Method Article

Рецептор Авторадиография Протокол о локализованного визуализации ангиотензина II Рецепторы

DOI:

10.3791/53866

⸱

June 7th, 2016

 ,  ,  , 
1Farquhar College of Arts and Sciences, Nova Southeastern University, 2Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, Nova Southeastern University, 3School of Medicine, University of Colorado

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем протокол для описания локализации рецепторов ангиотензина II типа 1 в мозге крысы с помощью количественной, денситометрической, in vitro авторадиографии рецепторов с использованием меченного йодом-125 аналога ангиотензина II.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает связывание рецептора шаблоны для ангиотензина II (Ang II) в головном мозге крысы с использованием радиолиганда, специфичного для рецепторов Ang II для выполнения рецептора авторадиографического отображение.

Тканевые образцы собирают и хранят при -80 ° С. Криостат используется для коронковой секции ткани (мозг) и оттепели монтажа секций на заряженных горками. Срезы ткани слайд монтажа инкубируют в 125 I-SI-Ang II к радиоактивной рецепторов Ang II. Прилегающие слайды разделены на две группы: 'неспецифического связывания' (NSP) в присутствии насыщающей концентрации рецепторов не-меченного Ang II, или АТ 1 рецепторов подтипа Ang II (AT 1 R) селективный антагонист рецептора АТ II и 'не общего связывания' без AT 1 антагониста R. Концентрация насыщающего АТ 2 подтипа рецептора Ang II (АТ 2 R) антагонист (PD123319, 10 мкМ) также присутствует в incubatiна буфер для ограничения 125 I-SI-Ang II связывание с AT 1 R подтипа. В течение 30 мин предварительной инкубации при ~ 22 ° C, NSP горок подвергаются 10 мкМ PD123319 и лозартана, в то время как 'общего связывания' горок подвергаются 10 мкМ PD123319. Слайды затем инкубируют с 125 I-SI-Ang II в присутствии PD123319 для общего уровня связывания », и PD123319 и лозартан для NSP в буфере для анализа, а затем несколько« стирок »в буфере, и воду , чтобы удалить соль и не- специфически связанного радиолиганда. Слайды сушат с использованием выдувного сушилки, затем подвергали авторадиографии пленки с использованием специализированной пленки и кассеты. Фильм разработан и изображения сканируются в компьютер для визуального и количественного денситометрии с использованием собственной системы обработки изображений и электронных таблиц. Дополнительный набор слайдов тионин окрашенных гистологических сравнений.

Преимущество использования авторадиографии рецептора является возможность визуализироватьАнг рецепторов II в месте, в пределах участка тканевого образца, а также анатомически определить область ткани, сравнивая его с соседней гистологического справочном разделе.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сердечно - сосудистые заболевания по- прежнему является ведущей причиной смерти и инвалидности в Соединенных Штатах, в результате чего более 30% смертельных случаев в США в 2011 году 1. Самые последние статистические данные из Американской ассоциации сердца показывают , что более чем один человек в трех имеет один или более тип сердечно-сосудистых заболеваний. Сердечно-сосудистые исследования продолжают добиваться успехов в отношении понимания этой болезни, но, как поколения начинают стареть крайне важно продолжать эти усилия. Система ренин-ангиотензин (RAS) , играет центральную роль в регуляции сердечно - сосудистой системы , в первую очередь путем продвижения атеросклероза, воспаления, системную вазоконстрикцию и активацию симпатической нервной системы (рис 1) 2-8.

