Методическая статья

Флуоресцентная Покадровый Визуализация Complete

16.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53863

⸱

28 февраля 2016 г.

 ,  , 
1Department of Molecular Microbiology, John Innes Centre, Norwich Research Park, 2Department of Biology, Lund University

В этой статье

Уведомление об исправлении

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Краткое содержание

Streptomyces характеризуются сложным жизненным циклом, который было экспериментально сложно изучить с помощью клеточной биологии. В данной работе мы представляем протокол проведения флуоресцентной покадровой микроскопии полного жизненного цикла путем выращивания Streptomyces venezuelae в микрофлюидном устройстве.

Аннотация

Визуализация живых клеток биологических процессов на уровне одной клетки сыграла важную роль в нашем современном понимании субклеточной организации бактериальных клеток. Тем не менее, применение покадровой микроскопии для изучения клеточных биологических процессов, лежащих в основе развития спорулирующих нитчатых бактерий Streptomyces, было затруднено техническими трудностями.

Здесь мы представляем протокол для преодоления этих ограничений путем выращивания нового модельного вида, Streptomyces venezuelae, в коммерчески доступном микрофлюидном устройстве, которое подключено к инвертированному флуоресцентному широкопольному микроскопу. В отличие от классических модельных видов, Streptomyces coelicolor, S. venezuelae спорулирует в жидкости, что позволяет применять микрофлюидные камеры роста для культивирования и микроскопического мониторинга клеточного развития и дифференцировки S. venezuelae в течение длительных периодов времени. В дополнение к мониторингу морфологических изменений, пространственно-временное распределение флуоресцентно меченных целевых белков также может быть визуализировано с помощью покадровой микроскопии. Кроме того, микрофлюидная платформа обеспечивает экспериментальную гибкость для замены питательной среды, которая используется в подробном протоколе для стимуляции споруляции S. venezuelae в микрофлюидной камере. Изображения всего жизненного цикла S. venezuelae собираются через определенные промежутки времени и обрабатываются в программном обеспечении с открытым исходным кодом Fiji для создания фильмов записанных временных рядов.

Введение

Стрептомицеты являются почвенные бактерии, которые характеризуются сложным циклом развития с участием морфологической дифференциации из многоклеточного, питательного удаляющее мицелия к покоящихся, unigenomic спор 1-3.

При благоприятных условиях роста, типичный Streptomyces Спора начинает прорастать путем экструдирования одного или двух ростовых трубок (рисунок 1). Эти трубки удлиняются расширением наконечника и расти в разветвленной сети гиф, известной как вегетативного мицелия. Полярный рост и ветвление гиф руководит существенной белковой DivIVA. Этот белок биспиральных является частью большого цитоплазматического комплекса называется polarisome, что очень важно для вставки новой ячейки материала оболочки при удлинительной наконечника 4-7. Во время вегетативного роста, гифов стали разобщенным по нечастым образованию так называемых поперечных стенок 8. Формирование этих поперечных стенок повторно п.л. FtsZ, тубулина, как цитоскелета белок , который необходим для деления клеток в большинстве бактерий 9. В Streptomyces, однако, эти вегетативные поперечные стенки не приводят к сократительной и межклеточной разделения и , следовательно , мицелия масса остается как сеть взаимосвязанных синцитиального отсеков. В ответ на ограничение питательных веществ и других сигналов , которые не до конца понятны, специализированные антенны гифы отрываться от вегетативного мицелия и расти в воздух 3. Возведение этих структур инициирует репродуктивную фазу развития, в ходе которого долго мульти-геномных антенны гифы разделился на десятки одинаковых по размеру unigenomic prespore отсеков. Это массовое событие деление клеток приводится в движение синхронным сужением нескольких FtsZ колец в пределах одного спорогенной гиф 2,10. Морфологические дифференциация завершается выпуском покоящихся, толстостенные, пигментных спор.

т "ВОК: Keep-together.within-страница =" 1 "> figure-introduction-1
Рисунок 1:. Streptomyces жизненного цикла на твердых средах Это модель жизненного цикла на основе классических исследований С. coelicolor произрастающих на чашках с агаром. Клеточный развитие споровой начинается с образованием одного или двух ростовых трубок, которые растут в расширительном наконечника, чтобы сформировать сеть ветвления гиф. Полярный рост и ветвление вегетативных гиф направляется DivIVA (красный). Формирование вегетативных поперечных стен требует FtsZ (зеленый). В ответ на ограничения питательных веществ и других сигналов, воздушные гифы возводятся. Арест воздушного роста тесно координироваться с монтажом лестницы из FtsZ колец, которые приводят к спорообразования перегородками, что полочкам в спорогенной гифы в коробчатых prespore отсеков. Эти отсеки собрать толстую спорами стену и в конечном итоге releaСЭД, как зрелые пигментные споры.

