Method Article

Капиллярная основе центробежные Микрожидкостных Прибор для размера контролируемым формирования монодисперсных микрокапель

DOI:

10.3791/53860

⸱

February 22nd, 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Computational Intelligence and Systems Science, Interdisciplinary Graduate School of Science and Engineering, Tokyo Institute of Technology, 2Graduate School of Bioscience and Biotechnology, Tokyo Institute of Technology, 3Department of Mechanical Engineering, Keio University, 4PRESTO, Japan Science and Technology Agency

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы демонстрируем простой метод производства контролируемых по размеру монодисперсных микрокапель типа «вода в масле» (W/O) с использованием капиллярного центробежного микрофлюидного устройства. Этот метод требует небольшого объема образца и позволяет получить высокопроизводительное производство. Мы ожидаем, что этот метод будет полезен для быстрого биохимического и клеточного анализа.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы демонстрируем простой способ быстрого производства размера контролируемым, монодисперсных, W микрокапель / вывода с использованием капиллярной основе центробежной микрожидкостных устройств. микрокапли Вт / вывода были недавно использованы в мощных методов, которые позволяют миниатюрных химических опытов. Таким образом, разработка универсальный метод для получения монодисперсных Вт требуется / вывода микрокапель. Мы разработали способ генерации монодисперсных Вт микрокапель / вывода на основе капиллярного основе центробежной осесимметричного совместно течет микрожидкостных устройств. Нам удалось регулировать размер микрокапель путем регулировки капиллярную отверстие. Наш метод требует оборудования, которое легче в использовании, чем с другими микрофлюидальных методов, требует лишь небольшого объема (0,1-1 мкл) раствора образца для инкапсуляции и позволяет производить сотни тысяч числа W микрокапель / вывода в секунду , Мы ожидаем, что это метод поможет биологические исследования, которые требуют драгоценное биологическую Samples по сохранению объема образцов для быстрого количественного биохимического анализа и биологических исследований.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В / М микрокапли 1-5 имеют много важных приложений для изучения биохимии и биотехнологии, в том числе белкового синтеза 6, 7 кристаллизации белков, эмульсии ПЦР 8,9, сотовый инкапсуляции 10 и строительство искусственных клеток-подобных системах 5,6. Чтобы произвести микрокапель Вт / вывода для этих приложений, важные критерии контроль размера и monodispersibility микрокапель Вт / вывода. Микрожидком устройства для изготовления монодисперсных, размер контролируемым Вт / вывода микрокапель 11 основаны на взаимодействии текучий методом 12,13, 14,15 методом проточной фокусировки и способ Т-перехода 16 в микроканалов. Хотя эти методы дают весьма монодисперсных W микрокапель / вывода, процесс микротехнологий требует сложной обработки и специализированные методики для подготовки микроканалов, а также требует большого количества раствора образца (по крайней мере, несколько сотен81; л) из-за неизбежного мертвого объема в шприцевые насосы и трубы, которые проводят растворе образца, микроканалов. Таким образом, метод прост в использовании и низким мертвым объемом для генерации монодисперсных Вт необходим / вывода микрокапли.

Эта статья, вместе с видео, экспериментальных процедур, описывает центробежный капиллярную основе осесимметричной сотрудничества сыпучих микрожидкостных устройство 17 для генерации клеток размера, монодисперсное без микрокапель (рисунок 1). Этот простой метод достигает размера монодисперсность и размер управляемость. Она требует только настольный мини-центрифуги и капиллярную основе осесимметричной сотрудничества сыпучих микрожидкостных устройств фиксированной в микропробирок выборки. Наш метод нуждается лишь очень небольшой объем (0,1 мкл), и не тратить значительный объем образца.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Изготовление капилляра основе микрожидкостных устройств