РАН является гормональная система, которая активируется, когда юкстагломерулярной клетки почки выделяют ренин в кровоток в ответ на снижение артериального давления, увеличение sympathetic стимуляция или снижение потока натрия с помощью макулы Densa. Ренин усваивает ангиотензиноген (синтезированного в печени) с образованием ангиотензина I (Ang I). Анг я затем метаболизируется ангиотензин-превращающего фермента (АПФ), в ectoenzyme на просвете стороне клеток эндотелия сосудов, в первую очередь в легких и почках, с образованием ангиотензина II (анг II), главный эффекторный пептид РАН. Анг II способен активировать два подтипа рецепторов; рецептор типа 1 (AT 1 R) и рецептор типа 2 (AT 2 R), и которые регулируют сердечно - сосудистой системы, поддержания жидкости и электролитов гомеостаз и в настоящее время считаются влияют на когнитивные функции и нейродегенеративные заболевания процессов 8,9. Местный, специфичная для головного мозга РАН сообщается самостоятельно синтезировать Ang II. В головном мозге, белок - предшественник ангиотензин синтезируется в астроглию 10 обращенных к Ang I с помощью ренин-подобный фермент 3, возможно , проренина , связанный с рецептором проренина11, а затем превращают в Ang II ангиотензин-превращающего фермента , который в большом количестве экспрессируется на внеклеточной поверхности нейронов в головном мозге 12. Это intrabrain генерируется Ang II является агонистом для мозга АТ 1 и АТ 2 рецепторов, которые изолированы от передающейся через кровь Ang II.

В то время как AT 1 R играет важную физиологическую роль, она лучше известна своими патофизиологические эффекты по всему телу, в первую очередь влияет на сердечно - сосудистую систему и почки (рисунок 2). Когда Ang II связывается с AT 1 R, он вызывает вазоконстрикцию; повышение устойчивости к кровотока и повышение кровяного давления. Он также стимулирует синтез и секрецию альдостерона и вазопрессина, что приводит к увеличению задержки натрия и воды. Эти эффекты могут также вызвать ишемического повреждения головного мозга и когнитивных нарушений и связана с болезнью Паркинсона, болезнь Альцгеймера, и diabeTES, а также будучи недавно идентифицированы влиять на обучение и память 13-15. Существует петля обратной связи в РАН в том , что AT 1 R на юкстагломерулярных клеток в почках ингибирует секрецию ренина. Интересно отметить , что AT 2 R , как правило против регулирует действие AT 1 R, вызывая вазодилатацию, невритов, регенерацию аксонов, анти-пролиферацию и cerebroprotection среди многих других 16-20. AT 2 R также была определена в качестве мишени для анти-гипертензии и в последнее время , противораковых препаратов 21. Определение локализации и плотности рецепторов Ang II в пределах различных тканей и как они подвергаются воздействию различных методов лечения и болезненных состояний с использованием количественного денситометрическую авторадиографии рецептора поможет раскрыть роль РАН играет в конкретных заболеваний.

Рецептор радиоавтография был использован на протяжении более 30 лет в качестве эффективного метода для индикации присутствия ангиотензина II рецепторы и другие компоненты РАН в головном мозге и других тканях крысы, мыши, морской свинки, собаки и человека при различных экспериментальных условиях 22-34. Важность определения местоположения рецепторов Ang II в мозге является то , что можно применить функциональную нейроанатомии к действиям Ang II в головном мозге, например, присутствие AT 1 R в паравентрикулярной ядре гипоталамуса (PVN) предлагает функцию Ang II в головном мозге, чтобы стимулировать вазопрессин, окситоцин или рилизинг гормон (CRH) релиз, или активацию симпатической нервной системы. Таким образом, препараты , которые блокируют AT 1 R может уменьшить некоторые из этих PVN-опосредованных эффектов , связанных с за деятельностью мозга РАН. Работа в прогрессе предполагает , что применение антагонистов AT 1 R может уменьшить посттравматическое стрессовое расстройство (ПТСР) -индуцированное высвобождение КРГ и смягчить симптомы ПТСР (Hurt и др., Который был представлен для публикации). PVN, subfornicalорган (SFO), и миндалина известны для регуляции гомеостаза, аппетит / жажда, сон, память, эмоциональные реакции, и являются целевыми направлениями этого демонстрационного исследования. Эти регионы были исследованы путем сбора Коронарные срезы головного мозга на предметные стекла микроскопа, и обрабатывать участки с специфическими ингибиторами наряду со специфическим радиолиганда для рецепторов Ang II. В этом исследовании все материалы и реагенты и способы их поставщиков перечислены, Йод-125 был использован для радиоактивной антагонист Ang II рецептора, саркозина 1, изолейцин 8 Ang II (SI Ang II), который затем очищали , как моно 125 I -SI АТ II с использованием методов ВЭЖХ , как описано ранее 35. Использование этой высокой удельной активности радиоактивного лиганда позволяет визуализировать зоны с низкой, средней и высокой плотности рецепторов после воздействия на радиоактивно меченных участков с рентгеновской пленкой. Путем калибровки пленку со стандартами мозга пасты, содержащей известное количество йода-125, конкретные суммыангиотензина II связывания рецепторов в области может быть определена количественно. В экспериментальных исследованиях, рецептор Ang II связывание в мозге испытуемых можно сравнить с, что в мозге контрольных субъектов. Это может указать, является ли изменены действия Ang II в ответ на генетическое состояние, фенотипические аномалии, болезненного состояния или медикаментозного лечения. Это знание может быть применен к разработке методов лечения для лечения заболеваний, связанных с нарушением регуляции РАН. Альтернативные методы , которые идентифицируют рецептор сайты связывания, но с уменьшенной анатомической разрешением, являются обязательными для анализов , которые используют мембранные препараты тканей , полученных из гомогенатов тканей, которые инкубируемых с меченым лигандом в диапазоне концентраций с целью оценки связывания радиолиганда сродством как константа диссоциации (K D ) и максимальная связывающая способность (в макс) интересующей ткани.

