Эпигенетическое преобразования как безопасный и простой метод получения секретирующих инсулин клеток из фибробластов кожи взрослых

Summary

Здесь представлен новый метод, который позволяет превращать фибробласты кожи взрослого человека в клетки, секретирующие инсулин. Эта методика основана на эпигенетической конверсии, не предполагает ни использования ретровирусных векторов, ни приобретения стабильного плюрипотентного состояния. Поэтому он очень перспективен для применения в трансляционной медицине.

Abstract

Регенеративная медицина требует новых, полностью функциональных клеток, которые доставляются пациентам для восстановления дегенерированных или поврежденных тканей. Когда такие клетки не являются легкодоступными, они могут быть получены с использованием различных подходов, которые включают, среди многих, перепрограммирование и трансдифференцировку, с преимуществами и ограничениями, специфичными для различных методов. Здесь описывается новая стратегия превращения зрелого взрослого фибробласта в инсулин-секретирующую клетку, произвольно обозначенную как эпигенетические преобразованные клетки (EpiCC). Метод был разработан на основе растущего понимания механизмов, контролирующих эпигенетическую регуляцию судьбы и дифференцировки клеток. В частности, на первом этапе используется эпигенетический модификатор, а именно 5-аза-цитидин, чтобы привести взрослые клетки в «высокодозвовающее» состояние. Затем он использует это короткое и обратимое окно эпигенетической пластичности, чтобы переадресовать клетки в сторону другой линии. Этот подход получил обозначение «эпигенетическая клеточная конверсия». Это простой и надежный способ получить эффективный, контролируемый и стабильный коммутатор сотовой связи. Поскольку протокол не предполагает использования какой-либо трансфекции генов, он свободен от вирусных векторов и не предполагает стабильного плюрипотентного состояния, он является весьма перспективным для применения в трансляционной медицине.

Introduction

Основной задачей регенеративной медицины является генерирование новых функциональных клеток, которые могут быть использованы для ремонта или замены поврежденного, выродились ткани. Переделка легко доступные взрослые клетки в новые, путем преобразования их из одного типа клеток в другой, является особенно привлекательным подход, особенно когда требуется популяция клеток не обильные или трудно получить доступ. Тем не менее, взрослые клетки удивительно стабильны. Они приобретают их дифференцированное состояние путем постепенного ограничения в их возможностях и, как только они достигают зрелого терминала специализации, они стабильно сохраняют его ^1.

Protocol

Примечание: Все процедуры, описанные ниже, должны выполняться под колпаком с ламинарным потоком в стерильных условиях. Убедитесь, что все процедуры культуры проводятся на терморегулирующие стадиях и клетки выдерживали при 37 ° C в течение их обработки.

1. Кожа Фибробласт Изоляция

1. Готовят блюдо культуры Coating Solution
   1. Растворить 0,1 г свиных желатина в 100 мл воды (конечная концентрация 0,1%). Стерилизовать раствор с автоклава.
   2. Добавить 1,5 мл стерильного 0,1% желатина свиной до 35 мм чашки Петри. Подождите 2 ч, чтобы покрыть, поддерживая их при комнатной температуре.
      Примечание: биопсий кожи человека собирают иссечения п....

Results

Создание первичной культуры от биопсии кожи
Биопсия кожи были вырезаны в небольших фрагментов и поместили в желатиновые чашки, предварительно покрытые. Через 6 дней, фибробласты начал расти из фрагментов ткани и образовали монослой клеток (рис 1А). Клетки показали типичную удлиненную форму и, как и следовало ожидать, отображается однородный иммунно-положительности фибробластами специфического маркера виментину (VIM, Фигура 1В).

