Методическая статья

Эпигенетическое преобразования как безопасный и простой метод получения секретирующих инсулин клеток из фибробластов кожи взрослых

DOI:

10.3791/53880

⸱

18 марта 2016 г.

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Biomedical Embryology, Unistem, Centre for Stem Cell Research, Università degli Studi di Milano

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь представлен новый метод, который позволяет превращать фибробласты кожи взрослого человека в клетки, секретирующие инсулин. Эта методика основана на эпигенетической конверсии, не предполагает ни использования ретровирусных векторов, ни приобретения стабильного плюрипотентного состояния. Поэтому он очень перспективен для применения в трансляционной медицине.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Регенеративная медицина требует новых, полностью функциональных клеток, которые доставляются пациентам для восстановления дегенерированных или поврежденных тканей. Когда такие клетки не являются легкодоступными, они могут быть получены с использованием различных подходов, которые включают, среди многих, перепрограммирование и трансдифференцировку, с преимуществами и ограничениями, специфичными для различных методов. Здесь описывается новая стратегия превращения зрелого взрослого фибробласта в инсулин-секретирующую клетку, произвольно обозначенную как эпигенетические преобразованные клетки (EpiCC). Метод был разработан на основе растущего понимания механизмов, контролирующих эпигенетическую регуляцию судьбы и дифференцировки клеток. В частности, на первом этапе используется эпигенетический модификатор, а именно 5-аза-цитидин, чтобы привести взрослые клетки в «высокодозвовающее» состояние. Затем он использует это короткое и обратимое окно эпигенетической пластичности, чтобы переадресовать клетки в сторону другой линии. Этот подход получил обозначение «эпигенетическая клеточная конверсия». Это простой и надежный способ получить эффективный, контролируемый и стабильный коммутатор сотовой связи. Поскольку протокол не предполагает использования какой-либо трансфекции генов, он свободен от вирусных векторов и не предполагает стабильного плюрипотентного состояния, он является весьма перспективным для применения в трансляционной медицине.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Основной задачей регенеративной медицины является генерирование новых функциональных клеток, которые могут быть использованы для ремонта или замены поврежденного, выродились ткани. Переделка легко доступные взрослые клетки в новые, путем преобразования их из одного типа клеток в другой, является особенно привлекательным подход, особенно когда требуется популяция клеток не обильные или трудно получить доступ. Тем не менее, взрослые клетки удивительно стабильны. Они приобретают их дифференцированное состояние путем постепенного ограничения в их возможностях и, как только они достигают зрелого терминала специализации, они стабильно сохраняют его 1.

В последние годы был разработан целый ряд протоколов, которые позволяют перепрограммировать к плюрипотентности соматической клетки (ИПС) достигается за счет принудительного экспрессии набор факторов транскрипции 2,3. В качестве альтернативы, преобразование клеток может быть получена путем прямого клонального трансдифференциации, представляя один 4 или сочетание факторов транскрипции 5-7. Эта стратегия не предполагает перехода через состояние де-дифференцированы , но требует высокой экспрессии специфических транскрипционных факторов 8.

Недавно мы разработали протокол обращения на основании кратковременном воздействии взрослых клеток к свойствам деметилирующий в цитидин аналоговой 5-азацитидина (5-аза-CR), ингибитор хорошо охарактеризованного ДНК-метилтрансферазы. Стадия деметилирования немедленно следует определенному протоколу 9-11 дифференциации , что позволяет получить необходимую терминальную фенотип. Этот метод способен превратить зрелых, дифференцированных клеток в клетки различного рода и имеет существенное преимущество, чтобы избежать как использование вирусных векторов и трансфекцию любых экзогенных факторов транскрипции. Приобретение стабильного плюрипотентного состояния, и связанная с ним повышенная восприимчивость к клеточной нестабильности также избежать.

Подробный протокол, который позволяет преобразование взрослых фибробластов кожи человека в полностью функциональные инсулин-секретирующих клеток представлена ​​здесь. Тем не менее, стоит отметить, что этот метод был применен к различным типам клеток и положительным результатам, при решении клеток по отношению к различным путям дифференцировки. Кроме того, эпигенетическое преобразование было успешно использовано в человеческих и свиные виды 9-13, а также у собак (рукопись представлена) предлагая широкий эффективность и надежность подхода.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Примечание: Все процедуры, описанные ниже, должны выполняться под колпаком с ламинарным потоком в стерильных условиях. Убедитесь, что все процедуры культуры проводятся на терморегулирующие стадиях и клетки выдерживали при 37 ° C в течение их обработки.