Ключевые события развития жизненного цикла Streptomyces хорошо охарактеризованы 1,3. Однако то, что до сих пор мало клеточные биологические исследования, которые используют флуоресцентную покадровой микроскопии обеспечить понимание субклеточных процессов, лежащих в основе дифференциации, таких как динамика локализации белка, движение хромосом и онтогенетически контролируемого клеточного деления. Live-ячейки изображения развития Streptomyces является сложной задачей из - за сложности жизненного цикла и физиологических особенностей организма. Предыдущие исследования вегетативного роста и начальные стадии спорообразования перегородок использовали кислород проницаемой камеры томографию или рост агарозы при поддержке из Streptomyces coelicolor на предметное стадии 11-15. Эти методы, однако, ограничены рядом факторов. Некоторые системы позволяют только кратковременное визуализации клеточного роста апD флуоресцентные белки до клетки страдают от недостаточного снабжения кислородом или вырастают из фокальной плоскости из-за трехмерной модели развития гиф. В тех случаях, когда долгосрочное отображение возможно, культивирование клеток на границах агарозы колодки экспериментальную гибкость, потому что клетки не могут подвергаться воздействию альтернативных роста или стрессовых условиях, а фон флуоресценции от среды в агарозном колодки резко ограничивает возможность контролировать более слабую флуоресцентную сигналы.

Здесь мы опишем протокол для живых клеток визуализации жизненного цикла полных Streptomyces с отличной точностью и чувствительностью. Выращивая Streptomyces в микрожидком устройства , подключенного к флуоресцентным микроскопом Widefield (рисунок 2), теперь мы можем контролировать всхожесть, вегетативный рост и споруляции перегородок в течение периода времени до 30 часов. Это в значительной степени способствует использованию новых Streptomyces модельного организма venezuelae , потому что он спорулирует почти до завершения в погруженной культуре и тем самым преодолевает ограничение классического вида модели S. coelicolor, который спорулирует только на твердых средах 16-20. Для того, чтобы помочь визуализировать вегетативный рост и спорообразование, мы совместно выражают флуоресцентно меченый версии клеточной полярности маркера DivIVA и ключевого белка клеточного деления FtsZ.

Мы используем коммерчески доступного микрожидкостных устройство , которое успешно применяется для микобактерий, кишечной палочки, Corynebacterium glutamicum, Сенная палочка и дрожжи 21-25. Система улавливает клеток в одной фокальной плоскости и позволяет контролировать непрерывной перфузии культуральной среды из различных резервуаров. В подробном протоколе мы воспользоваться этой функцией , чтобы выставить S. venezuelae вегетативный мицелий к пищевой пониженную для содействия споруляцию.

Протокол десана для живых клеток визуализации всего жизненного цикла Streptomyces, но условия альтернативных средств массовой информации или настройки микроскопа могут быть выбраны , если определенные этапы развития, представляют особый интерес.

figure-introduction-2
Рисунок 2: Схема с изображением экспериментальной работы потока. Три основные шаги, описанные в протоколе показаны. Во-первых, споры и отработанными среда получают из стационарной фазы культуры. Во- вторых, свежие спорами загружаются в микрожидком систему и S. venezuelae проецируется на протяжении всей своей развития жизненного цикла с использованием полностью автоматизированный инвертированный микроскоп с инкубационным камеры для поддержания оптимальной температуры роста. В-третьих, ряд покадровой, полученный анализируется и обрабатывается с использованием открытого программного обеспечения на Фиджи.

Протокол

1. Выделение S. Fresh venezuelae Spores и подготовка отработавшим культуральной среде

  1. Привить 30 мл мальтоза-дрожжевой экстракт-солодовый экстракт (MYM) среде, с добавлением 60 мкл R2 раствора с микроэлементами (TE), с 10 мкл спор штамма SV60 [attB ф BT1 :: pSS209 (P divIVA - divIVA-mcherry P FtsZ -ftsZ-ypet)]. Для последовательного роста и спорообразования клеток, используют перегородками колбу или колбу, содержащую пружину для обеспечения достаточной аэрации.
  2. Культуры клеток в течение 35-40 ч при температуре 30 ° C и 250 оборотов в минуту.
  3. Осмотрите клетки конными жидкой фазово-контрастной микроскопии. На этом этапе фрагменты мицелия и споры будут видны.
  4. Центрифуга 1 мл клеток в настольной центрифуге при 400 мкг в течение 1 мин для осаждения мицелий и более крупные клеточные фрагменты.
  5. Передача приблизительно 300 мкл супернатанта COntaining суспензии спор на новый 1,5 мл трубки и держать на льду. Держите оставшуюся питательную среду для стадии 1.7.
  6. Развести спорами 1:20 в MYM-TE (конечная концентрация: 0,5-5 х 10 7 спор / мл) и держать на льду до тех пор , пока это необходимо (см шаг 2.3).
    Примечание: Хотя точные условия , которые вызывают споруляцию в Streptomyces не поняты, используя истощенной средой MYM-TE, включая любые неизвестные внеклеточных сигналов от спорообразующих культуры, стимулирует споруляцию.
  7. Фильтр-стерилизовать 10 мл оставшейся культуральной среды для получения отработавшего MYM-TE, свободной от спор и мицелия фрагментов. Используйте стерильный шприц 0,22 мкм фильтр и перенос провел MYM-TE в стерильный 15 мл трубки.
  8. Держите подготовленный проведенное MYM-TE в течение нескольких дней при температуре 4 ° С, если дополнительные эксперименты с использованием аналогичных условий роста должны быть проведены.

2. Подготовка микрожидкостных устройств

Примечание: Каждый микрожидкостных плаТЕ позволяет до четырех независимых экспериментов, которые будут проводиться. Во избежание загрязнения неиспользованных проточных камер, использовать стерильные растворы и условия работы при настройке эксперимента.

