Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Нейтрофильная Выделение и анализ для определения их роли в клеточной лимфомы чувствительность к терапевтических агентов

15.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53846

⸱

25 марта 2016 г.

 , 
1Immunity, Microenvironment, Virus, Cancer Research Center in Lyon

В этой статье

Краткое содержание

Нейтрофилы являются наиболее распространенным типом белых кровяных телец. Описаны выделение нейтрофилов из крови человека методом разделения градиента плотности и дифференцировка промиелоцитарных (HL60) клеток человека по гранулоцитарному пути; Проверить их роль в чувствительности клеток лимфомы к антилимфомным агентам.

Аннотация

Нейтрофилы являются наиболее распространенным (от 40% до 75%) типом белых кровяных телец и одними из первых воспалительных клеток, мигрирующих к месту воспаления. Они являются ключевыми игроками во врожденной иммунной системе и играют важную роль в биологии рака. Нейтрофилы были предложены в качестве ключевых медиаторов злокачественной трансформации, опухолевой прогрессии, ангиогенеза и модуляции противоопухолевого иммунитета; за счет высвобождения ими растворимых факторов или взаимодействия с опухолевыми клетками. Чтобы охарактеризовать специфические функции нейтрофилов, необходим быстрый и надежный метод выделения in vitro нейтрофилов из крови человека. Здесь продемонстрирован метод разделения по градиенту плотности для выделения нейтрофилов, а также мононуклеарных клеток из крови. Процедура заключается в тщательном наслоении раствора градиента плотности, такого как Ficoll, над разбавленной кровью, полученной от пациентов с диагнозом хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ), с последующим центрифугированием, выделением мононуклеарного слоя, отделением нейтрофилов от эритроцитов с последующим лизисом остаточных эритроцитов. Было показано, что этот метод выделяет нейтрофилы ≥ 90 % чистоты. Чтобы имитировать микроокружение опухоли, были проведены трехмерные (3D) эксперименты с использованием матрицы базальной мембраны, такой как Matrigel. Учитывая короткий период полураспада нейтрофилов in vitro, 3D-эксперименты со свежими нейтрофилами человека не могут быть проведены. По этой причине промиелоцитарные клетки HL60 дифференцируются по гранулоцитарному пути с помощью индукторов диметилсульфоксида (ДМСО) и ретиноевой кислоты (РА). Целью наших экспериментов является изучение роли нейтрофилов на чувствительность клеток лимфомы к антилимфомным агентам. Тем не менее, эти методы могут быть обобщены для изучения взаимодействий нейтрофилов или нейтрофильных клеток с большим диапазоном типов клеток в различных ситуациях.

Введение

Врожденные иммунные клетки представляют собой существенную часть клеток внутри опухоли микроокружения и были связаны с злокачественности опухоли у пациентов , так и на животных моделях рака 1. В последнее время она стала более широкое признание , что хронические иммунные реакции играют важную роль в продвижении прогрессии опухоли, метастазирование и устойчивость к химиотерапиях 2. Макрофаги являются важными врожденные иммунные клетки , которые были показаны непосредственно регулируют реакцию опухолевых клеток к химиотерапии 3,4. Тем не менее, роль нейтрофилов, ключевых игроков врожденной иммунной системы, в регуляции ответа опухоли на лечение противораковым не известно. Цели этих протоколов использовать быстрый и надежного метода для разделения нейтрофилов из образцов крови ХЛЛ пациента и дифференцировать HL60 клетки вдоль гранулоцитарного пути для того, чтобы изучить их роль в регуляции чувствительности клеток лимфомы к анти-лимфомой агентов.

Нейтрофилы являются наиболее распространенными клеточный компонент врожденной иммунной системы в крови 5 и действовать в качестве первой линии обороны против вторжения микроорганизмов 6. Нейтрофилы играют существенную роль в повышении эффективной врожденной иммунной реакции в дополнение к переменной эффекторных функций в ряде патологических состояний 7. Таким образом, быстрый и надежным способом изолировать нейтрофилы от других клеток крови, таких как метод разделения градиента плотности, необходим для исследований в лабораторных условиях . При использовании этого метода для выделения нейтрофилов будет способствовать дальнейшим исследованиям по нейтрофильных опосредованной иммунологических функций в естественных условиях и бывших естественных условиях.