1. Кожа Фибробласт Изоляция

  1. Готовят блюдо культуры Coating Solution
    1. Растворить 0,1 г свиных желатина в 100 мл воды (конечная концентрация 0,1%). Стерилизовать раствор с автоклава.
    2. Добавить 1,5 мл стерильного 0,1% желатина свиной до 35 мм чашки Петри. Подождите 2 ч, чтобы покрыть, поддерживая их при комнатной температуре.
      Примечание: биопсий кожи человека собирают иссечения под местной анестезией из бессосудистой области передней поверхности предплечья и хранится в Дульбекко фосфатным буферным физиологическим раствором (PBS) с добавлением 2% противогрибкового раствором антибиотика при + 4 ° С до использования.
  2. Вымойте биопсии с новым PBS с добавлением 2% antibiушные противогрибковым раствором.
  3. Место биопсий в блюдо 100 мм чашки и нарезать примерно 2 мм 3 фрагментов с стерильным скальпелем.
  4. Удалите раствор избыточного покрытия непосредственно перед металлизированный фрагментов.
  5. Поместите 5-6 фрагментов кожи в предварительно покрытых 35 мм чашках Петри.
  6. Готовят фибробластический культуральной среды: 77% Дульбекко в модификации Дульбекко (DMEM), с высоким содержанием глюкозы, 20% фетальной бычьей сыворотки (ФБС), 1% L-глутамина раствор и 2% противогрибкового раствора антибиотика.
  7. Добавьте капельку фибробластами среды в течение каждого фрагмента ( как правило , 100 мкл на фрагменте) и культуры их при температуре 37 ° С в 5% CO 2.
  8. Через 24 часа добавляют 500 мкл культуральной среды фибробластов по фрагментам , чтобы держать их влажным при температуре 37 ° С в 5% CO 2.
  9. Изменение среды с пипеткой по меньшей мере, один раз каждые 48 часов.
  10. Через 6 дней инкубации, удаления фрагментов ткани тщательно и выбросить их.
    Примечание: Через 6 дней, фибробластыs начинают расти из фрагментов ткани и начинают формировать монослой клеток.
  11. Refresh среду, добавляют 2 мл культуральной среды фибробластов , и продолжают монослой клеток культуры при 37 ° С в 5% СО 2 инкубаторе.

2. Культура Фибробласт

  1. Фибробласты культуры при температуре 37 ° С в 5% CO 2 до 80% слияния
  2. Для пассирования, аспирация фибробласты культуральной среды из тканевой культуры блюд. Мыть клетки три раза 4 мл PBS с добавлением 1% противогрибкового раствором антибиотика.
  3. Добавьте тонкий слой (10% от объема культуральной среды) раствора трипсин-ЭДТА (0,5 г / л свиным трипсином и 0,2 г / л ЭДТА) и инкубируют при 37 ° С до монослой клеток не начнет отделяться от нижней части ткани культуры блюдо и клетки диссоциируют.
  4. Развести суспензии клеток с 9 частями фибробластами культуральной среды, чтобы нейтрализовать трипсина действие. Центрифугирование нет необходимости.
  5. Пластина клеток в новых блюдах культуры (сиз желатина) и культуры при 37 ° С в 5% СО 2 инкубатора. Хранить соотношение проход между 1: 2 и 1: 4, в зависимости от скорости роста.
  6. Когда клетки достигают около 80% сплошности, прохождение их (как правило, два раза в неделю).

