Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Перенос генов в Куриный органа по Слуховые

9.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53864

⸱

17 апреля 2016 г.

 , 
1The Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, The Center for Sensory Biology, The Johns Hopkins University, School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

Слуховой орган опосредует слух. В данной работе мы представляем модифицированный in ovo метод микроэлектропорации, оптимизированный для изучения пролиферации и дифференцировки клеток слуховых прогениторов в развивающемся органе слуха курицы.

Аннотация

Куриные эмбрионы являются идеальными модельные системы для изучения эмбрионального развития , как манипулирование функции генов может быть проведена с относительной легкостью в яйце. Внутреннее ухо слуховой сенсорный орган, имеет решающее значение для нашей способности слышать. В нем располагаются узкоспециализированный сенсорную эпителий, который состоит из клеток волос механико-преобразовательный (ГЦ) и окружающих глиальных как поддерживающие клетки (SCS). Несмотря на структурные различия в слуховых органах, молекулярные механизмы , регулирующие развитие слухового органа эволюционно консервативны у млекопитающих и Aves В ово электропорации в значительной степени ограничена на ранних стадиях E1 -. Е3. Из - за относительной позднего развития органа слуха при E5, манипуляциями слухового органа по ово в электропорации прошлом E3 затруднено ввиду опережающего развития куриного эмбриона на поздних стадиях. Метод, представленный здесь, является временным методом переноса гена для нацеливания генов, представляющих интерес вэтап Е4 - E4.5 в развивающемся куриной слуховом органа чувств с помощью в ово микро-электропорации. Этот метод применим для амплитудно и с потерей функции с экспрессирующих векторов на основе ДНК обычные плазмиды и могут быть объединены с в ово анализе пролиферации клеток путем добавления Эду (5-этинил-2'-дезоксиуридин) ко всему эмбриона на время электропорации. Использование зеленого или красного флуоресцентного белка (GFP или RFP) плазмид экспрессии позволяет экспериментатору быстро определить, успешно ли целевой электропорации слуховую часть проявляющего внутреннего уха. В этом методе бумаги, представительные примеры GFP электропорации образцов показаны; Эмбрионы собирали 18 - 96 ч после электропорации и адресности GFP к про-сенсорной области слухового органа была подтверждена РНК гибридизация. Метод бумаги также обеспечивает оптимизированную протокол для использования аналогам тимидина ОБР для анализа клеток Пролифжалюзей; пример на основе Edu анализа клеточной пролиферации, который сочетает в себе иммуно-маркировку и нажмите EDU химии обеспечивается.

Введение

Несмотря на различия в морфологии и клеточных кучность между млекопитающих и птиц слуховом органа чувств, молекулярные факторы и пути , ответственные за развитие сенсорных HC , как полагают, эволюционно консервативны 1-3. Базилярной сосочка, в котором находится слуховой HCs и окружающих их ГКС, развивается как outpocketing внутреннего уха отоциста. Уже на раннем этапе пула HC и SC прародителей указана в ушные плакоды / ушные чашки нейронная-сенсорной области компетентного (НРД). Данные Судьба картированию свидетельствуют о том , что нейронные и сенсорные клоны связаны между собой и возникают из НРД , расположенной в передне-вентральной области ушные чашки или отоциста у мышей и цыплят 4,5. Во-первых, нейробласты вычленяются из НРД привести к нейронам слуховому-вестибулярный ганглий, который в конечном итоге расщепляется на слуховом и вестибулярном ганглиях. Эти нейроны иннервируют сенсорные HCs внутреннего уха и ядер в стволе мозга. Клетки-йпо-прежнему в НРД, как полагают, приводят к различным сенсорных участков, в том числе слухового органа чувств, состоящий из механико-преобразовательный сенсорных ГЦ и связанных с ними SCS.

В обоих кур и мышиным, орган слуха сенсорно прародитель выход из клеточного цикла и дифференцировки HC происходят в противоположных градиентов. У кур, слуховое прародитель выход из клеточного цикла начинается около ~ E5 и прогрессирует от основания к вершине, и от центра к периферии 6. Через день НС дифференциация начинается в вершине и прогрессирует к основанию 7. Изучение развития внутреннего уха у кур предоставляет множество технических преимуществ , как функциональные механизмы могут быть исследованы с относительной легкостью в яйце , в отличие от манипулирования эмбрионов в утробе матери и в других модельных системах, что требует сложных операций. Описанный здесь метод использует в ово микро-электропорации целевых генов , представляющих интерес в презумптивной basilaг площадь сосочек передне-вентрально в слуховым пузырьком конкретно в Е4.

