменты (в п.н.) являются: 4192, 2001, 1743, 1544, 1381, 995, 831, 702, 460, 423, 318, и 174.
  9. Используйте сборку ДНК для построения векторов с несколькими gRNAs.
    1. Чтобы построить вектор с двумя кассетами gRNA, ПЦР - амплификации первого положения gRNA с праймерами Сва I_MtU6F / UNS1_ScaffoldR и второе положение gRNA с праймерами UNS1_MtU6F / Spe I_ScaffoldR от 1 нг каждого из соответствующихПлазмиды построены с шагом 1,1 - 1,8. Используйте условия ПЦР на этапе 1.3.3. Визуализируйте ~ 3 мкл аликвоты ПЦР-продуктов на агарозном геле 1% для подтверждения амплификации. Ампликоны ~ 500 пар оснований.
    2. Объединить и смешать примерно равное количество оон очищенных продуктов ПЦР в 200 мкл трубки (как правило, 3 - 4 мкл каждого). Для сборки, добавьте 1 мкл комбинированные продукты ПЦР, 50 нг SWA I и Spe I линеаризуется p201N: cas9, лабораторно-класса воды до 2,5 мкл и 2,5 мкл 2x высокой точности сборки ДНК мастер - микс. Выдержите в амплификатор 50 ° C в течение 15 мин.
      Примечание: Сборочные ДНК руководства рекомендует 15 мин инкубации в течение 2 - 3 фрагментов.
    3. Transform 1 - 2 мкл в компетентные E. клетки палочки и пластины на LB Кан 50. Grow высевания клеток при 37 ° С в течение ночи. Сохранить оставшуюся реакционную смесь при -20 ° С.
    4. Экран колонии с помощью ПЦР с использованием праймеров StUbi3P218R и ISceIR при тех же условиях, как на стадии 1.6. Правильно сциклоны будут ампликона в 1200 пар оснований. Grow положительные колонии в LB Кан 50 жидких культур в течение ночи и очищают плазмиды.
    5. Последовательность плазмиды Sanger с StUbi3P218R праймеров (охватывает первого положения gRNA) и p201R (занимает второе место gRNA). Совместите хроматограммы к MtU6 последовательностей промотора, целевых и строительных лесов. Диагностический дайджест с Eco RV и Sty я приведу в следующих фрагментов (в п.н.): 4192, 2476, 1743, 1544, 1381, 995, 831, 702, 460, 423, 318, 174. Bolded фрагмент содержит второй gRNA.
  10. После встречи все ожидания контроля качества, преобразование плазмид в Agrobacterium rhizogenes штамм ARqua1 15. Добавить 1 мкл плазмиды преп к 50 мкл электрокомпетентных клеток и электропорации в 1 мм кювету с параметрами: 2,4 кВ, 25 мкФ и 200 Ом. Восстановление клеток в ~ 500 мкл SOC и встряхивают при температуре 28 ° С в течение 2 ч. Тарелка на LB Кан 50 и ггрести при 28 ° С в течение 2-х дней. Выполнение экрана колоний с использованием тех же праймеров и условия ПЦР, как 1.3.3. Сделать запасы глицерина из положительных клонов.

Трансформация 2. Волосатые Root

  1. Стерилизовать семена томатов в 20% хлорной извести в течение 15 мин, при постоянном перемешивании. В ламинарном потоке, удалите отбеливатель и стирать в стерильной лаборатории класса воды 3 раза.
  2. Пластина 30 семян в коробке GA-7 , содержащие ½ MS носитель (2,22 г L -1 MS соли + Gamborg Витамины, 10 г L -1 сахарозы, 3 г L -1 геллановая камедь, рН 5,8). Прорастают на ~ 2 дней в темноте, а затем переместите GA-7 коробок к свету. Вырастить рассаду для ~ более 4-х дней в свете.
  3. За день до этого преобразования, полоса из А. rhizogenes культуры на твердой LB Кан 50 и расти при температуре 28 ° С в течение ночи.