  1. Настройка держателей
    Примечание: Конструкция держателя представлен на фиг.2A.
    1. Вырез каждого из четырех дисков держателей (фиг.2А (I) - (IV)) из 2-мм толщиной полиацетальной пластиковой пластине с помощью фрезерного станка. Используйте следующие размеры для каждого из четырех дисков в держателе: (I) диск диаметром 1 8,5 мм, капиллярная отверстие (СН) диаметр 1,3 мм, отверстие под винт (SH) диаметр 1,8 мм; (Б) диск 2 Диаметр 8,7 мм, диаметр СН 2,0 мм, диаметр 1,8 мм SH; (III) диск 3 диаметром 8,7 мм, диаметр СН 0,5 мм, диаметр 1,8 мм SH; и (IV) диск 4 Диаметр 9,1 мм, СН диаметр 1,0 мм, диаметр 1,8 мм SH.
    2. Соберите держатели используя M2 × 40 винты (рис 2б). Дно часть держателя (рис 2В) состоит из диска 1 и диска 2 на фиг.2А (I), (II) и верхнюю часть (рисЮр 2B) держателя состоит из диска 3 и диском 4 в рисунке 2А (III), (IV).
      1. Для построения нижнюю часть держателя, вставьте винт в три SH каждого диска 1 и 2. Сократить винты по колючий от кусок части резьбы. Хранить длину винта на 0,9 см (той же длины, как в нижней части держателя).
      2. Для построения верхнюю часть держателя, вставьте винты в двух SH каждого диска 3 и 4. Сократить винты по колючий от кусок части резьбы. Хранить длину винта на 0,7 см (той же длины, как в верхней части держателя).
      3. Чтобы собрать держатель, присоединиться к дну и верхние части держателя, используя длинный винт.
        Примечание: Держите длину каждой части держателя точным: нижняя часть составляет 0,9 см; верхняя часть составляет 0,7 см (рис 2b).
  2. Изготовление стеклянных капилляров
    1. Используйте два типа стеклянных капилляров: внутреннее стекло капиллярные (Наружный диаметр (OD) / Внутренний диаметр (ID): 1,0 / 0,6 мм) и внешний стеклянный капилляр (OD / ID: 2.0 / 1.12 мм).
    2. Используйте стеклорез разделить внешнюю стеклянный капилляр на три равные части, а затем использовать стеклорез разделить внутреннюю стеклянный капилляр на две равные части.
    3. Четкость каждый из которых разделен внутренние и внешние капилляры стекла с использованием стеклянного капиллярного съемник (рис 3а). Установите вес съемника при макс. Установите уровень тепла съемник под углом 60 градусов для внешней стеклянного капилляра и 70 градусов для внутренней капилляра. Осторожно заточить стеклянный капилляр.
      1. Хранить длине наконечника в суженной части стеклянного капилляра: внутренний капилляр 1,5-1,8 см; внешний капилляр 0,8-1,0 см (рис 3C). Если эта длина короче или длиннее, чем описанная длина, пожалуйста регулировать уровень тепла съемник.
    4. FIX внутренней или наружной стеклянные капилляры к microforge стоять с помощью липкой ленты (рис 3B).
    5. Отрежьте верхушку стеклянного капилляра с помощью microforge в три этапа (рис 3В): (я) прикоснуться кончиком стеклянного капилляра к стеклянным бисером на платиновой проволоки, (II) нагреть платиновую проволоку наступив на ногу переключиться на 1-2 сек, и (III) через 1-2 сек, отрезать кончик стеклянный капилляр путем охлаждения платиновой проволоки.
      1. Регулировка диаметры внутренней (D I) и внешней (г о) капиллярных отверстий, соответственно. Диаметр отверстия внутреннего стеклянного капилляра составляет 5, 10, и 20 мкм (d = я 5,10, 20 мкм) и внешний стеклянный капилляр (д о) 60 мкм (d о = 60 мкм) в этом эксперименте.
        Примечание: стеклянный капилляр является одноразовым. Повторите изготовление стеклянной капиллярх гг.