Протокол, описанный здесь, может быть разбита на 5 основных сотрудничестваmponents: Готовимся Tissue Разделы для рецептора авторадиографии; Рецептор Авторадиография; Фильм экспозиции и развития; гистологии; и Денситометрический анализ изображений.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все процедуры на животных , проведенные для данного исследования были одобрены Institutional Animal Care и использование комитета Нова Юго - Восточного университета по в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных, 8 - е издание (Национальная академии Press, Вашингтон, округ Колумбия, 2011 ).

1. Подготовка ткани Секции Receptor Авторадиография

  1. После жертвоприношения, урожай свежей ткани мозга, и завернуть в алюминиевую фольгу и поместить в -20 ° C морозильнике как можно скорее. Для поддержания правильной формы, поместить мозги в пресс-форме мозга, которая имитирует внутреннюю часть черепа, завернуть в алюминиевую фольгу и поместите его в - 20 ° C морозильнике. Через 30 минут, место ткани в герметичную сумку для хранения с морозильной камерой и перейти к -80 ° C морозильнике для длительного хранения.
    1. Получить свежие образца замороженной ткани, представляющие интерес от -80 ° C с морозильной камерой, и трансфер в криостат установлен в размере не менее -10 ° С и не более -18 ° С, чтобы избежать размораживания.
    2. Поместите образец на ткань крепление с гликолем и смолы на основе вложения среды, только вложение малую часть образца в среду. Для мозга, мозг установлен вертикально, чтобы позволить секционирования в корональной плоскости.
  2. Поместите ткань крепление на микротомом внутри криостата и прочно затянуть на месте. Убедитесь, что левая и правая сторона мозга в тех же координатах передне-задне, и что спинно-вентральной оси, перпендикулярной к наиболее часто используемым атласы мозга.
  3. Начинают резки на желаемой толщины (20 мкм рекомендуется) и оттаивают крепление секций на предметные стекла микроскопа в вертикальном направлении, чтобы иметь большую площадь поверхности пространства в слайде. Собирают разделы на слайдах в последовательных наборах из пяти, т.е. первый набор слайдов помечены 1-1, 1-2, 1-3, 1-4 и 1-5 (рисунок 3).
  4. После заполнения набор слайдов с секциями, позволяют слайды высохнуть на воздухе на срок до 1 часа, затем поместите SLIдез в пластиковой коробке слайд в самоуплотняющейся морозильника мешок для хранения, и хранить при температуре -20 ° C.

2. Рецептор Авторадиография

ВНИМАНИЕ: Радиоактивность. Используйте защитную одежду, чтобы справиться с радиоактивностью. Утилизация это зависит от учреждения, и должны следовать правилам, чтобы должным образом распадаться (период полураспада 60 дней) или быть подобран в сертифицированной компании.