Возможность получения чистых популяций нейтрофилов является важным первым шагом для исследования пациентов с иммунологическими заболеваниями 8. Плотность градиентный метод разделения является идеальным метод, в котором получают высокий выход клеток. метоd включает добавление градиента плотности раствора в нижней части трубки, содержащей разбавленную кровь человека с последующим центрифугированием при 300 г в течение 35 мин без перерыва. Кольцо из мононуклеарных клеток появляется в интерфейсе и нейтрофилы располагаются ниже первого. Этот метод имеет существенные преимущества по сравнению с другими доступными методами , такими как нейтрофильные комплекты изоляции , которые значительно дороже 9. Кроме того, изолирующий нейтрофилы из крови человека с помощью коммерческих наборов с использованием антител, направленных к поверхностным маркером, специфичного для нейтрофилов человека, увеличивает риск активации или дифференциации клеток. Плотность градиентный метод разделения позволяет выделение нейтрофилами в течение короткого периода времени. В течение той же стадии, одноядерные клетки также отделяют и извлекают. Это фундаментальный метод, в котором высокий выход чистого клеток получается для достижения функциональной целостности.

Для того, чтобы имитировать microenv опухолиironment, были выполнены эксперименты 3D. Учитывая короткий период полураспада нейтрофилов в пробирке, 3D - эксперименты со свежими нейтрофилах человека не являются окончательными. По этой причине, промиелоцитарного (HL60) клетки дифференцироваться в нейтрофилами как клетки с использованием дифференциацией индукторов диметилсульфоксид (ДМСО) и ретиноевой кислоты (RA). Использование дифференцированных HL60 клеток (HL60 Diff) предотвратит имеющих различные реакции нейтрофилов из - за изоляции от различных доноров.

В пробирке 3D модели культуры представляют собой промежуточную стадию между ин витро 2D моделей и в естественных условиях модели. В 2D-культуре, клетки распространяются на пластиковой поверхности, образуя неестественные вложения клеток на депонированные белки, которые денатурируют на этой синтетической поверхности. И наоборот, клетки в форме 3D культуры вложений естественной межклеточных Поскольку клетки и внеклеточного матрикса, они синтезируют являются природным материалом, к которому они присоединены.По этой причине модели 3D совместно культуры, особенно между раковыми клетками и другими типами клеток, которые были очень полезны для индикации их вклад в рост опухоли, ангиогенез и метастазирование. В результате, 3D культуры делают культуру клеток имитировать физиологические условия , которые существуют в естественных условиях 10.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Выделение и Нейтрофильная Совместное культивирование с первичными лейкозных клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Процедуры проводились с одобрения комитета по этике больницы Lyon со всеми пациентами, подписывающих информированное согласие.