Электропорация в яйце является метод , который хорошо известна и широко используется 8-14. Принцип метода электропорации основан на том факте , что нуклеотиды (например, плазмидная ДНК, синтетическую ДНК или РНК олигонуклеотиды) заряжены отрицательно. ДНК вводят в интересующую ткань. Когда электрический ток помещают поперек ткани, ток открывает переходные поры в клеточных стенках и обеспечивает поглощение ДНК, поскольку потоки отрицательно заряженная ДНК в направлении положительного электрода (анода). Для усиления из-функции экспериментов, представляющих интерес генов обычно субклонировали в экспрессирующие плазмиды, которые содержат соответствующие кассеты экспрессии для зеленого флуоресцентного белка (GFP) или красного флуоресцентного белка (RFP). Для потери из-функции экспериментов плазмиды на основе доминантных негативных конструкций репрессор или RNAi или морфолино конструкции сommonly использовали 15,16. Для подавления микроРНК (миРНК) Функция микроРНК губки конструкции, которые , как правило , плазмиду , на основе, могут быть использованы 17. Описанный здесь метод позволяет исследовать молекулярные механизмы , которые контролируют пролиферацию и дифференцировку в слуховом органе, как в ово методе микро-электропорации можно легко комбинировать с в ово анализе пролиферации клеток путем добавления Edu всему эмбриона.

Электропорации и добавление Эду выполняется на Е4 в слуховым пузырьком, который за один день до начала выхода из клеточного цикла в слуховом органе. Анализ органа слуха обычно проводят 18 - 96 ч после электропорации при E5 (Наступление сенсорных клеток-предшественников выхода из клеточного цикла), E6 (начало ХК дифференциации), и E7 (во время дифференцировки HC); а позже до ~ E9 (конец HC дифференциации). Этот метод электропорации переноса гена преходяще продолжительностью около ~ 4 дней, becauсебе гены интерес не интегрируются в геном, но этот метод применим для использования с подходящим плазмидных векторов экспрессии , основанных на ДНК, которые действительно имеют возможность интеграции в геном, такие как Tol2-опосредованного переноса гена 11. С помощью этого метода надежные GFP или RFP выражения длится ~ 4 дня в улитке, после чего указывают сигналы увядают, но обеспечивают достаточное окно времени, чтобы изучить запутанную развитие слухового органа. Это , в ово способе переноса генов является новым и позволяет конкретно целевой предположительный органа слуха при E4, который является оптимальным для исследований , которые сосредоточены на развитии HC в слуховом органе. Это является хорошим дополнением к альтернативным методам, которые электропорации на гораздо более молодых стадиях развития или 11,12 по сравнению с использованием в пробирке базилярной сосочков эксплантов культур 18.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Яйца и невылупившиеся эмбрионы заботу и лечение с этической точки зрения и гуманно. Все протоколы для невыведенное использования эмбрионов были одобрены уходу и использованию животных комитета на Джона Хопкинса школы медицины, Балтимор, штат Мэриленд.

1. Яйца и подготовка выражение конструирует

  1. Яйца:
    1. Выдержите 3 - 4 десятка оплодотворенных куриных яиц (Gallus Gallus) лежа на боку при 37 ° C.
      1. Через 24 часа инкубации тянуть 3 куб.см белке с помощью шприца с круглой задней части яйца и загерметизировать отверстие с прозрачной лентой. Это создает воздушную камеру между эмбрионом и яичной скорлупы, что позволяет для облегчения доступа к эмбриону без зародыша торчащий к корпусу при резке окно для доступа на верхней части яйца 19.
      2. В 117 ч времени инкубации стадии эмбрионов в соответствии с Гамбургер и Гамильтон 20 стадий развитияв E4 (HH24-25) (см 1D).
  2. Expression Создаёт:
    1. Готовят плазмидной ДНК с использованием реагентов и протокол, предоставляемый производителем коммерчески доступного набора препарата. На заключительном этапе подготовки, элюции ДНК в 500 мкл ТЕ (Трис-ЭДТА) предоставленный буфер в наборе в 1,5 мл пробирку.
    2. Этанол осаждения ДНК, чтобы концентрировать ее путем добавления 50 мкл 3 М ацетата натрия и 1 мл 100% этанола к трубе. Поместите пробирку при -20 ° CO / N.
    3. Отцентрифугировать пробирку в течение 30 мин при 14000 оборотах в минуту при температуре 4 ° С. Удалить супернатант и воздушно-сухой осадок в течение 10 мин при комнатной температуре. Растворить осадок в 15 мкл ТЕ-буфера, который должен давать концентрацию ~ 4 мкг / мкл.
      Примечание: выражение конструирует управления , используемые здесь , являются ПМЭС-IRES-GFP 10, который приводится в движение с помощью куриных β-актина или ЧКВ-Н2В-IRES-RFP 10, который приводится в движение с помощью промотора CMV.