  1. Удалите "-1" и "-2" слайды , представляющие интерес от -20 ° C морозильника и крепление в захваты слайд (рисунок 5). Установите на "-1" слайды вместе для «неспецифического» лечения, и "-2" слайды для "полного" лечения. «Неспецифические» банки будут содержать 10 мкМ конечные концентрации PD123319 АТ 2 антагониста R и лозартана АТ 1 антагонист R, в буфере для анализа среды (АМ5) (таблица 1), "полное" связывающие банки будут содержать только 10 мкМ PD123319 в AM5.
  2. Обратить слайдручки, чтобы поместить слайды в Коплин баночек Прединкубационная заполненными 35-40 мл AM5 и соответствующих ингибиторов в течение 30 мин при комнатной температуре. Начало последующие наборы в их предварительной инкубации ванны с интервалом 4 мин.
  3. Немедленно передать слайды из предварительной инкубации раствора к инкубационной слайд почтовые программы, содержащей 10 мл AM5, плюс заданную концентрацию 125 I-SI-Ang II (рассчитанный на рисунке 4) с соответствующими ингибиторами, в течение 60-90 мин при комнатной температура. Если имеется достаточно радиолиганда, 10 слайдов могут быть размещены (спина к спине) в модифицированных захватами слайдов и инкубировали с 125 I-SI-Ang II в Коплин банки.
  4. Место скользит назад в слайд захватами (при необходимости), блот, и полоскание осторожно закрученной в течение 1-2 сек в 400 мл дистиллированной воды в двух отдельных контейнерах.
  5. Передача слайдов последовательно в четырех банках Коплин , содержащих 35-40 мл AM5 ровно 1 мин каждый (как показано на рисунке 4 </ Сильный>).
  6. После последней 1 мин полоскание, нежно вихревой секции на 1-2 сек в четырех изменениях льда холодной дистиллированной воды.
  7. Укладкой слайды с прохладным воздухом (Внимание: горячий воздух volatizes радиоактивное соединение) с помощью четырех фен установить с разными углами в течение 4 мин (рисунок 5), пока все секции не высохнут, а затем поместить на бумажное полотенце.
  8. Гора сползает с тканями лицевой стороной вверх на картон для прикладывания к рентгеновской пленке с помощью двухсторонней ленты.
  9. Крепление по крайней мере , один, 125 калибровки Йод стандартный слайд на каждый картон (рисунок 6).
    Примечание: Калибровочные стандарты состоят из пасты мозга тщательно смешивают с 125 Йод связан с соединением , содержащим фенольного кольца, уплотнен путем центрифугирования в 1 мл туберкулиновые шприцы, которые являются криостат разрезали на той же толщины, что и срезах мозга и оттаивать монтажа на микроскоп слайды. В качестве альтернативы, 125 калибровочных стандартов I впластик смолы срезы толщиной 20 мкм, могут быть получены на коммерческой основе. Пластиковая смола в этих стандартах частично экранирует пленку от излучения таким образом, что ткань эквивалентность ~ 40% следует учитывать при калибровке.

3. Фильм экспозиции и развития

  1. Перейдите к фотолаборатории с накладным задней рентгеновской кассеты и авторадиографии пленки. Откройте кассету и поместите картон с горками внутри (рисунок 6).
    1. Включите огни и включите безопасного освещения. Осторожно откройте коробку рентгеновскую пленку, удалить одну пленку и поместите пленку блестящей стороной вверх (с зубчатым краем на нижнем правом углу) поверх слайдов в кассете. Осторожно закройте кассету, и поверните фиксирующие стержни , чтобы запечатать свет (рисунок 6). Expose слайды в течение нескольких дней до нескольких недель при температуре -20 ° C.
  2. В фотолаборатории, откройте кассету и приступить к разработке фильма ргосESS.
    1. Поместите слайды в лотки последовательно; Разработчик в течение 2 мин, воду, содержащую 5% лед ной уксусной кислоты в течение 30 сек, и закрепитель в течение 5 мин. Пленки помещенная в лоток с проточной водой в течение 20 мин, затем помещают в Photoflo не более чем на 10 секунд и подвесили.
      Примечание: Время экспозиции определяется опытным путем и может включать в себя несколько пленок с разными экспозициями: достаточно долго, чтобы получить измеримые сигналы из областей с низким связыванием, но не так долго, чтобы насытить фильм местах с высоким уровнем связывания. После того, как приемлемые риски получаются, а затем перейти к следующему шагу.