  1. Выделение первичных лейкозных клеток и нейтрофилы
    1. Собирают тюбика периферической крови на ЭДТА (1,8 мг ЭДТА на миллилитр крови) от больных с диагнозом хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ).
    2. Добавить каждые 15 мл крови в стерильный 50 мл пробирку и разбавляют 15 мл среды RPMI (разведение 1: 1), а затем осторожно и медленно добавляют 15 мл плотности раствора градиента к нижней части трубы без перемешивания фаз. Убедитесь, что раствор градиента плотности при комнатной температуре для подготовки.
    3. Центрифуга при 300 х г в течение 35 мин при комнатной температуре и без тормоза. Кровь следует разделить на четыре отдельные фазы , как показано на рисунке 1А, сверху вниз: тромбоциты и плазму, мононуклеаров (Wхите кольцо), раствор градиента плотности, гранулоциты и эритроциты.
    4. Собирают белое кольцо, которое представляет первичные лейкозных клеток с пластиковой пипетки Пастера и перехода на новую 50 мл трубки.
      1. Заполните трубку с PBS (содержит кальций и магний) до 50 мл, в целом и центрифуге при 300 г в течение 10 мин при комнатной температуре.
      2. Ресуспендируют осадок с 5 мл PBS, а затем добавить PBS до 50 мл в общей сложности и центрифуге при 300 г в течение 10 мин при комнатной температуре.
      3. Ресуспендируют осадок с полной средой RPMI (среды RPMI 1640 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 2 мМ глутамина, 100 ед / мл пенициллина и 100 мг / мл стрептомицина) для подсчета с использованием счетчика жизнеспособности клеток.
    5. Отберите верхние фазы, выходящие из фазы гранулоцитов и эритроцитах и ​​добавляют PBS до 25 мл, затем добавляют 3% декстран в 0,9% NaClup до 50 мл в общей сложности. Смешайте труб 10 раз и держать их в течение 30 мин при комнатной температуре без перемешивания.
    6. Соберите верхний РБК-бедную нейтрофилы слоя А.d поместить их в чистую стерильную пробирку на 50 мл и центрифугируют пробирки при 300 г в течение 10 мин при комнатной температуре. Ресуспендируют каждый осадок с 5 мл PBS затем добавить красный буфера для лизиса клеток до 50 мл в общей сложности.
    7. Хранить пробирки в темноте в течение 15 мин при комнатной температуре, то центрифуге при 500 г в течение 10 мин при комнатной температуре. Промыть гранулы с PBS (PBS добавляют до 50 мл в целом), а затем центрифуге при 500 г в течение 10 мин при комнатной температуре.
    8. Ресуспендируют гранулы с полной средой RPMI для подсчета с использованием счетчика жизнеспособности клеток. Хранить 3 х 10 5 каждого типа клеток в 50 мкл PBS-FBS (4%) в 5 мл пластиковых труб для определения чистоты их выделения с использованием проточной цитометрии.
  2. Анализ Появления Морфологические изолированного клеточных популяций
    1. Для этого, ресуспендируют каждый 3 × 10 4 нейтрофилы и 3 х 10 4 мононуклеарных клеток в 150 мкл полной среды RPMI. Собрать стеклянные слайды, процеживают карты, а также образцы камер в цитоспина центрифуге, гарантируя, что тон центрифуге хорошо сбалансирована.
    2. Поместите каждый тип клеток в камеру для образца и цито-центрифуге при 750 мкг в течение 10 мин при комнатной температуре Удалить слайды, фильтровальные карты и камеры образцов из центрифуги. Разберите осторожно, чтобы не повредить клетки на слайде. Выбросите фильтр карты и образцы камер.
    3. Пятно клеток с использованием набора для окрашивания Giemsa и сохранить слайды в течение 1 часа, чтобы высохнуть. Осмотрите клетки под микроскопом с увеличением 100X.
  3. Проверка чистоты выделенных клеток с помощью FACS
    1. Этикетка изолированных первичных лейкозных клеток с CD19 антителом против человека , конъюгированного с APC (5 мкл / 10 6 клеток). Этикетка очищенные нейтрофилы с смесью анти-антител человека , перечисленных в таблице 1 (5 мкл / 10 6 клеток). Инкубируйте клетки в темноте в течение 30 мин при 4 о С.
    2. Промывают клетки с 500 мкл PBS-FBS (4%) в центрифуге трубках при 300 г в течение 5 мин при комнатной температуре.
    3. Ресуспендируют каждый осадок в 200 мкл PBS-FBS (4%).
    4. Анализ на проточном цитометре, используя следующую оптическую конфигурацию: 488 нм лазер: FSC-A (488 нм), SSC-A (488 / 10BP), FITC (530/30 ВР), PerCP-Cy5.5 (695/40 ВР ), ПЭ (575/26 ВР); 633 нм лазер: APC (660/20 ВР), APC-Cy7 (780/60 ВР). Убедитесь, что компенсация цвета.
  4. Совместное культивирование первичных лейкозных клеток с аутологичными нейтрофилы
    1. Затравочного монокристалла 2 х 10 5 клеток / мл в одиночку или с аутологичной нейтрофилами при соотношении 1:10 в полной среде RPMI первичных лейкозных клеток. Для этого отрегулировать количество клеток путем разбавления суспензии клеток и добавить 2 х 10 5 клеток / мл первичных лейкозных клеток до 2 × 10 6 клеток / мл нейтрофилы. Тщательно перемешать.
    2. Добавьте 25 мкМ тирозинкиназы (Btk) ингибитор Брутона (ибрутиниб) к клеткам. Инкубируют в течение 24 ч при 37 ° С с 5% CO 2.
  5. Cell Harvest и анализ FACS
    1. CollECT клетки в 5 мл пластиковые пробирки для анализа FACS и центрифугировать трубках при 300 г в течение 5 мин при комнатной температуре. Промыть гранулы с 1 мл PBS-FBS (4%), а затем центрифуге при 300 г в течение 5 мин при комнатной температуре.
    2. Ресуспендируют гранулы в аннексина V и PI с использованием коммерческого набора и инкубировать клетки в темноте в течение 10 мин при комнатной температуре. Анализ на проточном цитометре с использованием стратегии стробирования фиг.2А и следующей оптической конфигурации: 488 нм лазер: FSC-A (488 нМ), SSC-A (488 / 10BP), FITC (530/30 ВР), PI (610 / 20 ВР). Убедитесь, что компенсация цвета.