2. Куриное В Ovo Micro-электропорации и в Ovo пролиферации клеток Пробирной

  1. В Ово микроинъекции экспрессии конструкта и Micro-электропорации:
    1. Потяните стеклянные капилляры на тонкие иглы с использованием микро-пипетки съемник со следующими оптимизированными параметрами для 2,5 х 2,5 мм Box Платиновый нагрева нити накала: Давление = 500, тепла = 600 ° C, Pull = 64, Скорость = 105, и времени = 150 мс (см таблицу 1).
    2. Настройка левой и правой рукой этапы микро-манипуляторы фланговые микроскоп (рис 1А). Правой рукой микро-манипулятор имеет стеклянную капиллярную иглу и левой рукой микро-манипулятор имеет электроды (рис 1А).
    3. Подготовьте тонко вытащил стеклянную капиллярную иглу для микроинъекции резаниемкончик иглы с пинцетом во время работы под микроскопом.
    4. Заполните иглу вручную вручную с помощью микро-манипулятором с 2,5 мкл ДНК плазмиды тонированных с 0,1% Fast Green во время работы под микроскопом.
    5. Поместите яйцо , лежащую на его стороне в устройстве формы / яйцо удержания (см рисунок 1А). Вырезать круглое окно на верхней части яйца с помощью ножниц 19 (Фигура 1А).
    6. Работая под микроскопом, осторожно откройте две мембраны, перекрывающей эмбриона с помощью щипцов.
    7. Во время работы под микроскопом, обеспечивают примерно ~ 0,5 мкл ДНК плазмиды с нужными слуховым пузырьком просвет путем микроинъекции вручную, используя правую руку с помощью микро-манипулятором и микро-электропорации.
      1. Для этого, микро-инъекционные правильные слуховым пузырьком просвет с ДНК с правой рукой микро-манипулятором (рис 1B-D) в то же самое время , используя левую руку Holdinга Forcep, чтобы стабилизировать голову эмбриона, потому что голова эмбриона опускается на стадии Е4. Не микро-инъекции мимо слуховым пузырьком просвет, так как это приведет к повреждению слуховым пузырьком.
      2. Сразу же после того, как микро-инъекции, во время работы под микроскопом, с помощью левой руки микро-манипулятор, чтобы поместить положительный (анод) 2 мм платиновый электрод передне-вентральной к правому слуховым пузырьком и отрицательным 2 мм электрода (катода) параллельно 1 мм друг от друга (см Рисунок 1 C). Deliver 4 импульса на 12 В с 100 мсек и 200 мсек интервала. Левый слуховым пузырьком служит внутренним необработанным контролем.
        Примечание: Очистите электроды между electroporations с ватным тампоном, смоченным в 1x PBS.
  2. В Ovo пролиферации клеток Пробирной:
    1. Сразу после электропорации добавляют 50 мкл 0,25 мг / мл Edu в 1x PBS вручную сбросив 50 мкл раствора Edu на целомэмбрион в яйце с помощью пипетки. Печать яйца с лентой и вернуться в инкубаторе в течение 18 - 96 часов.
    2. Осторожно снимите ленту и проверить эмбрионов для флуоресцентного сигнала GFP или RFP в слуховым пузырьком после 18 - 24 часов с использованием стандартного флуоресцентного микроскопа (см Рисунок 1 EE '). Если флуоресцентный сигнал присутствует, на данный момент урожай эмбрионов для анализа или запечатать с лентой и вернуть его в инкубатор для сбора и анализа на более поздних стадиях (см Рисунок 1 FP '').
      Примечание: Выражение сигнала GFP с ПМЭС-IRES-GFP конструкции очевидна 6 - 7 ч после электропорации 10.