4. Гистология

  1. Подготовьте тионин пятна и окрашивания реагентов (таблица 2, рисунок 7).
    1. Поместите "-3" слайдов в стойку слайдов, и передача в последовательном порядке, начиная с деионизированной водой в течение 1 мин, а затем тионин пятно раствор в течение 10 мин с последующими тремя погружена в Deionнализованных воды, и одна стирка 30 сек в деионизированной воде.
    2. После воды, поместите слайд стойку в промывок этанол следующим образом; 50%, 70%, и 90% в течение 30 сек, с последующими двумя промывками этанола при 100% в течение 1 мин каждый раз. И, наконец, поместите слайд стойки на ксилола в течение 3 мин, а затем перенести через к второму раствору ксилоле в течение 5 мин.
  2. Удалить один слайд за один раз из последней ванны ксилол, и покрывают верхний край ползуна с основанием смолы в монтажном среде органического растворителя, и помещают 24 мм х 60 мм покровное на слайд. Разрешить слайды в достаточной степени высохнуть в течение ~ 48 часов, а затем сканировать в компьютер на 2400 точек на дюйм в оттенках серого.

5. Денситометрический анализ изображений

  1. Поместите пленки блестящей стороной вниз, с зубчатым краем на левом нижнем углу экрана и сканирования с использованием фирменной сканер, способный передавать информацию о плотности пленки без каких-либо искажений в системе формирования изображения компьютера.
  2. Откройте фирменные SYS визуализацииTEM и использовать калибровочные стержни для установления калибровочных стандартов для будущего денситометрическом анализа изображений на пленке ( на рисунках 9 - 12).
  3. Мера областей интереса либо создания шаблона или эмпирически с изложением областей, представляющих интерес. Данные собранные и разделены на основе пленки, либо контроль или дикого типа (раздел), и область. Убедитесь в том , чтобы включить плотность (фмоль / г), область сканирования, а также общую целевую область при измерениях (рисунок 9).
    1. Настройка сканирования полосы площадь, гарантируя , что область интереса находится между параметрами подсветки (рисунок 10).
    2. Экспорт данных в электронную таблицу (таблица 4). Умножьте Времена плотности общей целевой области, а затем разделить на площадь сканирования, чтобы получить значение для связывания этой конкретной области. После того, как это делается для всех значений, измеренных, субстратная установленный неспецифический от общего с получением специфического связывания рнегодуют. Сред также может выполняться для этих значений.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Обзор метаболического пути ренин-ангиотензин системы показана на рисунке 1 и прямой акцент на подтипы рецепторов ангиотензина II (AT 1 R и AT 2 R) описывается на рисунке 2. Рисунок 3 показывает передачу корональной мозга разделы на предметные стекла микроскопа, которые затем проходят через процедуру рецептора авторадиографии с использованием заданной концентрации 125 I-Siang II , как показано на р...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Описанный протокол идентифицирует визуализацию 'Total' и 'неспецифический' связывания радиолиганда в смежных участках корональных секций грызуна мозга ранее заготовленной и хранили при -80 ° С, и может быть легко применимы к практически в каждой ткани, имеет анатомически решен подструктуры, отображающие дифференциальные количества рецепторов или связывания радиолиганда сайтов. Процедуры, описанные в протоколе просты и анализ имеет решающее значение для правильной интерпретации результатов. Толщина 20 мкм...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Роберт Шпет лицензировал антитела к рецепторам ангиотензина II коммерческому поставщику и получает роялти от продажи указанных антител. Остальным авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа выполнена при поддержке гранта NIH HL-113905