  1. Удалить доставки раствора из микрожидком пластины и промыть лунки стерильной MYM-TE.
  2. Добавить 300 мкл MYM-TE к входному отверстию и 1 и 300 мкл, затрачиваемое MYM-TE в лунки 2 до 6.
  3. Нагрузка 40 мкл разбавили спор со стадии 1.6 в ячейку загрузки скважины 8 полосы движения "А" и запечатать многообразие к пластине согласно инструкции производителя.
  4. Запустите программу управления микрофлюидики, выберите соответствующий тип плиты и установить программу потока для простого канала потока и культуры камере протекающей среды из впускных скважин от 1 до 5 в 6 фунтов на квадратный дюйм в течение 2 мин на лунку.
  5. В программном обеспечении управления микрофлюидики, создать потоковый протокол для эксперимента: пропуская MYM-TE от впускного скважины 1 в течение 6 часов, чтобы позволить для прорастания и вегетативного роста клеток. переключательзатем перфузией отработанного MYM-TE от хорошо 2 до 5 в течение оставшегося времени эксперимента. В ходе эксперимента поддерживать постоянным давление потока в 6 фунтов на квадратный дюйм (что соответствует примерно 9 мкл среды / ч). Запустить программу потока после шага 3.5.

3. Установите микроскопа и Протокол Интерв

Примечание: Этот метод был реализован на полностью моторизованных и автоматизированной перевернутой Widefield микроскоп оснащен камерой sCMOS, металл-лампа, аппаратный автофокус, держатель для ступени 96-луночные планшеты и климатическую камеру.

  1. Предварительно нагреть климатическую камеру до 30 ° C заранее, для того, чтобы предотвратить проблемы с автофокусировкой после начала эксперимента. Время, необходимое зависит от камеры, окружающей среды, используемой, микроскопом и отопительной системы. Начните разогревать систему ночь перед экспериментом.
  2. Включите микроскопа и автоматизации микроскопии и управления Softwaчисло рейнольдса Использование высокой числовой апертурой (NA) цель иммерсионным для оптимального сбора сигналов и пространственным разрешением, например, 100X, 1,46 Н.А. нефти DIC цели. Выберите соответствующие фильтры и двухцветные зеркала для получения дифференциального интерференционного контраста (DIC) изображения и изображения желто-флуоресцентный и красно-флуоресцентных слитых белков.
  3. Поместите каплю иммерсионного масла на цель и добавить иммерсионной жидкости в нижней части окна изображения на пластине микрожидком улучшить клеточное фокус во время захвата изображения. Осторожно установите запечатанный микрожидкостных устройство (шаг 2.5) на стадии инвертированного микроскопа. Убедитесь, что пластина надежно закреплен в держателе ступени и не смещается в течение эксперимента.
  4. Откройте окно формирования изображения микрожидкостных культуры камеры в фокус, используя встроенные позиции маркеров для ориентации. Фокус на крайней левой части камеры первого потока (обозначенный «А») с размером ловушки 5, что соответствуетвысота ловушки 0,7 мкм.
  5. В программном обеспечении микрофлюидики, тензодатчики от впускного отверстия скважины 8 при 4 атм в течение 15 сек. Проверьте плотность клеток в культуре камере путем перемещения платформы поперек окна визуализации. Если ни один спор не попали в ловушку, повторите шаг нагрузки сотовой ячейки или в качестве альтернативы увеличения давления нагрузки и / или время, пока нужная плотность клеток не достигается (1-10 спор в окне изображения с 2,048 х 2,048 пикселей). Избегайте перегрузки культуральной камеры.
    Примечание: Обычно мы используем размер ловушки 5 для визуализации Streptomyces, но мы также получили хорошие результаты с ловушкой размером 4 и 3. Обратитесь к руководству поставщика для получения дополнительных предложений по оптимизации процесса загрузки клеток.
  6. Запустите программу потока в управления программным обеспечением от шага 2.5 и позволяют Микрожидкостных пластины к теплу-уравновешиваться в течение 1 часа на стадии микроскопа перед началом захвата изображения.
  7. В программном обеспечении управления микроскопом, создать многомерную приобретение взять мюltiple изображения на нескольких позициях этапе с течением времени:
    1. Для Autosave: указать каталог для автоматического сохранения файлов изображений.
    2. Для настройки освещения, определить оптимальные параметры освещения для каждой конкретной конструкции заранее. Для описанной эксперимента используют следующие времена экспозиции: DIC 150 мс, 250 мс YFP, RFP 100 мс.
    3. Для временных рядов данных: настройка временных рядов для получения изображений в нужных точках времени в последовательности. Для визуализации жизненного цикла S. venezuelae, выберите временной интервал 40 мин в течение периода 24 ч.
    4. Для позиций сцене и автоматической фокусировки: сканирование культуры камеры, перемещая позиции стадии и хранить этапе для каждой позиции формирования изображения, представляющего интерес. Убедитесь в том, что позиции одноступенчатый расположены достаточно обособленно, чтобы свести к минимуму фотообесцвечивание и phototoxicity.Typically использовать до 12 позиций. Запуск автоматической фокусировки обычной для каждого момента времени для коррекции медленного фокальной дрейфа. При наличии в программном обеспечении управления микроскопом, Установить стратегию автоматической фокусировки на «обновление локальной поверхности с помощью аппаратных средств автоматической фокусировки". После того, как Z-координаты выбранных позиций этапе проверяются, активировать аппаратную автофокусировку.
  8. Начало покадровой эксперимент в программном обеспечении управления микроскопом.
  9. Убедитесь, что все позиции стадии все еще находятся в центре внимания на более поздние моменты. Для экспериментов с покадровой работает в течение нескольких часов, мы иногда наблюдаем дрейф стадии даже при использовании автофокуса. Если позиции этапа должны быть переориентированы, остановить эксперимент в подходящий момент времени, настроить фокус и перезапустить эксперимент в течение заданного интервала времени формирования изображения (этап 3.7.3). См шаг 4.3 для того, как сцепить временных рядов.
  10. Остановка захвата изображения после 24-30 ч или когда гифы в интересующей нас области дифференцировались в спор (см серию изображений DIC). Остановка программы потока в программном обеспечении и разобрать микрожидкостных устройство.
  11. Подготовьте подержанные микрожидкостных пластины для кратковременного STOярости. Удалите оставшиеся MYM-TE и провел MYM-TE от скважины 1 до 6, пустой тратой хорошо 7 и нагрузки сотовой ячейки хорошо 8. В стерильных условиях, повторное заполнение используются колодцы полосы движения "А" и колодцы неиспользованных полос ( "В" "D") на пластинке с стерильном фосфатно-буферном солевом растворе (ФБР). Уплотнение плита с парафином, чтобы предотвратить его от высыхания и хранить при температуре 4 ° С.