3. Эмбрион Сбор и обработка ткани для РНК в гибридизация и иммуногистохимии

  1. Урожай эмбрионов с помощью щипцов. Ополосните эмбриона в холодной 1x PBS. Удалите головы эмбрионов, путем отрезания головы его шеис помощью щипцов, и поместите голову в 4% параформальдегид O / N при 4 ° С. Прокол мозг с помощью Forcep, чтобы обеспечить проникновение 4% параформальдегидом внутри головы.
  2. Высушить головы в 30% сахарозы (в 1x PBS) O / N при 4 ° С.
  3. Установите головки в криозащитной среде путем быстрого замораживания в суспензии сухого льда и метилбутана (2-метилбутан). В качестве альтернативы, быстрое замораживание головы в криозащитной среде с жидким азотом. Храните смонтированные головы при -80 ° С.
  4. Cryosection головы на секции толщиной ткани 12 мкм и собрать все внутренние срезы ткани уха, содержащих на superfrosted микроскопа стеклах.
  5. Выполните стандартную РНК гибридизация и иммуногистохимии в , как описано выше 4,21, и анализировать для пролиферации клеток Edu в соответствии с протоколом , предоставленного производителем набора.
    Примечание: клетки волос могут быть идентифицированы с использованием кроличьих поликлональных альфа-MyosinVIIa (Myo7a)tibody (1: 1000, Proteus Biosciences) и флуоресцентно меченных вторичное антитело (1: 250, козы к антителам кролика AlexaFluor 488; Invitrogen).

4. Захват и обработка изображений

  1. Возьмите изображения с цифровым оборудованием обработки изображений. Результаты изображения иммуногистохимия со стандартным флуоресцентным микроскопом и результаты in - situ с использованием стандартного широкого поля микроскопа ( в диапазоне от 5х до 40х в увеличении).
  2. Обработки изображений с помощью программного обеспечения для обработки изображений.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В этом методе бумаги плазмидной ДНК, состоящей из зеленого флуоресцентного белка (GFP) кассеты экспрессии были направлены в разработку цыпленка базилярной сосочка (BP) с оптимизированными параметрами 12 В и 4 импульсов с длительностью 100 мс импульсов и интервалов 200 мс, что дает ~ 50% выживаемость эмбрионов и эффективность плазмидной ДНК таргетирования в BP. Флуоресцентные изображения родной экспрессии GFP в развивающихся эмбрионах показали этот метод электропорации преимущественно нац...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Описанный здесь метод в ово микро-электропорации оптимизирован для переноса генов в развивающемся слуховом органе. Он совместим с экспрессирующими векторами на основе ДНК плазмиды обычно используются для манипулирования функции гена / экспрессии. Время проведения электропорации на E4 является оптимальной для исследований, которые сосредоточены на развитии HC в слуховом органе. Наиболее важные шаги микро-инъекции ДНК в слуховым пузырьком просвет , не вдаваясь слишком глубоко с иглой и повреждения слуховым пузырь...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим доктора Дорис К. Ву для экспрессии плазмид и зондов измерений в точке, Университета имени Джона Хопкинса Центр Сенсорное объекта биологии визуализации и Центр слуха и равновесия. Эта работа была поддержана NIDCD Грант T32 DC000023 на LE

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Стерильный 1x PBS pH 7.4gibco10010-023
Fast Green FCF PowderSigmaF7252-5G
EdU PowderInvitrogenE10187
Click-IT EdU Alexa Fluor 555 Imaging KitInvitrogenC10338
HiSpeed Plasmid Midi Kit (25)Qiagen12643
ECM 830 ElectroSquarePorator BTX Harvard Apparatus
Banana to Micrograbber Cable KitBTX Harvard Apparatus45-0216
Right & Микроманипуляторы для левшейWorld Precision Instruments Inc. M3301R & M3301L
Два магнитных удерживающих столика 12 мм с вертикальными стойками 7 дюймовWorld Precision Instruments Inc.M10
Металлическая стальная опорная плита 12x24 дюймаWorld Precision Instruments Inc. 5479
Ножницы для яиц 12 см длиной изогнутые, 12 мм экстратонкие лезвия; Пружинные ножницыWorld Precision Instruments Inc. 14120
Съемник Micropippette для вытягивания иглSutter Instrument Co.P-97
2,5x2,5 мм Коробка Платиновая нагревательная нитьSutter Instrument Co.
Стеклянные капиллярные трубки/иглы/без волокна/боросил 1 ммFHC27-30-0
Стеклянный шприц Hamilton 100 μ lHamilton80601 Model 710LT
Минеральное масло (тяжелое) для стеклянного шприца Hamilton FisherScientificO122-1
Полиэтиленовая трубка для соединения стеклянного шприца и стеклянных капсулярных игл / НетоксичныйBecton Dickinson and Company (BD)427420 Intramedic Clay Adams Brand
3 cc Одноразовые шприцыBecton Dickinson and Company (BD)309657
Одноразовые иглы 21 калибраBecton Dickinson and Company (BD)305122
Одна пара платиновых электродов 2 ммBulldog Bio. / NepageneCUY611P3-2
Держатель электродовBulldog Bio. / NepageneCUY580
Одна пара тонких щипцов Dumont No 5Fine Science Tools (FST)
Матовая финишная невидимая лента для запечатывания яицОфис Depot520-928
Ватные тампоныFisher Scientific23-400-101
Стерильные фильтрующие наконечники