2. Порядок микрокапель генерирующая W / O

  1. Заполните внешнюю стеклянный капилляр с нефтесодержащих ПАВ. Смесь масла и поверхностно-активного вещества является гексадекан, содержащим 2% (вес / вес) сорбита в этом эксперименте (фиг.4А).
    Примечание: Есть много комбинаций масел и поверхностно-активных веществ (например, масла могут быть фторированной или газированной; поверхностно-активные вещества могут быть ионными, неионные, или фторсодержащей).
    1. Представьте 10 мкл гексадекана содержащий моноолеат в наружную стеклянного капилляра. В фиг.4А, диаметр отверстия наружного стеклянного капилляра (д O) составляет 60 мкм (d о = 60 мкм). Чтобы отрегулировать отверстие стеклянной капиллярной, вернуться к шагам 1.2.4-1.2.5.
  2. Установите наружную капилляр в нижней части держателя (рис 4В).
  3. Драж около 0,1 мкл водного раствора во внутреннюю стеклянного капилляра (рис 4C) под действием капиллярных сил. В фиг.4С, диаметр отверстия внутреннего стеклянного капилляра (д I) составляет 10 мкм (д I = 10 мкм). Чтобы отрегулировать отверстие в стеклянный капилляр, вернуться к шагам 1.2.4-1.2.5.
  4. Установите внутреннюю капилляр в верхней части держателя (рис 4D-а). Вставьте внутреннюю капилляр в космическом капилляра (рис 4D-а). Глядя на белую точку круга как на фиг.4D-а, наблюдать положение внутренней капилляра внутри наружной капилляра (внутренний диаметр наружного капилляра (ш) = 130 мкм) (рис 4D-B, C) ​​с использованием цифровой микроскоп , Положение внутренней капилляра во внешнем капилляра должен быть установлен в ш = 100-150 мкм.
    Примечание: Чтобы изменить положение внутреннийкапиллярная во внешнем капилляра, пожалуйста повернуть винт в верхней части держателя. Таким образом, расстояние ш можно контролировать точно.
  5. Представьте 100 мкл гексадекана содержащий моноолеат (2% вес / вес) в нижней части 1,5 мл образца микропробирок. Установите держатель, с внутренней и наружной капилляров, в образце микропробирок (рис 4E-а). Обязательно проверьте внешний капилляр, чтобы держать его подальше от границы раздела воздух-масла (рис 4E-б).
  6. Центрифуга образец микропробирки с помощью мини-центрифуги настольные качается отъезда типа на тяжести 1600 мкг в течение 1-2 сек, чтобы сгенерировать микрокапель (рис 4F). Выполнить все эксперименты при комнатной температуре.
    Примечание: Используйте качается отъезда типа центрифуги. Каплю может столкнуться с боковой стенкой образца микропробирок и распадаются, когда используется с фиксированным углом типа центрифуги.
  7. Медленно составить W / O капельки пипеткой, а затем, положить их на стеклянную сLiDE.
  8. Захват изображения микрокапель генерируется с использованием цифровой микроскоп (увеличение, 200X).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом исследовании мы представляем простой метод для генерации клеток размера микрокапель Вт / вывода с помощью капиллярной основе центробежной микрожидкостных устройств (рисунок 1). Микрожидкостных Устройство состоит из держателя капиллярной (Фигура 2В), две стеклянные капилляры (внутренний и внешний стеклянные капилляры в фиг.3С), и микропробирки, содержащей масло, включая ПАВ. Мы вводили 0,1 мкл раствора образца во внутреннюю стеклян...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Используя это устройство, монодисперсных без микрокапель были сгенерированы Плато-Рэлея неустойчивости струи потока 17. Микроскопическое исследование не выявило наличие капель-спутников. При изготовлении устройства, три важные шаги необходимы, чтобы успешно генерировать монодисперсных W микрокапель / вывода. Во-первых, чтобы поставлять прямую поток нефти, содержащей поверхностно-активное вещество и водного раствора, капиллярные отверстия четырех дисков должны быть расположены в концентрической рисунком. Во-вт...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Конфликты интересов не декларируются.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана исследовательской областью PRESTO "Дизайн и управление клеточными функциями" Японского агентства по науке и технике (JST), грантом на научные исследования в инновационных областях "Молекулярная робототехника" (проект No 24104002) от Министерства образования, культуры, спорта, науки и технологий (MEXT), Японией, грантом для молодых ученых (A) (проект No 24680033) и научными исследованиями (B) (проект No 26280097) от Японского общества Продвижение науки (JSPS) и курс «Творческий дизайн для бионауки и биотехнологии» Школы бионаук и биотехнологии Токийского технологического института.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Инструмент из полиацетального пластика толщиной 2 ммNikkyoTechnos, Co., Ltd. (Япония)244-6432-08
Фрезерный станокИнструмент RolandDG Co., Ltd. (Япония)MDX-40A
Концевая фреза RSE230-0,5 * 2,5ИнструментNS Tool Co., Ltd. (Япония) 01-00644-00501
M2 * 40 винтовИнструментJujo Synthetic Chemistry Labo. (Япония)0001-024 (Английский)
Инструмент для снятия стеклаNarishige (Япония)Инструмент для
микрокузницыNarishige (Япония)MF-900
Внутренний стеклянный капиллярныйинструментNarishige (Япония)
Внешний стеклянный капиллярныйинструментWorld Precision Instruments Inc. (США)1B200-6
1,5 мл Инструмент для пробирки с образцамиINA OPTIKA CO., LTD (Япония)ST-0150F
ГексадекановыйреагентWako Pure Chemical Industries Ltd. (Япония)080-03685 
Моноолеат сорбитана (Span 80)РеагентTokyo Chemical Industry Co., Ltd. (Япония)Реактив системы S0060
Milli QMerck Millipore Corporation (Германия)ZRQSVP030
Мини-центрифуга откидного типаHitechCo., Ltd. (Япония)ATT101
KEYENCE Corporation (Япония)VHX-2001
PC-10 G-1 Цифровой микроскоп