3. Фибробласт Покрытие для эпигенетические преобразования

  1. Добавить 0,26 мл / см 2 0,1% желатина свиной (готовят , как описано в пункте 1.1) для клеточной культуры блюд. Подождите 2 часа до пальто.
  2. Удалите раствор для покрытия избыток 10-30 мин до металлизированный фибробласты.
  3. Удалить фибробласты культуральной среды из культуры блюд. Мыть клетки три раза PBS с добавлением 1% противогрибкового раствором антибиотика.
  4. Добавьте тонкий слой (10% от объема культуральной среды) раствора трипсин-ЭДТА (0,5 г / л свиным трипсином и 0,2 г / л ЭДТА) и инкубируют при 37 ° С до монослой клеток не начнет отделяться от нижней части ткани культуры блюдо и клетки диссоциируют.
  5. Развести суспензии клеток с 9 частями fibroblAST культуральной среды, чтобы нейтрализовать трипсина действие.
  6. Граф клеток с использованием счетнокамерное под микроскопом при комнатной температуре. Рассчитать необходимый объем фибробласты культуральной среды для ресуспендирования клеток, чтобы получить концентрацию клеток 7,8 × 10 4 фибробластах / см 2. Это будет зависеть от конкретного типа используемой камеры.
    Клетки / мкл = Среднее число клеток на небольшой сетки х 90 (коэффициент размножения) х разбавления
  7. Суспензию клеток Центрифуга при 150 г в течение 5 мин при комнатной температуре. Удалить супернатант и ресуспендирования клеток с ранее вычисленного объема культуральной среды фибробластов.
  8. Пластина клеток на 0,1% желатином блюд и культуры их в течение 24 ч при температуре 37 ° С в 5% СО 2 инкубатора предварительно нанесенным покрытием.

4. Увеличение Cell Пластичность Использование De-метилирующими агентом 5-аза-CR

  1. День 0
    1. Подготовка 5-аза-CR маточного раствора путем растворения 2,44 мг 5-аза-CR в 10 мл высокой Medi глюкозы DMEMит. Стерилизуют фильтрацией. Подготовка 5-аза-CR акции непосредственно перед использованием.
    2. Развести 1 мкл 5-аза-CR раствора в 1 мл культуральной среды фибробластов (конечная концентрация 1 мкМ).
    3. Чтобы увеличить клеточную пластичностью, через 24 ч после посева клеток (подзаголовка 3,8), удалить культуральную среду , из посеянных фибробластов и добавляют 1 мкМ 5-аза-CR маточного раствора и культуру в течение 18 ч при температуре 37 ° С в 5% СО 2 инкубаторе.
  2. 1 день
    1. Подготовка свежей человеческой плюрипотентных (HP) среды , как описано в таблице 1.
    2. После инкубации с 1 мкМ 5-аза-CR, удалить средние и мыть клетки три раза PBS, чтобы гарантировать, что 5-аза-CR смыть.
    3. Выдержите 5-аза-CR Обработанные фибробласты со средой HP в течение 3 часов (восстановительный период) при температуре 37 ° С в 5% CO 2.
    4. После периода восстановления, удаления средней, мыть три раза PBS.
    5. Для контроля эффективности 5-аза-CR лечения, проверьте в этом этапе еили наличие морфологических изменений (подробно описано в разделе Результаты). Клетки теряют типичную удлиненную морфологию фибробластов и приобретают круглую или овальную форму, становясь меньше по размеру, с увеличенными ядрами.
    6. Продолжайте панкреатического дифференциации.