2. Дифференциация HL60 клеток вдоль гранулоцитарного Pathway и их сокультивирования с RL лимфома В-клеток в 3D модели

  1. Дифференциация человеческого промиелоцитарного (HL60) клеток в нейтрофилами как клетки
    1. Отрегулируйте количество HL60 клеток до 3 × 10 5 клеток / мл затем добавьте 1 мкМ ретиноевой кислоты (RA) и 1,25% ДМСО , чтобы побудить их дифференциацию. Семенной каждый 3 х 10 5 HL60 клеток на лунку в 48-луночный планшет , а затем инкубируют в течение 48 ч при температуре 37 ° С с 5% CO 2.
    2. Позже, сбора клеток и центрифугируют при 300 г в течение 5 мин при комнатной температуре. Ресуспендируют клеток с полной средой RPMI для подсчета с использованием счетчика жизнеспособности клеток.
    3. Затем разбавленные суспензии клеток в полной среде RPMI , чтобы регулировать количество HL60 клеток до 3 х 10 5 клеток / мл и индуцируют снова их дифференцировку путем добавления 1 мкМ ретиноевой кислоты (RA) и 1,25% ДМСО. Семенной 3 × 10 5 клеток HL60 каждый на лунку в 48-луночный планшет и инкубируют в течение еще ​​48 ч при температуре 37 ° С с 5% CO 2.
  2. Анализ дифференциации HL60 (HL60 Diff)
    1. Сбора клеток и центрифугировать пробирки при 300 г в течение 5 мин при комнатной температуре. Ресуспендируют осадок с полной средой RPMI для подсчета с использованием счетчика жизнеспособности клеток.
    2. Для анализа изменений в экспрессии маркеров клеточной поверхности с помощью проточной цитометрии. Поместите каждый 3 х 10 5 недифференцированные клетки HL60 (из клеточной культуры) и 3 × 10 5 HL60 Diff клеток в 5 мл пластиковые пробирки для анализа FACS и центрифугировать трубках при 300 г в течение 5 мин при комнатной температуре.
    3. Ресуспендируют гранул в 50 мкл PBS-FBS (4%). Этикетка клетки с античеловеческой CD11b , конъюгированных с AF700 или CD38 античеловеческой , конъюгированного с APC (5 мкл / 10 6 клеток). Инкубируйте клетки в темноте в течение 30 мин при 4 о С.
    4. Промыть 500 мкл PBS-FBS (4%), а затем центрифуге при 300 г в течение 5 мин при комнатной температуре. Ресуспендируют гранул в 200 мкл PBS-FBS (4%).
    5. Анализ на проточном цитометре с использованием стратегии стробирования фиг.3А и следующую оптическую конфигурацию: 488 нм лазер: FSC-A (488 нм), SSC-A (488 / 10BP); 633 нм лазер: APC (660/20 ВР), Alexa Fluor 700 (730/45 ВР).
    6. Чтобы проверить морфологические изменения в HL60 Diff, иммобилизации клеток на стеклах для микроскопического исследования.
      1. Для этого, ресуспендируют каждый 3 × 10 4 недифференцированные клетки HL60 (из клеточной культуры) и 3 х 10 4 HL60 дифференциал в 150 мкл полной среды RPMI. Собирают стеклянные слайды, фильтровальные карты и камеры образцов в цитоспина центрифуге, гарантируя, что центрифуга сбалансирован.
      2. Поместите каждый тип клеток в камеру для образца и цито-центрифуге при 1500 оборотах в минуту в течение 10 мин при комнатной температуре. Удалить слайды, процеживают карты и камеры образцов из центрифуги. Разберите осторожно, чтобы не повредить клетки на слайде. Выбросите фильтр карты и образцы камер.
      3. Пятно клеток с использованием набора для окрашивания Giemsa и сохранить слайды в течение 1 часа, чтобы высохнуть. Осмотрите клетки под микроскопом с увеличением 100X.
  3. 3-мерные (3D) Культура