4. Генерация ЗАМЕДЛЕННАЯ Фильмы Использование Фиджи Программное обеспечение

Примечание: Следует отметить, что различные пакеты коммерческих и свободного программного обеспечения доступны для обработки покадровой микроскопии изображений, включая ZenBlue, Metamorph, ледяная, ImagePRO или ImageJ. Здесь мы сосредоточимся на Фиджи, который является программа обработки изображений с открытым исходным кодом на основе ImageJ, и которая уже предоставляет ряд полезных предустановленных плагинов.

  1. Данные изображений Передача из вашего покадровой эксперимента к компьютеру, который установил Фиджи.
  2. Запустите программу и импортировать файл изображения с помощью &# 34; Файл> Импорт> Био-форматы ". Или просто путем перетаскивания файла изображения на Фиджи В" Био-форматов Параметры импорта ", установите флажок" Разделить каналы ", чтобы получить отдельный стек изображения для каждого канала освещения (ДВС-синдром , RFP, YFP).
  3. Необязательно: Чтобы объединить отдельные временные ряды в результате перерыва в в приобретении изображения из-за переориентацию (шаг 3.9), откройте соответствующие стеки изображения и запустить "Image> Стеки> Инструменты> Объединить" для каждого канала (DIC, RFP, YFP ).
  4. Оценка качества данных покадровой путем прокрутки стеков изображения. Посмотрите на гиф, которые остались в центре внимания в течение долгого времени, показывают роста мицелия и в конечном итоге формируют споры (DIC) стека. Изучить ожидаемую внутриклеточную локализацию для DivIVA-mCherry в гифальных наконечниками (стек RFP) и FtsZ-YPet образуя одиночные кольца или множественные, лестницы-подобные структуры в растительном или спорогенной гиф (стек YFP), соответственно.
  5. Изолировать области, представляющей интерес для нисходящего переработнг изображений. Покадровый микроскопии часто производит большие файлы, которые могут замедлить обработку Фиджи. Поэтому рекомендуется, чтобы идентифицировать и выделить область интереса (ROI) и для выполнения дальнейших шагов обработки изображений на этой уменьшенной версии стека изображения.
    1. Выберите "прямоугольное выделение" инструмент в меню и нарисуйте прямоугольную ROI в стеке изображения DIC таким образом, чтобы развивающиеся гифы охваченной ROI всей серии изображений.
    2. Дубликат ROI-стек с "Ctrl" + "Shift" + "D".
    3. Нажмите на название бара стека изображения YFP и выберите "Edit> Selection> Восстановить выбор" в меню, чтобы восстановить предыдущее прямоугольное выделение из исходного DIC стек к тому же positon в стеке YFP ​​и дублировать ROI с "Ctrl" + "Shift" + "D".
    4. Повторите этот процесс для стека RFP.
  6. Совместите изображения в трех изображений стеки тO удалить стадии дрейфует в плоскости ху с течением времени. Выделите последний кадр в стеке DIC и выберите "Plugin> Регистрация> StackReg> RigedBody" из меню. Повторите этот шаг для ЗП и стека изображений YFP. При необходимости, обрезать ROI, повторяя шаг 4.5.1-4.5.3.
  7. Дополнительно: Отрегулируйте яркость и контрастность вручную для каждого стека изображений с "отрегулировать яркость и контрастность Tool" ( "Ctrl" + "Shift" + "C") или выберите "Process> Повышение контрастности" из меню и примените "Normalize" команда для всех изображений в стеке. Следует отметить, что последняя команда будет изменять значения пикселей и, следовательно, может повлиять вниз по течению анализа изображения.
  8. Дополнительно: Объединить отдельные стеки (преобразованные в формат RGB, см 4.11) по горизонтали или по вертикали, используя плагин "Image> Стеки> Инструменты> Объединить".
  9. Добавьте масштабную линейку ( "Анализ> Инструменты> Scale Bar") и времени штампа (&# 34; Image> Стеки> Время Стампер ").
  10. Сохранить измененные стеки изображений в виде последовательности изображений в формате ".tiff". Для создания фильма, сохранить как ".avi". В качестве альтернативы, серия экспорт изображений в формате QuickTime с использованием "Био-форматов> Био-форматы экспортер" плагин и выбрать ".mov" тип файла.
  11. Для получения изображений из отдельных кадров, выберите кадр интереса и дублировать изображение "Ctrl" + "Shift" + "D". Измените тип результирующего изображения на "RGB" или "8-бит" в разделе "Image> Type> цвета RGB или 8-бит" и сохранить изображение как ".tiff".
    Примечание: Фиджи предлагает ряд дополнительных функций для дальнейшего аннотировать или серии процессов в заданный промежуток времени. Перейти на Фиджи онлайн-поддержки для получения детальной информации (http://fiji.sc/Fiji~~HEAD=pobj).