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
500 мл Пластиковые стаканыFisher02-591-30
24 мм x 60 мм CoverslipsFisher22-050-25
Пленка для авторадиографической визуализации 24 мм x 30 смCarestream-Biomax MR Пленка891-2560
Бацитрацин (из Bacillus licheniformis)SigmaB-0125
Картонный лист 8 x 11Картонная доска для иллюстрации Crescent #201201
Банки CoplinFisher ScientificE94
Коммерческие феныConairModel SD6X
Одноразовые пробирки для культивированияFisher14-961-26
EDTA (Динатриевая соль, Дигидрат)USB Corporation15-699
ЭтанолFisher16-100-210 
Заменитель формуляра для проявителя D-19Photographers Formulary, Inc. 01-0036
Ледяная уксусная кислотаFisherA38 SI-212
Histoprep/OCTFisherSH75-125D
Film FixerKodak5160320
Фото floKodak1464502
ЛозартанFisher/Tocris37-985-0
MCID™ Core 7.0MCIDN/A
NaClFisherS271
Peel-A-Way скользящие ручкиVWR48440-003
PermountFisherSP15-100
PD123319Fisher13-615-0
Премиум заряженные слайды, тонко отшлифованные краяPremiere Microscope Слайды9308W
125I ЛигандыPerkin ElmerNEX- 248
125SI-Ang II Университет ДжорджаВашингтона Радиойодирование д-ра Шпета
Слайд МейлерсНаучныйHS15986
натрия двухосновной фосфат безводный (Na2PO4)FisherRDCS0750500
ацетат натрия (безводный)FisherBP333-500
Тионин Рентгеновская кассета FisherT409-25
(10 x 12)Spectronics CorporationFour Square
XyleneFisher X3P-1GAL