  4. День не трансформации, в ламинарный собрать стерильных материалов: 12 мл культуральной пробирки, 50 мл коническую трубку, ½ MS жидкость (не геллановая гмкм), 200 мкМ ацетосирингона, фильтровальная бумага, чашки Петри, пинцет и скальпель, пипетки и наконечники пипеток. Добавьте 25 мкл ацетосирингона до 50 мл ½ МС и влить ~ 6 мл в каждую пробирку.
  5. Используйте изогнутый наконечник 200 мкл , чтобы скоблить A. rhizogenes клетки от пластины и ресуспендируют в 6 мл ½ MS жидкости. Вихревая трубка полностью ресуспендирования клеток. После ресуспендирования клеток из каждого вектора, измеряют оптическую плотность (ОП) в 1 мл клеток, при фиксированной длине волны 600 нм. Убедитесь, что OD находится в интервале от 0,2 до 0,4; разбавить или добавить больше клеток по мере необходимости. Повторите эти действия для каждой конструкции.
  6. Добавить ~ 2 мл ½ MS жидкости в чашку Петри с стерильной фильтровальной бумагой. Акцизные семядоли из сеянцев и места на увлажненную фильтровальную бумагу. После того, как все семядоли были собраны, вырезать дистальных ~ 1 см от семядолей, в результате чего семядольных куски с двумя концами разреза. Добавить эксплантов А. растворы rhizogenes, перемешать и инкубировать в течение 20 минс редкими переворачивая.
    Примечание: Приблизительно 12 эксплантатов на конструкции , которые обычно используются, хотя и больше, чем 80 эксплантов была сделана прививка в 6 мл А. Решение rhizogenes.
  7. Во время А. rhizogenes инкубации, добавьте фильтровальную бумагу в чашки Петри, по одному на конструкцию трансформировали. Также установлено ½ MS твердых сред, ни антибиотики, в ламинарном шкафу для просушки.
  8. Совок семядоли из A. Раствор rhizogenes с стерильным пинцетом и поместить на сухой фильтровальной бумаге. Накройте крышкой Петри, чтобы обеспечить ткани не высыхают в то время как перейти к следующему преобразованию. Блот семядоли на фильтровальную бумагу и передачи, абаксиальной стороной вверх, на ½ MS СМИ. Оберните плиты с хирургической лентой и со-культивируют в темноте при комнатной температуре в течение 2-х дней.
  9. После совместного культивирования, переноса семядолей, абаксиальный стороной вверх, к ½ MS дополненной 300 мг L -1 Ticarcillin / клавулановой кислоты (Tim 300, чтобы предотвратить рост RESIDUAL А. rhizogenes) и Кан 50 (для селекции растений) и завернуть с хирургической лентой. Поддержание культуры под лампами дневного света при комнатной температуре с 16-часовой фотопериод.
  10. После того, как ~ 1.5 - 2 недели корни по крайней мере , 2 см в длину вырезают из семядолей с помощью стерильного пинцета и скальпеля и переносили на ½ MS Кан 50 Тим 300 средств массовой информации. Передача от 10 до 15 корней к одной пластине. Отметьте положение кончиков корней с маркером, обертывание с хирургической лентой, а также поддерживать в комнатной культуре.