    Примечание: Убедитесь, что материалы, используемые в этом эксперименте, холодный и эксперимент проходит на льду.
    1. Ресуспендируют каждые 5 х 10 4 клеток RL, либо по отдельности , либо в смеси с HL60 Diff В соотношении RL: HL60 Diff 1:10, с 300 мкл матрицы базальной мембраны с использованием 1 мл пипетки разрезать стерильным ножницами, чтобы расширить отверстие до приблизительно 2 до 3 мм. Избегайте пузырьков во время этого шага.
    2. Семенной каждые 300 мкл суспензии клеток / лунку в 24-луночный планшет. Избегайте пузырьков во время этого шага. Инкубируйте планшет в течение 30 мин при 37 ° С с 5% CO 2 , затем добавляют 1 мл полной RPMI среду для каждой лунки и инкубируют в течение 7 дней при температуре 37 ° С с 5% CO 2. Изменение среды каждые два дня. Добавьте 10 нМ винкристина в 5-й день.
  4. Анализ FACS
    1. Через 7 дней культивирования, аспирация средних и мыть каждую лунку с 1 мл охлажденного льдом PBS дважды. Добавьте 3 мл / лунку охлажденного льдом PBS-ЭДТА (5 мМ). Отделить гель из нижней части скважины путем соскоба с помощью нижней части 200 мкл кончика пипетки. Встряхните пластину осторожно на льду в течение 30 мин.
    2. Передача клеточной суспензии в стерильной 15 мл пробирку и встряхните пробирки осторожно ICе в течение еще 30 мин. Проверьте для появления однородной клеточной суспензии. (Если это не так, то трясти клетки в течение длительного времени или добавить больше PBS-EDTA).
    3. Центрифуга трубки при 300 х г в течение 10 мин при комнатной температуре. Промыть гранулы с PBS затем центрифуги при 300 мкг в течение 10 мин при комнатной температуре.
    4. Ресуспендируют с PBS-FBS (4%) и маркируют с CD19 антителом против человеческого , конъюгированное с РЕ-Cy7 и СD38 - антитело , анти-человеческий , конъюгированного с APC (5 мкл / 10 6 клеток). Инкубируют в темноте в течение 30 мин при 4 ° С ,
    5. Промыть 500 мкл PBS-FBS (4%), а затем центрифужные пробирки при 300 г в течение 5 мин при комнатной температуре. Ресуспендируют клетки с аннексина V и PI с использованием коммерческого набора.
    6. Анализ на проточном цитометре с использованием стратегии стробирования фиг.4А и следующая оптическая конфигурация: 488 нм лазер: FSC-A (488 нМ), SSC-A (488 / 10BP), FITC (530/30 ВР), PI (610 / 20 ВР), PE-Cy7 (780/60 ВР); 633 нм лазер: APC (660/20 ВР). Убедитесь, что компенсация цвета.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Плотность градиентный метод разделения , описанный здесь обеспечивает первичные лейкозных клеток и нестимулированных нейтрофилы , выделенные из крови пациентов с ХЛЛ Фигура 1А представляет различные слои крови , полученные после центрифугирования в градиенте плотности (сверху вниз:. Тромбоциты и плазму, белое кольцо представляет собой одноядерные клетки, градиент плотности раствора, гранулоциты и эритроциты). Рисунок 1В и 1С показывают различия в морфоло...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Описанная здесь, эффективный, простой, быстрый и недорогой протокол для выделения нейтрофилов из крови человека с высокой степенью чистоты с использованием центрифугирование в градиенте плотности подход и в пределах той же стадии мононуклеарных клеток также отделяют и извлекают. Популяции изолированных клеток являются ≥90% чистоты.