Ссылки

  1. Bissonnette, J. P., Fekete, D. M. Standard atlas of the gross anatomy of the developing inner ear of the chicken. The Journal of comparative neurology. 368, 620-630 (1996).
  2. Cantos, R., Cole, L. K., Acampora, D., Simeone, A., Wu, D. K. Patterning of the mammalian cochlea. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 11707-11713 (2000).
  3. Whitfield, T. T. Development of the inner ear. Current opinion in genetics & development. 32, 112-118 (2015).
  4. Raft, S., et al. Cross-regulation of Ngn1 and Math1 coordinates the production of neurons and sensory hair cells during inner ear development. Development. 134, 4405-4415 (2007).
  5. Satoh, T., Fekete, D. M. Clonal analysis of the relationships between mechanosensory cells and the neurons that innervate them in the chicken ear. Development. 132, 1687-1697 (2005).
  6. Katayama, A., Corwin, J. T. Cell production in the chicken cochlea. The Journal of comparative neurology. 281, 129-135 (1989).
  7. Cotanche, D. A., Sulik, K. K. The development of stereociliary bundles in the cochlear duct of chick embryos. Brain Res. 318, 181-193 (1984).
  8. Alsina, B., et al. FGF signaling is required for determination of otic neuroblasts in the chick embryo. Developmental biology. 267, 119-134 (2004).
  9. Chang, W., et al. Bmp4 is essential for the formation of the vestibular apparatus that detects angular head movements. PLoS genetics. 4, e1000050(2008).
  10. Evsen, L., Sugahara, S., Uchikawa, M., Kondoh, H., Wu, D. K. Progression of neurogenesis in the inner ear requires inhibition of Sox2 transcription by neurogenin1 and neurod1. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 3879-3890 (2013).
  11. Freeman, S., Chrysostomou, E., Kawakami, K., Takahashi, Y., Daudet, N. Tol2-mediated gene transfer and in ovo electroporation of the otic placode: a powerful and versatile approach for investigating embryonic development and regeneration of the chicken inner ear. Methods in molecular biology. 916, 127-139 (2012).
  12. Kamaid, A., Neves, J., Giraldez, F. Id gene regulation and function in the prosensory domains of the chicken inner ear: a link between Bmp signaling and Atoh1. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30, 11426-11434 (2010).
  13. Neves, J., Kamaid, A., Alsina, B., Giraldez, F. Differential expression of Sox2 and Sox3 in neuronal and sensory progenitors of the developing inner ear of the chick. The Journal of comparative neurology. 503, 487-500 (2007).
  14. Neves, J., Uchikawa, M., Bigas, A., Giraldez, F. The prosensory function of Sox2 in the chicken inner ear relies on the direct regulation of Atoh1. PLoS One. 7, 30871(2012).
  15. Das, R. M., et al. A robust system for RNA interference in the chicken using a modified microRNA operon. Developmental biology. 294, 554-563 (2006).
  16. Wu, C. Y., Hooper, R. M., Han, K., Taneyhill, L. A. Migratory neural crest cell alphaN-catenin impacts chick trigeminal ganglia formation. Developmental biology. 392, 295-307 (2014).
  17. Kumar, M. S., et al. Suppression of non-small cell lung tumor development by the let-7 microRNA family. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 3903-3908 (2008).
  18. Jacques, B. E., Dabdoub, A., Kelley, M. W. Fgf signaling regulates development and transdifferentiation of hair cells and supporting cells in the basilar papilla. Hearing research. 289, 27-39 (2012).
  19. Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. Journal of visualized experiments: JoVE. , e306(2007).
  20. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of morphology. 88, 49-92 (1951).
  21. Oh, S. H., Johnson, R., Wu, D. K. Differential expression of bone morphogenetic proteins in the developing vestibular and auditory sensory organs. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 16, 6463-6475 (1996).
  22. Bell, D., et al. Spatial and temporal segregation of auditory and vestibular neurons in the otic placode. Developmental biology. 322, 109-120 (2008).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

in ovoEdUGFPin situembryonic day E4
Перенос генов в Куриный органа по Слуховые
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.