5. Разграничение Протокол Поджелудочная

  1. Дни 1-6
    1. Подготовка Панкреатический базальную среду , как описано в таблице 2.
    2. Подготовка активин маточного раствора: растворить 5 мкг активин А рекомбинантного человеческого белка в 166,6 мкл стерильной воды.
    3. Культура 5-аза-CR обрабатывают фибробласты в 0,26 мл / см 2 панкреатических базальной среды, дополненной 1 мкл / мл активин маточного раствора (см 5.1.2) в течение 6 дней при температуре 37 ° С в атмосфере 5% СО 2 инкубаторе. Изменение среды ежедневно.
  2. Дни 7-8
    1. Подготовка ретиноевой кислоты маточного раствора путем добавления 16,6 мл диметилсульфоксида (ДМСО) до 50 мг ретиноевой ACId.
    2. Культура клеток в 0,26 мл / см 2 Панкреатического базальной среды , дополненной 1 мкл / мл активин маточного раствора (см 5.1.2) и 1 мкл / мл кислоты запаса ретиноевой раствор (см 5.2.1) в течение 2 дней при 37 ° C в 5% CO 2. Изменение среды ежедневно.
  3. Дни 9-36
    1. Культура клеток в 0,26 мл / см 2 панкреатических базальной среды , дополненной 1% (об / об) Инсулин-трансферрина-Селен (ITS), 2% (об / об) В27 и 0,1% (об / об) рекомбинантного человеческого FGF , основная (bFGF) раствор (см таблицу 1) при 37 ° с в 5% СО 2 инкубатора. Изменение носителя в день в течение первых 15 дней.
    2. С 16-й день и далее, обновить среду через день, под микроскопом, так как вещества, образующие агрегаты клетки могут отделяться от дна чашки для культивирования.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Создание первичной культуры от биопсии кожи
Биопсия кожи были вырезаны в небольших фрагментов и поместили в желатиновые чашки, предварительно покрытые. Через 6 дней, фибробласты начал расти из фрагментов ткани и образовали монослой клеток (рис 1А). Клетки показали типичную удлиненную форму и, как и следовало ожидать, отображается однородный иммунно-положительности фибробластами специфического маркера виментину (VIM, Фигура 1В).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Настоящая рукопись описывает метод, который позволяет преобразования фибробластов кожи человека в инсулин-продуцирующие клетки, через транзиторной и кратковременного воздействия 5-аза-CR, а затем тканеспецифическому индукции протокола. Такой подход позволяет перейти от мезодермы , связанных с эндодермы клеток, без принудительной экспрессии факторов транскрипции или микроРНК , ни приобретение стабильного плюрипотентного состояния, что делает клетки более нестабильны и склонны к ошибкам 14.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была профинансирована Каррарези Фондом и Европейским фондом по изучению диабета (EFSD). GP поддерживается пост-Стипендия университета Милана. Авторы являются членами COST действий FA1201 Epiconcept: окружающая среда Epigenetics и Periconception и действий COST BM1308 Совместное использование надвигается на больших животных моделях (Салам). TALB является членом COST Action CM1406 Эпигенетическое химической биологии (EPICHEM).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Фосфатно-солевой буфер ДульбеккоSigmaD5652PBS; для промывания клеток и приготовления раствора
Антимикотический растворантибиотика SigmaA5955Компонент фибробластов, HP и поджелудочной железы
100 мм чашка ПетриSarstedt83.3902Для выделения фибробластов
Свиной желатинSigmaG1890Для покрытия посуды
ВодаSigmaW3500Для приготовления раствора
35 мм чашки ПетриSarstedt83.39Для выделения фибробластов
DMEM, с высоким содержанием глюкозы, пируватаLife Technologies41966052Для культуры фибробластов среда
Фетальная бычья сывороткаLife Technologies10500064FBS; Компонент фибробластов и HP сред
L-глютамина растворSigmaG7513Компонент фибробластов, HP и панкреатических сред
Трипсин-ЭДТА растворSigmaT3924Для диссоциации фибробластов
KOVA GLASSTIC SLIDE 10 С СЕТКАМИHycor Biomedical87144Подсчет клеток
5-АзацитидинSigmaA23855-аза-CR, для увеличения клеток пластичность в фибробластах
Ham's F-10 Nutrient MixLife Technologies31550031Для HP medium
DMEM, с низким содержанием глюкозы, пируватLife Technologies31885023Для HP medium
KnockOut Serum ReplacementLife Technologies10828028компонент HP medium
MEM Non-Minous Amino Acids SolutionLife Technologies11140035Компонент HP и базальной среды поджелудочной
2-меркаптоэтанолSigmaM7522Компонент HP и базальной среды поджелудочной
GuanosineSigma G6264Нуклеозидная смесь стоковый компонент среды HP
АденозинSigmaA4036Нуклеозидная смесь стоковый компонент среды HP
ЦитидинSigmaC4654Нуклеозидная смесь стоковый компонент среды HP
UridineSigmaU3003Нуклеозидная смесь стоковый компонент среды HP
Тимидин SigmaT1895Нуклеозидная смесь стоковый компонент среды HP
Millex-GS 0,22 &; mMilliporeSLGS033SBДля стерилизации раствора
FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human ProteinLife TechnologiesPHG0261bFGF; компонент HP и поджелудочной железы базальной среды
бычьей сыворотки альбуминSigmaA3311BSA; Компонент базальной среды поджелудочной
DMEM/F-12Life Technologies11320074Для базальной среды поджелудочной
Добавка B-27 Минус витамин АLife Technologies12587010Компонент среды поджелудочной
N-2 ДобавкаLife Technologies17502048компонент базальной среды поджелудочной
Активин А Рекомбинантный белок человекаLife TechnologiesPHG9014Для поджелудочной железы
Ретиноевая кислотаSigmaR2625Для поджелудочной железы
ДиметилсульфоксидSigmaD2650DMSO; для Ретиноевой кислоты
Препарат Инсулин-Трансферрин-СеленLife Technologies41400045ITS; для Поджелудочной железы Конечная среда
Антивиментиновые антитела Abcamab8069Для иммуноцитохимического анализа. Рабочее разведение 1:100
4′,6-Диамидино-2-фенилиндола дигидрохлоридSigma32670DAPI. Для иммуноцитохимического анализа. Рабочее разбавление  1 & микро; г/мл
5-метилцитидинEurogentecMMS-900P-BДля иммуноцитохимического анализа. Рабочее разведение 1:500
Anti-C Peptide антитела Abcamab14181Для иммуноцитохимического анализа. Рабочее разведение 1:100
антитела к PDX1 Abcamab47267Для иммуноцитохимического анализа. Рабочее разведение 1:500
Инсулин Mercodia ИФАMercodia10-1113-10Для определения высвобождения инсулина
железы железы железы железы железы железы