Существует несколько методов для выделения нейтрофилами крови человека. К ним относятся подобные методы с использованием разрывных градиентов 11,12, ил...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальным институтом рака (INCa-DGOS-4664).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
RPMI 1640 Gibco Invitrogen21875-034
Фетальная бычья сыворотка (FBS)Gibco Invitrogen10270-106
Фосфатно-солевой буфер (PBS содержит кальций и магний)Gibco Invitrogen14040-091
N-ацетил-L-аланил-L-глутамин (L-глутамин)Life technologies25030-024
Пенициллин стрептомицин (Pen Strep)Life technologies15140-122
Ингибитор тирозинкиназы (Btk) Брутона (Ибрутиниб) CliniSciencesA3001
Винкристин EG labo
BD Matrigel матрица базальной мембраны BD Biosciences354234Поместить в 4 oC на ночь (O/N) до дня эксперимента
Буфер для лизиса эритроцитов BD Biosciences555899
Ficoll (Pancoll)PAN BiotechP04-60500
Dextran Sigma-AldrichD8906
Диметилсульфоксид (ДМСО)Sigma-AldrichD8418
Ретиноевая кислотаSigma-AldrichR2625
Бычий сывороточный альбумин (BSA)Sigma-AldrichA7906
Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА)Sigma-AldrichE5134
Хлорид натрия (NaCl)EuromedexS3014
Прилагаемый набор для окрашивания V-FLOUS Рош11  988  549  001
Набор RAL 555 Модифицированный набор для окрашивания GiemsaCosmos BiomedicalCB361550-0000
LSRII Проточная цитометрияBD Biosciences
ЦитоцентрифугаThermo Scientific
Leica DMR-XA микроскопLeica Microsystems
Cellometer Auto T4 Счетчик жизнеспособности клетокNexcelom  Бионаука