Результаты

Успешное живых клеток визуализации всей S. venezuelae жизненный цикл дает непрерывный временной ряд , включая ключевые стадии развития всходов, вегетативного роста и спорообразования (рисунок 3, Movie 1). Визуализация прогрессии через жизненного цикла дополнительно повышается за счет отличной внутриклеточной локализации DivIVA-mCherry и FtsZ-YPet. Во время прорастания и вегетативного роста, DivIVA-mCherry исключительно накапливается в растущих кончиках гиф или меток формирующихся точек ветвления (рис 4а). Эти результаты согласуются с ранее представленными субклеточном позиционирования DivIVA 12,26. В противоположность этому , FtsZ-YPet образует одиночные кольцевые структуры с нерегулярными интервалами в растущем мицелия (рис 4В). Эти структуры обеспечивают каркас для синтеза без Констриктивные вегетативных поперечных стенок, что приводит к образованию Интерконected гифов отсеки 8. Клеточная дифференцировка выращивания гифы в спорогенной гиф становится видимым исчезновением полярных DivIVA-mCherry очагов, арест полярного роста и сопутствующее увеличение FtsZ-YPet флуоресценции (рис 4C). В спорообразующих гифы, локализация модель FtsZ-YPet резко меняется; Первые спиральные нити FtsZ-YPet падать вдоль гифы, а затем, в неожиданном, почти синхронном случае, эти спиралей сливаются в лестнице регулярно расположенных колец FtsZ-YPet. В экспериментальных условиях, описанных здесь, эти равномерно распределены FtsZ-YPet лестницы сохраняются в течение приблизительно 2 ч. И, наконец, споруляция перегородками становятся заметными в дифференциальный интерференционный контраст (DIC) изображений (рис 4D) и в конечном счете новые споры освобождены.

Последующий протокол, описывающий обработку изображений, используя программное обеспечение Fiji предусматривает ТЭП за шагом объяснение того, как создавать фильмы для публикации из приобретаемой серии покадровой (Фильм 1).

figure-results-1
Рисунок 3: Снимок изображений с представителем покадровой флуоресцентной микроскопии серии S. venezuelae производства флуоресцентно меченных FtsZ (зеленый) и DivIVA (красный) Показаны выбранные кадры из слившихся изображений (верхняя панель: RFP-YFP-ДИК, нижняя панель: DIC). визуализируя жизненный цикл Streptomyces включая всхожесть, вегетативного роста и спорообразования. Изображения были взяты из фильма 1. Время в час: мин. Масштабные полоски = 5 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

d / 53863 / 53863fig4.jpg "/>
Рисунок 4: Представитель результаты для успешного покадровой серии Streptomyces жизненного цикла (A) Локализация DivIVA-mCherry.. Показаны снимки двух последующих временных точках из фильма 1 с объединенными изображениями ЗП и каналов DIC. DivIVA-mCherry отмечает новые сайты гиф ветвь (заполняется стрелка головы) и локализуется на верхушке гиф направить полярный рост (открытая голова стрелка). Шкала бар = 10 мкм (B) Локализация FtsZ-YPet во время вегетативного роста (стрелка головы). FtsZ-YPet образует одиночные кольцевые структуры (верхняя панель), которые не сжимают (DIC, нижняя панель). (C) FtsZ-YPet (зеленый) локализация во время спорообразования перегородок. DivIVA-mCherry фокусы показаны красным цветом, с истекшим временем, изображенном ниже (час: мин). Шкала бар: 5 мкм. (D) , ДИК - корреспондент образы спорообразующих гиф из (C) , показывающий формуданию prespore отсеков с видимым спорообразования перегородками (левое изображение), который в конечном итоге созревают в цепочку спор (справа изображение). Время в час: мин. Шкала бар = 5 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-2
Фильм 1: Покадровый флуоресцентной микроскопии серия Streptomyces venezuelae жизненного цикла Фильм состоит из слившихся RFP-YFP изображений (слева) и соответствующего дифференциального интерференционного контраста (DIC) изображений (справа).. DivIVA-mCherry показано в красном и FtsZ-YPet в зеленом цвете. Временной интервал между кадрами составляет одиночными 40 мин. Шкала бар = 10 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы увидеть Тхиs кино.