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mozaffarian, D., et al. Heart disease and stroke statistics--2015 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 131 (4), 29-322 (2015).
  2. Peart, W. S. The Renin-Angiotensin System. Pharmacol Rev. 17, 143-182 (1965).
  3. Ganten, D., et al. Angiotensin-forming enzyme in brain tissue. Science. 173 (3991), 64-65 (1971).
  4. Ganten, D., Fuxe, K., Phillips, M. I., Mann, J. F. E., Ganten, U. Frontiers in Neuroendocrinology. Ganong, W. F., Martini, L. , Raven Press. N.Y. Vol. 5 61-99 (1978).
  5. Fyhrquist, F., Metsarinne, K., Tikkanen, I. Role of angiotensin II in blood pressure regulation and in the pathophysiology of cardiovascular disorders. J Hum Hypertens. 9, Suppl 5 19-24 (1995).
  6. von Bohlenund und Halbach, O., Albrecht, D. The CNS renin-angiotensin system. Cell Tissue Res. 326 (2), 599-616 (2006).
  7. Speth, R., Giese, M. Update on the renin-angiotensin system. J Pharmacol Clin Toxicol. 1 (1), 1004(2013).
  8. de Kloet, A. D., Liu, M., Rodriguez, V., Krause, E. G., Sumners, C. Role of neurons and glia in the CNS actions of the renin-angiotensin system in cardiovascular control. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. , (2015).
  9. Saavedra, J. M., Sanchez-Lemus, E., Benicky, J. Blockade of brain angiotensin II AT1 receptors ameliorates stress, anxiety, brain inflammation and ischemia: Therapeutic implications. Psychoneuroendocrinology. 36 (1), 1-18 (2011).
  10. Stornetta, R. L., Hawelu-Johnson, C. L., Guyenet, P. G., Lynch, K. R. Astrocytes synthesize angiotensinogen in brain. Science. 242, 1444-1446 (1988).
  11. Li, W., Peng, H., Seth, D. M., Feng, Y. The Prorenin and (Pro)renin Receptor: New Players in the Brain Renin-Angiotensin System. Int.J.Hypertens. 2012, 290635(2012).
  12. Strittmatter, S. M., Kapiloff, M. S., Snyder, S. H. [3H]captopril binding to membrane associated angiotensin converting enzyme. Biochem. Biophys. Res. Commun. 112, 1027-1033 (1983).
  13. Bild, W., Hritcu, L., Stefanescu, C., Ciobica, A. Inhibition of central angiotensin II enhances memory function and reduces oxidative stress status in rat hippocampus. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 43, 79-88 (2013).
  14. Wright, J. W., Harding, J. W. Brain renin-angiotensin-A new look at an old system. Progress in Neurobiology. 95 (1), 49-67 (2011).
  15. Tashev, R., Stefanova, M. Hippocampal asymmetry in angiotensin II modulatory effects on learning and memory in rats. Acta Neurobiol Exp (Wars). 75 (1), 48-59 (2015).
  16. Reudelhuber, T. L. The continuing saga of the AT2 receptor: a case of the good, the bad, and the innocuous. Hypertension. 46 (6), 1261-1262 (2005).
  17. Carey, R. M. Cardiovascular and renal regulation by the angiotensin type 2 receptor: the AT2 receptor comes of age. Hypertension. 45 (5), 840-844 (2005).
  18. Valero-Esquitino, V., et al. Direct angiotensin type 2 receptor (AT2R) stimulation attenuates T-cell and microglia activation and prevents demyelination in experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. Clin Sci (Lond). 128 (2), 95-109 (2015).
  19. Chen, J., et al. Neuronal over-expression of ACE2 protects brain from ischemia-induced damage. Neuropharmacology. 79, 550-558 (2014).
  20. Kalra, J., Prakash, A., Kumar, P., Majeed, A. B. Cerebroprotective effects of RAS inhibitors: Beyond their cardio-renal actions. J Renin Angiotensin Aldosterone Syst. , (2015).
  21. Zhao, Y., et al. Activation of intracellular angiotensin AT(2) receptors induces rapid cell death in human uterine leiomyosarcoma cells. Clin Sci (Lond). 128 (9), 567-578 (2015).
  22. Gehlert, D. R., Speth, R. C., Wamsley, J. K. Quantitative autoradiography of angiotensin II receptors in the SHR brain. Peptides. 7 (6), 1021-1027 (1986).
  23. Mendelsohn, F. A., Quirion, R., Saavedra, J. M., Aguilera, G., Catt, K. J. Autoradiographic localization of angiotensin II receptors in rat brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (5), 1575-1579 (1984).
  24. Gehlert, D. R., Speth, R. C., Wamsley, J. K. Autoradiographic localization of angiotensin II receptors in the rat brain and kidney. Eur J Pharmacol. 98 (1), 145-146 (1984).
  25. Speth, R. C., et al. Angiotensin II receptor localization in the canine CNS. Brain Res. 326 (1), 137-143 (1985).
  26. Santos, R. A. S., et al. Angiotensin-(1-7) is an endogenous ligand for the G protein-coupled receptor Mas. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (14), 8258-8263 (2003).
  27. Karamyan, V. T., Gembardt, F., Rabey, F. M., Walther, T., Speth, R. C. Characterization of the brain-specific non-AT(1), non-AT(2) angiotensin binding site in the mouse. Eur J Pharmacol. 590 (1-3), 87-92 (2008).