Ссылки

  1. Gocheva, V., et al. IL-4 induces cathepsin protease activity in tumor-associated macrophages to promote cancer growth and invasion. Genes Dev. 24, 241-255 (2010).
  2. Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. Immunity, Inflammation, and Cancer. Cell. 140, 883-899 (2010).
  3. Mitchem, J. B., et al. Targeting tumor-infiltrating macrophages decreases tumor-initiating cells, relieves immunosuppression, and improves chemotherapeutic responses. Cancer Res. 73, 1128-1141 (2013).
  4. DeNardo, D. G., et al. Leukocyte Complexity Predicts Breast Cancer Survival and Functionally Regulates Response to Chemotherapy. Cancer Discov. 1, 54-67 (2011).
  5. Di Carlo, E., et al. The intriguing role of polymorphonuclear neutrophils in antitumor reactions. Blood. 97, 339-345 (2001).
  6. Kumar, V., Sharma, A. Neutrophils: Cinderella of innate immune system. Int. Immunopharmacol. 10, 1325-1334 (2010).
  7. Mantovani, A., Cassatella, M. A., Costantini, C., Jaillon, S. Neutrophils in the activation and regulation of innate and adaptive immunity. Nat. Rev. Immunol. 11, 519-531 (2011).
  8. Kelbaek, H. Sterile isolation of polymorphonuclear leukocytes from large blood volumes. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. Z. FürKlin. Chem. Klin. Biochem. 23, 17-20 (1985).
  9. Aynaud, M. -M., et al. Human Tribbles 3 protects nuclear DNA from cytidine deamination by APOBEC3A. J. Biol. Chem. 287, 39182-39192 (2012).
  10. Ziòłkowska, K., et al. Long-term three-dimensional cell culture and anticancer drug activity evaluation in a microfluidic chip. Biosens.Bioelectron. 40, 68-74 (2013).
  11. Eggleton, P., Gargan, R., Fisher, D. Rapid method for the isolation of neutrophils in high yield without the use of dextran or density gradient polymers. J. Immunol. Methods. 121, 105-113 (1989).
  12. Behnen, M., et al. Immobilized immune complexes induce neutrophil extracellular trap release by human neutrophil granulocytes via FcγRIIIB and Mac-1. J. Immunol. Baltim.Md 1950. 193, 1954-1965 (2014).
  13. Hirsch, G., Lavoie-Lamoureux, A., Beauchamp, G., Lavoie, J. -P. Neutrophils are not less sensitive than other blood leukocytes to the genomic effects of glucocorticoids. PloS One. 7, 44606(2012).
  14. Dorward, D. A., et al. Technical advance: autofluorescence-based sorting: rapid and nonperturbing isolation of ultrapure neutrophils to determine cytokine production. J. Leukoc. Biol. 94, 193-202 (2013).
  15. Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments. J Vis Exp. , e50586(2013).
  16. Scaife, H., Woldehiwet, Z., Hart, C. A., Edwards, S. W. Anaplasmaphagocytophilum reduces neutrophil apoptosis in vivo. Infect. Immun. 71, 1995-2001 (2003).
  17. Maianski, N. A., Maianski, A. N., Kuijpers, T. W., Roos, D. Apoptosis of neutrophils. ActaHaematol. 111, 56-66 (2004).
  18. Dalton, W. T., et al. HL-60 cell line was derived from a patient with FAB-M2 and not FAB-M3. Blood. 71, 242-247 (1988).
  19. Hogan, C., Kajita, M., Lawrenson, K., Fujita, Y. Interactions between normal and transformed epithelial cells: Their contributions to tumourigenesis. Int. J. Biochem. Cell Biol. 43, 496-503 (2011).
  20. Page, H., Flood, P., Reynaud, E. G. Three-dimensional tissue cultures: current trends and beyond. Cell Tissue Res. 352, 123-131 (2013).
  21. Mantovani, A. Macrophages, Neutrophils, and Cancer: A Double Edged Sword. New J. Sci. , 271940(2014).
  22. Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 3, 309-322 (2012).
  23. Shojaei, F., Ferrara, N. Refractoriness to antivascular endothelial growth factor treatment: role of myeloid cells. Cancer Res. 68, 5501-5504 (2008).
  24. Liang, J., et al. Neutrophils promote the malignant glioma phenotype through S100A4. Clin Cancer Res Off J Am Assoc Cancer Res. 20, 187-198 (2014).
  25. Teramukai, S., et al. Pretreatment neutrophil count as an independent prognostic factor in advanced non-small-cell lung cancer: an analysis of Japan Multinational Trial Organisation LC00-03. Eur. J. Cancer Oxf.Engl 1990. 45, 1950-1958 (2009).
  26. Zhu, Q., et al. The IL-6-STAT3 axis mediates a reciprocal crosstalk between cancer-derived mesenchymal stem cells and neutrophils to synergistically prompt gastric cancer progression. Cell Death Dis. 5, 1295(2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Центрифугирование в градиенте плотностианализ методом проточной цитометрии3D-модели совместного культивированиядифференцировка HL60седиментация декстранализис эритроцитовмаркеры CD15 и CD16матрикс Matrigel
Нейтрофильная Выделение и анализ для определения их роли в клеточной лимфомы чувствительность к терапевтических агентов
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.