Обсуждение

Покадровый микроскопия жизненного цикла Streptomyces был технически сложным в прошлом. Здесь мы представляем надежный протокол для выполнения живых клеток визуализации полного жизненного цикла с использованием флуоресцентного белка слитые полярности клеток маркера DivIVA и белка клеточного деления FtsZ , чтобы помочь визуализировать и отслеживать прогресс в рамках программы развития (рисунок 2).

Центральное место в этом методе является выращивание S. venezuelae в микрожидком устройство , которое позволяет постоянной среды перфузию и обмен нормального среднего роста (MYM-TE) с истощенной средой (отработавшим MYM-TE). Изменение состояния культуры имеет важное значение для описанного протокола , поскольку пищевые понижающей передачи , как колодцы , как и любой пока неустановленных внеклеточные сигналы (например , кворум зондирования сигналов) в отработанной культуральной среде, способствуют споруляцию, в то время как непрерывная подача питательной среде стимулирует вегетативную growtч с едва любой спорообразования (данные не показаны). Таким образом, культивировании клеток в этой системе микрожидком превосходит культивировании клеток на агарозы, поскольку он предлагает более экспериментальную гибкость и позволяет долгосрочный мониторинг изменений бактериального роста в ответ на изменение условий культивирования. Хотя Микрожидкостных пластины предназначены только для одноразового использования, поток каналы, которые не были инокулировали клетками могут быть использованы в последующих экспериментах. Мы рекомендуем использовать все каналы микрожидком пластины в течение недели, как мы столкнулись с проблемами герметизации коллектора на пластины, которые были открыты в течение более длительного времени.

При проведении эксперимента, мы обнаружили, что свежеприготовленные споры прорастали в течение двух часов, чтобы быть загружены в проточную камеру, в то время как споры, полученные из замороженного раствора в глицерине требуется, по меньшей мере 6 ч до того ростовых трубок появились (данные не показаны). Эта задержка прорастания удлиняют эксперимента и может создавать помехиналичие оборудования и условий эксперимента. Кроме того, важно, чтобы начать эксперимент с перфузией MYM-TE в течение не менее 3 ч, чтобы получить достаточное количество питательных веществ для развития и разрастания ростовых трубок. Перфузия с MYM-TE может быть расширен за пределы первоначальной 3 ч, если эксперимент предназначен для изучения вегетативного роста. В то время как споры обеспечивают предпочтительный выбор исходного материала, фрагменты короткого гифов также могут быть загружены в микрожидком пластину. Тем не менее, эффективность загрузки при использовании стриженой мицелий значительна ниже и часто требует несколько прогонов загрузки, которые могут представлять собой ограничение при рассмотрении не-спорообразующих мутантов. Вне зависимости от типа используемого посевного материала, важно не перегружать камеру культуры спорами или гиф фрагментов, так как это приведет к быстрой перенаселенности, которая может помешать распространению СМИ и усложняют анализ изображения.

Важно планировать строительство репортерных белков сторожныLLY для использования в флуоресцентной покадровой визуализации в Streptomyces. длина линкера между белком-мишенью и флуоресцентного репортера и выбора N- или С-концевых слитых конструкций может иметь решающее значение. Кроме того, оптимальные условия проведения эксперимента, включая частоту формирования изображения и времени экспозиции, должны быть определены заранее для каждого флуоресцентно-меченого белка. S. venezuelae гифы демонстрируют автофлуоресценции в зеленый / желтый канал , который может стать проблематичным при визуализации флуоресцентно меченого белка , который экспрессируется на низких уровнях. Кроме того, следует отметить , что, во время прорастания и начальной фазе вегетативного роста, S. venezuelae особенно чувствительна к коротковолновым светом (например , при использовании слитых белков в CFP).

Несмотря на непрерывные достижения в области методов визуализации и флуоресцентных систем репортер живых клеток визуализации бактерий, большинство программных пакетов (например , MicrobeTracker, Schnitzelcгезов, CellProfiler) для последующей автоматизированной обработки этих видов наборов данных не поддерживают анализ изображений , полученных из нитчатых бактерий с многоклеточного образа жизни 27-29. Таким образом, существует необходимость разработать подходящий алгоритм для количественного анализа с высокой пропускной способностью данных изображений из Streptomyces и других нитчатых бактерий.