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Song, H., Chen, D. L., Ismagilov, R. F. Reactions in droplets in microfluidic channels. Angew. Chem., Int. Ed. 45 (44), 7336-7356 (2006).
  2. Huebner, A., et al. Microdroplets: a sea of applications? Lab Chip. 8, 1244-1254 (2008).
  3. Taly, V., Kelly, B. T., Griffiths, A. D. Droplets as microreactors for highthroughput biology. ChemBioChem. 8 (3), 263-272 (2007).
  4. Teh, S. Y., Lin, R., Hung, L. H., Lee, A. P. Droplet microfluidics. Lab Chip . 8, 198-220 (2008).
  5. Takinoue, M., Takeuchi, S. Droplet microfluidics for the study of artificial cells. Anal. Bioanal. Chem. 400 (6), 1705-1716 (2011).
  6. Hase, M., Yamada, A., Hamada, T., Baigl, D., Yoshikawa, K. Manipulation of cell-sized phospholipid-coated microdroplets and their use as biochemical microreactors. Langmuir. 23 (2), 348-352 (2007).
  7. Zheng, B., Tice, J. D., Roach, L. S., Ismagilov, R. F. A Droplet-Based, Composite PDMS/Glass Capillary Microfluidic System for Evaluating Protein Crystallization Conditions by Microbatch and Vapor-Diffusion Methods with On-Chip X-Ray Diffraction. Angew. Chem., Int. Ed. 43 (19), 2508-2511 (2004).
  8. Nakano, M., et al. Single-molecule PCR using water-in-oil emulsion. J. Biotechnol. 102 (2), 117-124 (2003).
  9. Diehl, F., et al. BEAMing: single-molecule PCR on microparticles in water-in-oil emulsions. Nat. Methods. 3, 551-559 (2006).
  10. He, M., et al. Selective encapsulation of single cells and subcellular organelles into picoliter- and femtoliter-volume droplets. Anal. Chem. 77 (6), 1539-1544 (2005).
  11. Baroud, C., Gallaire, F., Dangla, R. Dynamics of microfluidic droplets. Lab Chip. 10, 2032-2045 (2010).
  12. Utada, A. S., Nieves, A. F., Stone, H. A., Weitz, D. A. Dripping to jetting transitions in coflowing liquid streams. Phys. Rev. Lett. 99 (9), 094502(2007).
  13. Cramer, C., Fischer, P., Windhab, E. J. Drop formation in a co-flowing ambient fluid. Chem. Eng. Sci. 59 (15), 3045-3058 (2004).
  14. Anna, S. L., Bontoux, N., Stone, H. A. Formation of dispersions using "flow-focusing" in microchannels. Appl. Phys. Lett. 82, 364-366 (2003).
  15. Takeuchi, S., Garstecki, P., Weibel, D. B., Whitesides, G. M. An axisymmetric flow-focusing microfluidic device. Adv. Mater. 17 (8), 1067-1072 (2005).
  16. Thorsen, T., Roberts, R. W., Arnold, F. H., Quake, S. R. Dynamic pattern formation in a vesicle-generating microfluidic device. Phys. Rev. Lett. 86 (18), 4163-4166 (2001).
  17. Yamashita, H., et al. Generation of monodisperse cell-sized microdroplets using a centrifuge-based axisymmetric co-flowing microfluidic device. J. Biosci. Biotech. 119 (4), 492-495 (2015).
  18. Maeda, K., Onoe, H., Takinoue, M., Takeuchi, S. Controlled synthesis of 3D multi-compartmental particles with centrifuge-based microdroplet formation from a multi-barrelled capillary. Adv. Mater. 24 (10), 1340-1346 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Capillary based Centrifugal Microfluidic DeviceMonodisperse Microdroplet FormationSize controllable MicrodropletsWater in Oil MicrodropletsCentrifugal MicrofluidicsCapillary Orifice ControlMicrodroplet GenerationMicrofluidic Device AssemblyCentrifuge OperationMicrodroplet Size Control

Related Articles