  11. После одной недели, трансформированные корни замечены растет на селективной среде. Заготавливают подвыборки трансформированных корней для экстракции ДНК с использованием предпочтительного способа ДНК-экстракции. Примечание: Пластины с семядолей могут храниться в течение 2 - 3 еженедельных урожая, после чего указывают корни растут в запутанную беспорядок и трудно выделить. Номера заготовленные ткани корня может сохраняться неопределенно долго. Различные тесты могут быть выполнены на образце Выделенная ДНКдля того чтобы определить частоту мутаций ДНК и тип. Результаты нескольких таких анализов описаны ниже.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CRISPR вектор строительства с блоком ДНК, как правило, создает десятки и сотни независимых клонов. Скрининг колоний с помощью ПЦР легко идентифицирует правильные клоны и могут различать плазмид с и без вставок (рис 2А) , которая полезна для поиска и устранения неисправностей. Как правило, все из клонов содержат вставку, и пользователь может выбрать, чтобы пропустить шаги скрининга колонии в целом. Диагностические дайджесты (рис 2В) и Sanger секвенировани...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Поскольку сборка ДНК используется для рекомбинации любых перекрывающихся последовательностей ДНК, этот метод клонирования может быть применен к любой векторной конструкции CRISPR. В большинстве схем клонирования CRISPR используется либо синтез генов гРНК, ферментов рестрикции типа IIS17,18, либо ПЦР19 с перекрывающимся расширением. Каждый из этих методов имеет свои преимущества и недостатки, но обычно они требуют нескольких практических этапов клонирования. Основное преимущество представленного здес...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано грантом Национального научного фонда IOS-1025642 (GBM). Мы благодарим Марию Харрисона за предоставление штамма ARqua1.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
NEBuilder® (Микс сборки HiFi DNA)New England BiolabsE5520
p201N:Cas9Addgene59175Плазмида p201H:Cas9 (59176) также совместима с зарегистрированными перекрытиями и ферментами.
pUC gRNA ShuttleAddgene47024
SwaINew England BiolabsR0604S
SpeINew England BiolabsR0133S
Zymo clean и концентратор-5 очистка колонкиZymo ResearchD4003
NEB Buffer 2.1New England BiolabsB7202S
NEB CutSmart (Буфер 4)New England BiolabsB7204S
NEB Buffer 3.1New England BiolabsB7203S
EconoSpin Mini Spin Spin Column (подготовка к плазмиде)Epoch Life Sciences1910-050/250
EcoRV-HF®Биолаборатории Новой АнглииR3195S
StyI-HF®New England BiolabsR3500S
MS Salts + Gamborg VitaminsPhytotechnology LaboratoriesM404
Phytagel™ (Геллановая камедь)Sigma AldrichP8169
GA-7 КоробкиSigma AldrichV8505
Микропоры хирургическая лента3M1535-0
Timentin® (Тикарциллин/клавулановая кислота)Различные0029-6571-26
Грунтовки 5' → 3'SwaI_MtU6F
 GATATTAATCTCTTCGATGA
AATTTATGCCTATCTTATAT
GATCAATGAGG
MtU6R   AAGCCTACTGGTTCGCTTG
AAG
ScaffoldF GTTTTAGAGCTAGAAATAGC
AAGTT<
em>SpeI_Scaffold RGTCATGAATTAATACGACTC
AAAAAAAAGCACCGACTCGGTG
StUbi3P218R ACATGCACCTAATTTCACTA
GATGT
ISceIRGTGATCGATTACCCTTAT
CCCTAG		Не может быть использован для секвенирования по Сэнгеру, так как на плазмиде
UNS1_Scaffold R GAGAATGGATGCGAGTAATGAA
AAAAAGCACCGACTCGGTG
UNS1_MtU6 F   CATTACTCGCATCCATTCTCAT
GCCTATCTTATATGATCAATGAGG
p201R CGCGCCGAATTCTAGTGATCG
Выделенные полужирным шрифтом последовательности обозначают 20-нт перекрытия с линеаризованными p201N:Cas9.
есть второй сайт связывания

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  2. Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
  3. Zhou, Y. X., et al. High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells. Nature. 509 (509), 487-491 (2014).
  4. Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), (2014).
  5. Belhaj, K., Chaparro-Garcia, A., Kamoun, S., Patron, N. J., Nekrasov, V. Editing plant genomes with CRISPR/Cas9. Current Opinion in Biotechnology. 32, 76-84 (2015).
  6. Bortesi, L., Fischer, R. The CRISPR/Cas9 system for plant genome editing and beyond. Biotechnology Advances. 33 (1), 41-52 (2015).
  7. Jia, H. G., Wang, N. Targeted genome editing of sweet orange using Cas9/sgRNA. Plos One. 9, (2014).
  8. Upadhyay, S. K., Kumar, J., Alok, A., Tuli, R. RNA-Guided Genome Editing for Target Gene Mutations in Wheat. G3-Genes Genomes Genetics. 3 (12), 2233-2238 (2013).