Таким образом, работа , описанная здесь , демонстрирует огромный потенциал S. venezuelae в качестве новой модели системы развития для рода, из - за его способности в жидкости образуют споры. Микрожидкостных устройство Культивирование проста в использовании даже для неопытных пользователей. Это обеспечивает отличную платформу для изучения биологических процессов клеточных играющих центральную роль в жизненном цикле Streptomyces, в том числе динамической локализации белка, поляризованного роста и морфологической дифференциации многоклеточный мицелий в цепи unigenomic спор. Кроме того, этот экспериментальный комплект Uр также обеспечивает заманчивые отправной точкой для расследования событий в развитии , которые требуют чередующиеся условий культивирования, или использование флуоресцентных красителей , таких как люминесцентные D -аминокислот для мониторинга синтеза пептидогликана или пропидий йодида и 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) для визуализации хромосом организации 30,31.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы благодарят Гранта Колдера за техническую помощь с микроскопом, Мэтта Буша за комментарии к протоколу и Центр Джона Иннеса за покупку широкоугольного микроскопа Zeiss. Эта работа финансировалась грантом BBSRC BB/I002197/1 (для M.J.B.), грантом стратегической программы Института BBSRC BB/J004561/1 для Центра Джона Иннеса, грантом Шведского исследовательского совета 621-2010-4463 (для К.Ф.) и стипендией для постдокторантов Леопольдины (для S.S.).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
B04A CellAsic ONIX планшет для бактериальных клетокMerck-MilliporeB04A-03-5PKМикрофлюидные культуральные планшеты
CellAsic ONIX Microfluidic Perfusion System и ONIX FG (версия 5.0.2)Merck-MilliporeEV-262Последняя версия ONIX (июль 2015 г.) и инструкции по использованию программы можно найти здесь: http://www.merckmillipore.com
Axio Observer.Z1 МикроскопZeiss431007-9902-000Полностью автоматизированный и моторизованный инвертированный широкопольный микроскоп
Инкубатор XL multi S1 с температурным модулем S1 и нагревательным блоком XL S2Zeiss411857-9061-000Климатическая камера, окружающая микроскоп
Plan-Apochromat 100x/1.46 Масло DIC объективZeiss420792-9800-000
Ocra FLASH 4 V2Hamamatsu Photonics K.K.C11440-22CU
Осветитель HXP 120VZeiss423013-9010-000
FL Фильтр 46 HE YFP без сдвигаZeiss489046-9901-000Комплект люминесцентных фильтров, возбуждение 500/25 нм, излучение 535/30 нм
FL Комплект фильтров 63 HE RFP без сдвигаZeiss489063-0000-000Комплект флуоресцентных фильтров, возбуждение 572/25 нм, излучение 629/30 нм
Монтажная рамка K-M для мультилунок пластиныZeiss000000-1272-644Держатель столика для микрофлюидной пластины
ZEN pro 2012Zeiss410135-1002-120Программное обеспечение для управления микроскопом
ZEN Модуль Time LapseZeiss410136-1031-110Программный модуль для настройки экспериментов с интервальной микроскопией
ZEN Модуль Tiles/PositionsZeiss410136-1025-110Программный модуль для сохранения определенных положений на сцене (хзы)
Пакет программного обеспечения с открытым исходным кодомна Фиджиhttp://fiji.sc/FijiСоздание фильмов с
Мальтоза-дрожжевой экстракт (MYM)
4 г мальтозы
4 г дрожжевого экстракта
10 г солодового экстракта
добавить 1 л H2O, используя 50 % водопроводную воду и 50 % воду обратного осмоса, и добавить 200 мл раствора микроэлемента R2 на 100 мл после автоклавирования		Среда спорообразования, используемая для культивирования S. venezuelae SV60
R2 Раствор микроэлемента (TE)
8 мг ZnCl2
40 мг FeCl3-6H2O
2 мг CuCl2-2H2O
2 мг MnCl2-4H2O
2 мг Na2B4O7-10H2O
2 мг ( NH4)6Mo7O24-4H2O
добавить 200 мл H2O
Автоклав и хранить при 4 oC		Добавьте 0,002 тома к MYM
PBS (фосфатно-солевой буфер)SigmaP4417-100TABИспользуется для заполнения входных колодцев неиспользуемых дорожек в пластинах B04A с целью подготовки пластины к кратковременному хранению.
0,22 & микро; m шприцевые фильтрыSatorius stedim16532-KПрепарат отработанного MYM-TE
SV60John Innes Centre strain collectionS. venezuelae штамм экспрессирующий divIVA-mcherry и ftsZ-ypet
интервальной съемкой