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhou, Q., Brown, J., Kanarek, A., Rajagopal, J., Melton, D. A. In vivo reprogramming of adult pancreatic exocrine cells to beta-cells. Nature. 455 (7213), 627-632 (2008).
  2. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  3. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  4. Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts. Cell. 51 (6), 987-1000 (1987).
  5. Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).
  6. Caiazzo, M., et al. Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts. Nature. 476, 224-227 (2011).
  7. Huang, P., et al. Induction of functional hepatocyte-like cells from mouse fibroblasts by defined factors. Nature. 475, 386-389 (2011).
  8. Marro, S., et al. Direct Lineage Conversion of Terminally Differentiated Hepatocytes to Functional Neurons. Cell Stem Cell. 9 (4), 374-382 (2011).
  9. Pennarossa, G., et al. Brief demethylation step allows the conversion of adult human skin fibroblasts into insulin-secreting cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (22), 8948-8953 (2013).
  10. Pennarossa, G., et al. Reprogramming of Pig Dermal Fibroblast into Insulin Secreting Cells by a Brief Exposure to 5-aza-cytidine. Stem Cell Rev. 10 (1), 31-43 (2014).
  11. Brevini, T. A., et al. Morphological and Molecular Changes of Human Granulosa Cells Exposed to 5-Azacytidine and Addressed Toward Muscular Differentiation. Stem Cell Rev. 10 (5), 633-642 (2014).
  12. Thoma, E. C., et al. Chemical conversion of human fibroblasts into functional Schwann cells. Stem Cell Reports. 3 (4), 539-547 (2014).
  13. Mirakhori, F., Zeynali, B., Kiani, S., Baharvand, H. Brief azacytidine step allows the conversion of suspension human fibroblasts into neural progenitor-like cells. Cell J. 17 (1), 153-158 (2015).
  14. Plath, K., Lowry, W. E. Progress in understanding reprogramming to the induced pluripotent state. Nat Rev Genet. 12 (4), 253-265 (2011).
  15. Taylor, S. M., Jones, P. A. Multiple new phenotypes induced in 10T1/2 and 3T3 cells treated with 5-azacytidine. Cell. 17 (4), 771-779 (1979).
  16. Glover, T. W., Coyle-Morris, J., Pearce-Birge, L., Berger, C., Gemmill, R. M. DNA demethylation induced by 5-azacytidine does not affect fragile X expression. Am J Hum Genet. 38 (3), 309-318 (1986).
  17. Do, J. T., Scholer, H. R. Nuclei of embryonic stem cells reprogram somatic cells. Stem Cells. 22 (6), 941-949 (2004).
  18. Niwa, H. How is pluripotency determined and maintained? Development. 134 (4), 635-646 (2007).
  19. Kahan, B. W., et al. Pancreatic precursors and differentiated islet cell types from murine embryonic stem cells: an in vitro model to study islet differentiation. Diabetes. 52 (8), 2016-2024 (2003).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

5ITS B27 BFGSPDX1 CPEP

Похожие статьи