  9. Ron, M., et al. Hairy root transformation using Agrobacterium rhizogenes. as a tool for exploring cell type-specific gene expression and function using tomato as a model. Plant Physiology. 166 (2), 455-U4442 (2014).
  10. Jacobs, T. B., LaFayette, P. R., Schmitz, R. J., Parrott, W. A. Targeted genome modifications in soybean with CRISPR/Cas9. BMC Biotechnology. 15, (2015).
  11. Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome. Nature Methods. 7 (11), 901-903 (2010).
  12. Zhou, X., Jacobs, T. B., Xue, L. J., Harding, S. A., Tsai, C. J. Exploiting SNPs for biallelic CRISPR mutations in the outcrossing woody perennial Populus reveals 4-coumarate:CoA ligase specificity and redundancy. New Phytologist. , (2015).
  13. Stemmer, M., Thumberger, T., Keyer, M. D., Wittbrodt, J., Mateo, J. L. CCTop: An Intuitive, Flexible and Reliable CRISPR/Cas9 Target Prediction Tool. Plos One. 10, (2015).
  14. Lei, Y., et al. CRISPR-P: A Web Tool for Synthetic Single-Guide RNA Design of CRISPR-System in Plants. Molecular Plant. 7 (9), 1494-1496 (2014).
  15. Quandt, H. J., Puhler, A., Broer, I. TRANSGENIC ROOT-NODULES OF VICIA-HIRSUTA - A FAST AND EFFICIENT SYSTEM FOR THE STUDY OF GENE-EXPRESSION IN INDETERMINATE-TYPE NODULES. Molecular Plant-Microbe Interactions. 6, 699-706 (1993).
  16. Zhu, X. X., et al. An efficient genotyping method for genome-modified animals and human cells generated with CRISPR/Cas9 system. Scientific Reports. 4 (8), (2014).
  17. Belhaj, K., Chaparro-Garcia, A., Kamoun, S., Nekrasov, V. Plant genome editing made easy: targeted mutagenesis in model and crop plants using the CRISPR/Cas system. Plant Methods. 9 (1), 39(2013).
  18. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  19. Li, J. F., et al. Multiplex and homologous recombination-mediated genome editing in Arabidopsis and Nicotiana benthamiana using guide RNA and Cas9. Nat Biotech. 31 (8), 688-691 (2013).
  20. Fu, Y. F., Sander, J. D., Reyon, D., Cascio, V. M., Joung, J. K. Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. Nature Biotechnology. 32 (3), 279-284 (2014).
  21. Torella, J. P., et al. Unique nucleotide sequence-guided assembly of repetitive DNA parts for synthetic biology applications. Nat Protoc. 9 (9), 2075-2089 (2014).
  22. Ono, N. N., Tian, L. The multiplicity of hairy root cultures: Prolific possibilities. Plant Science. 180 (3), 439-446 (2011).
  23. Tepfer, D. Transformation of several species of higher plants by Agrobacterium rhizogenes.: sexual transmission of the transformed genotype and phenotype. Cell. 37 (3), 959-967 (1984).
  24. Li, H., Deng, Y., Wu, T. L., Subramanian, S., Yu, O. Misexpression of miR482, miR1512, and miR1515 Increases Soybean Nodulation. Plant Physiology. 153 (4), 1759-1770 (2010).
  25. Boisson-Dernier, A., et al. Agrobacterium rhizogenes-transformed roots of Medicago truncatula for the study of nitrogen-fixing and endomycorrhizal symbiotic associations. Molecular Plant-Microbe Interactions. 14 (6), 695-700 (2001).
  26. Collier, R., Fuchs, B., Walter, N., Kevin Lutke, W., Taylor, C. G. Ex vitro. composite plants: an inexpensive, rapid method for root biology. Plant Journal. 43 (3), 449-457 (2005).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

CRISPR Vector ConstructionDNA Assembly MethodTomato Hairy RootsGuide RNA DesignRestriction Enzyme DigestionDNA Amplification PCRPlasmid PurificationAgrobacterium TransformationGenetic Mutation AnalysisFunctional Genomics Studies

Related Articles