  28. Karamyan, V. T., Speth, R. C. Distribution of the non-AT1, non-AT2 angiotensin-binding site in the rat brain: preliminary characterization. Neuroendocrinology. 88 (4), 256-265 (2008).
  29. Karamyan, V. T., Stockmeier, C. A., Speth, R. C. Human brain contains a novel non-AT1, non-AT2 binding site for active angiotensin peptides. Life Sci. 83 (11-12), 421-425 (2008).
  30. Miller-Wing, A. V., et al. Central angiotensin IV binding sites: distribution and specificity in guinea pig brain. J Pharmacol Exp Ther. 266 (3), 1718-1726 (1993).
  31. Castren, E., Kurihara, M., Saavedra, J. M. Autoradiographic localization and characterization of angiotensin II binding sites in the spleen of rats and mice. Peptides. 8 (4), 737-742 (1987).
  32. MacGregor, D. P., et al. Angiotensin II receptor subtypes in the human central nervous system. Brain Res. 675 (1-2), 231-240 (1995).
  33. Plunkett, L. M., Correa, F. M. A., Saavedra, J. M. Quantitative autoradiographic determination of angiotensin-converting enzyme binding in rat pituitary and adrenal glands with 125I-351/A, a specific inhibitor. Regul Pept. 12, 263-272 (1985).
  34. Armando, I., et al. Increased angiotensin II AT(1) receptor expression in paraventricular nucleus and hypothalamic-pituitary-adrenal axis stimulation in AT(2) receptor gene disrupted mice. Neuroendocrinology. 76 (3), 137-147 (2002).
  35. Speth, R. C., Harding, J. W. Angiotensin Protocols Vol. 51 Methods in Molecular Medicine. Wang, D. H. , Humana Press. 275-295 (2001).
  36. Widdop, R. E., Jones, E. S., Hannan, R. E., Gaspari, T. A. Angiotensin AT2 receptors: cardiovascular hope or hype. Br J Pharmacol. 140 (5), 809-824 (2003).
  37. Michel, M. C., Wieland, T., Tsujimoto, G. How reliable are G-protein-coupled receptor antibodies. Naunyn Schmiedebergs Arch.Pharmacol. 379 (4), 385-388 (2009).
  38. Jensen, B. C., Swigart, P. M., Simpson, P. C. Ten commercial antibodies for alpha-1-adrenergic receptor subtypes are nonspecific. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 409-412 (2009).
  39. Jositsch, G., et al. Suitability of muscarinic acetylcholine receptor antibodies for immunohistochemistry evaluated on tissue sections of receptor gene-deficient mice. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 389-395 (2009).
  40. Hamdani, N., van der Velden, J. Lack of specificity of antibodies directed against human beta-adrenergic receptors. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 403-407 (2009).
  41. Bodei, S., Arrighi, N., Spano, P., Sigala, S. Should we be cautious on the use of commercially available antibodies to dopamine receptors. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 413-415 (2009).
  42. Lu, X., Bartfai, T. Analyzing the validity of GalR1 and GalR2 antibodies using knockout mice. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 417-420 (2009).
  43. Everaerts, W., et al. Where is TRPV1 expressed in the bladder, do we see the real channel. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 421-425 (2009).
  44. Adams, J. M., McCarthy, J. J., Stocker, S. D. Excess dietary salt alters angiotensinergic regulation of neurons in the rostral ventrolateral medulla. Hypertension. 52 (5), 932-937 (2008).
  45. Herrera, M., Sparks, M. A., Alfonso-Pecchio, A. R., Harrison-Bernard, L. M., Coffman, T. M. Lack of specificity of commercial antibodies leads to misidentification of Angiotensin type 1 receptor protein. Hypertension. 61 (1), 253-258 (2013).
  46. Rateri, D. L., et al. Endothelial Cell-Specific Deficiency of Ang II Type 1a Receptors Attenuates Ang II-Induced Ascending Aortic Aneurysms in LDL Receptor(-/-) Mice. Circ Res. 108 (5), 574-583 (2011).
  47. Benicky, J., Hafko, R., Sanchez-Lemus, E., Aguilera, G., Saavedra, J. M. Six Commercially Available Angiotensin II AT(1) Receptor Antibodies are Non-specific. Cell Mol Neurobiol. 32 (8), 1353-1365 (2012).
  48. Elliott, K. J., Kimura, K., Eguchi, S. Lack of specificity of commercial antibodies leads to misidentification of angiotensin type-1 receptor protein. Hypertension. 61 (4), 31(2013).
  49. Hafko, R., et al. Commercially available angiotensin II At(2) receptor antibodies are nonspecific. PLoS One. 8 (7), 69234(2013).
  50. Gonzalez, A. D., et al. Distribution of angiotensin type 1a receptor-containing cells in the brains of bacterial artificial chromosome transgenic mice. Neuroscience. 226, 489-509 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Receptor AutoradiographyAngiotensin II ReceptorsBrain Tissue SectioningRadioligand Binding AssayNon Specific BindingTotal BindingCryostat SectioningAutoradiography Film ExposureThionin Histological StainingDensitometry Analysis

Related Articles