Ссылки

  1. Bush, M. J., Tschowri, N., Schlimpert, S., Flärdh, K., Buttner, M. J. c-di-GMP signalling and the regulation of developmental transitions in streptomycetes. Nat. Rev. Microbiol. 13, 749-760 (2015).
  2. Jakimowicz, D., van Wezel, G. P. Cell division and DNA segregation in Streptomyces.: how to build a septum in the middle of nowhere? Mol. Microbiol. 85, 393-404 (2012).
  3. McCormick, J. R., Flärdh, K. Signals and regulators that govern Streptomyces development. FEMS Microbiol. Rev. 36, 206-231 (2012).
  4. Flärdh, K., Richards, D. M., Hempel, A. M., Howard, M., Buttner, M. J. Regulation of apical growth and hyphal branching in Streptomyces. Curr. Opin. Microbiol. 15, 737-743 (2012).
  5. Hempel, A. M., et al. The Ser/Thr protein kinase AfsK regulates polar growth and hyphal branching in the filamentous bacteria Streptomyces. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 109, E2371-E2379 (2012).
  6. Fuchino, K., et al. Dynamic gradients of an intermediate filament-like cytoskeleton are recruited by a polarity landmark during apical growth. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110, E1889-E1897 (2013).
  7. Holmes, N. A., et al. Coiled-coil protein Scy is a key component of a multiprotein assembly controlling polarized growth in Streptomyces. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110, E397-E406 (2013).
  8. McCormick, J. R., Su, E. P., Driks, A., Losick, R. Growth and viability of Streptomyces coelicolor. mutant for the cell division gene ftsZ. Mol. Microbiol. 14, 243-254 (1994).
  9. Margolin, W. FtsZ and the division of prokaryotic cells and organelles. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 862-871 (2005).
  10. Grantcharova, N., Lustig, U., Flärdh, K. Dynamics of FtsZ assembly during sporulation in Streptomyces coelicolor A3(2). J. Bacteriol. 187, 3227-3237 (2005).
  11. Richards, D. M., Hempel, A. M., Flärdh, K., Buttner, M. J., Howard, M. Mechanistic basis of branch-site selection in filamentous bacteria. PLoS Comput. Biol. 8, e1002423(2012).
  12. Hempel, A. M., Wang, S. B., Letek, M., Gil, J. A., Flärdh, K. Assemblies of DivIVA mark sites for hyphal branching and can establish new zones of cell wall growth in Streptomyces coelicolor. J. Bacteriol. 190, 7579-7583 (2008).
  13. Wolanski, M., et al. Replisome trafficking in growing vegetative hyphae of Streptomyces coelicolor A3(2). J. Bacteriol. 193, 1273-1275 (2011).
  14. Jyothikumar, V., Tilley, E. J., Wali, R., Herron, P. R. Time-lapse microscopy of Streptomyces coelicolor.growth and sporulation. Appl. Environ. Microbiol. 74, 6774-6781 (2008).
  15. Willemse, J., Borst, J. W., de Waal, E., Bisseling, T., van Wezel, G. P. Positive control of cell division: FtsZ is recruited by SsgB during sporulation of Streptomyces. Genes. Dev. 25, 89-99 (2011).
  16. Glazebrook, M. A., Doull, J. L., Stuttard, C., Vining, L. C. Sporulation of Streptomyces venezuelae. in submerged cultures. J. Gen. Microbiol. 136, 581-588 (1990).
  17. Bibb, M. J., Domonkos, A., Chandra, G., Buttner, M. J. Expression of the chaplin and rodlin hydrophobic sheath proteins in Streptomyces venezuelae.is controlled by sigma(BldN) and a cognate anti-sigma factor, RsbN. Mol. Microbiol. 84, 1033-1049 (2012).
  18. Al-Bassam, M. M., Bibb, M. J., Bush, M. J., Chandra, G., Buttner, M. J. Response regulator heterodimer formation controls a key stage in Streptomyces development. PLoS Genet. 10, e1004554(2014).
  19. Bush, M. J., Bibb, M. J., Chandra, G., Findlay, K. C., Buttner, M. J. Genes required for aerial growth, cell division, and chromosome segregation are targets of WhiA before sporulation in Streptomyces venezuelae. MBio. 4, e00684-e00613 (2013).
  20. Tschowri, N., et al. Tetrameric c-di-GMP mediates effective transcription factor dimerization to control Streptomyces development. Cell. 158, 1136-1147 (2014).
  21. Mirouze, N., Ferret, C., Yao, Z., Chastanet, A., Carballido-Lòpez, R. MreB-Dependent Inhibition of Cell Elongation during the Escape from Competence in Bacillus subtilis. PLoS Genet. 11, e1005299(2015).
  22. Zopf, C. J., Maheshri, N. Acquiring fluorescence time-lapse movies of budding yeast and analyzing single-cell dynamics using GRAFTS. J. Vis. Exp. (e50456), (2013).
  23. Meniche, X., et al. Subpolar addition of new cell wall is directed by DivIVA in mycobacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 111, E3243-E3251 (2014).
  24. Donovan, C., Schauss, A., Kramer, R., Bramkamp, M. Chromosome segregation impacts on cell growth and division site selection in Corynebacterium glutamicum. PLoS One. 8, e55078(2013).
  25. Rojas, E., Theriot, J. A., Huang, K. C. Response of Escherichia coli. growth rate to osmotic shock. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 111, 7807-7812 (2014).
  26. Flärdh, K. Essential role of DivIVA in polar growth and morphogenesis in Streptomyces coelicolor A3(2). Mol. Microbiol. 49, 1523-1536 (2003).
  27. Sliusarenko, O., Heinritz, J., Emonet, T., Jacobs-Wagner, C. High-throughput subpixel precision analysis of bacterial morphogenesis and intracellular spatio-temporal dynamics. Mol. Microbiol. 80, 612-627 (2011).
  28. Young, J. W., et al. Measuring single-cell gene expression dynamics in bacteria using fluorescence time-lapse microscopy. Nat. Protoc. 7, 80-88 (2012).
  29. Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7, R100(2006).
  30. Kuru, E., Tekkam, S., Hall, E., Brun, Y. V., Van Nieuwenhze, M. S. Synthesis of fluorescent D-amino acids and their use for probing peptidoglycan synthesis and bacterial growth in situ. Nat. Protoc. 10, 33-52 (2015).
  31. Szafran, M., et al. Topoisomerase I (TopA) is recruited to ParB complexes and is required for proper chromosome organization during Streptomyces coelicolor. sporulation. J. Bacteriol. 195, 4445-4455 (2013).

Перепечатки и разрешения

Исправление


Formal Correction: Erratum: Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device
Posted by JoVE Editors on 7/01/2016. Citeable Link.

A correction was made to: Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device

The author's name was updated from:

Mark Buttner

to:

Mark J. Buttner

Теги

Streptomyces venezuelaeFiji
Флуоресцентная Покадровый Визуализация Complete
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.