Discussion

Настоящая рукопись описывает метод, который позволяет преобразования фибробластов кожи человека в инсулин-продуцирующие клетки, через транзиторной и кратковременного воздействия 5-аза-CR, а затем тканеспецифическому индукции протокола. Такой подход позволяет перейти от мезодермы , связанных с эндодермы клеток, без принудительной экспрессии факторов транскрипции или микроРНК , ни приобретение стабильного плюрипотентного состояния, что делает клетки более нестабильны и склонны к ошибкам ^14.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Фосфатно-солевой буфер Дульбекко	Sigma	D5652	PBS; для промывания клеток и приготовления раствора
Антимикотический раствор	антибиотика Sigma	A5955	Компонент фибробластов, HP и поджелудочной железы
100 мм чашка Петри	Sarstedt	83.3902	Для выделения фибробластов
Свиной желатин	Sigma	G1890	Для покрытия посуды
Вода	Sigma	W3500	Для приготовления раствора
35 мм чашки Петри	Sarstedt	83.39	Для выделения фибробластов
DMEM, с высоким содержанием глюкозы, пирувата	Life Technologies	41966052	Для культуры фибробластов среда
Фетальная бычья сыворотка	Life Technologies	10500064	FBS; Компонент фибробластов и HP сред
L-глютамина раствор	Sigma	G7513	Компонент фибробластов, HP и панкреатических сред
Трипсин-ЭДТА раствор	Sigma	T3924	Для диссоциации фибробластов
KOVA GLASSTIC SLIDE 10 С СЕТКАМИ	Hycor Biomedical	87144	Подсчет клеток
5-Азацитидин	Sigma	A2385	5-аза-CR, для увеличения клеток пластичность в фибробластах
Ham's F-10 Nutrient Mix	Life Technologies	31550031	Для HP medium
DMEM, с низким содержанием глюкозы, пируват	Life Technologies	31885023	Для HP medium
KnockOut Serum Replacement	Life Technologies	10828028	компонент HP medium
MEM Non-Minous Amino Acids Solution	Life Technologies	11140035	Компонент HP и базальной среды поджелудочной
2-меркаптоэтанол	Sigma	M7522	Компонент HP и базальной среды поджелудочной
Guanosine		Sigma G6264	Нуклеозидная смесь стоковый компонент среды HP
Аденозин	Sigma	A4036	Нуклеозидная смесь стоковый компонент среды HP
Цитидин	Sigma	C4654	Нуклеозидная смесь стоковый компонент среды HP
Uridine	Sigma	U3003	Нуклеозидная смесь стоковый компонент среды HP
Тимидин Sigma		T1895	Нуклеозидная смесь стоковый компонент среды HP
Millex-GS 0,22 &; m	Millipore	SLGS033SB	Для стерилизации раствора
FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein	Life Technologies	PHG0261	bFGF; компонент HP и поджелудочной железы базальной среды
бычьей сыворотки альбумин	Sigma	A3311	BSA; Компонент базальной среды поджелудочной
DMEM/F-12	Life Technologies	11320074	Для базальной среды поджелудочной
Добавка B-27 Минус витамин А	Life Technologies	12587010	Компонент среды поджелудочной
N-2 Добавка	Life Technologies	17502048	компонент базальной среды поджелудочной
Активин А Рекомбинантный белок человека	Life Technologies	PHG9014	Для поджелудочной железы
Ретиноевая кислота	Sigma	R2625	Для поджелудочной железы
Диметилсульфоксид	Sigma	D2650	DMSO; для Ретиноевой кислоты
Препарат Инсулин-Трансферрин-Селен	Life Technologies	41400045	ITS; для Поджелудочной железы Конечная среда
Антивиментиновые антитела	Abcam	ab8069	Для иммуноцитохимического анализа. Рабочее разведение 1:100
4′,6-Диамидино-2-фенилиндола дигидрохлорид	Sigma	32670	DAPI. Для иммуноцитохимического анализа. Рабочее разбавление  1 & микро; г/мл
5-метилцитидин	Eurogentec	MMS-900P-B	Для иммуноцитохимического анализа. Рабочее разведение 1:500
Anti-C Peptide антитела	Abcam	ab14181	Для иммуноцитохимического анализа. Рабочее разведение 1:100
антитела к PDX1	Abcam	ab47267	Для иммуноцитохимического анализа. Рабочее разведение 1:500
Инсулин Mercodia ИФА	Mercodia	10-1113-10	Для определения высвобождения инсулина