Большинство бактериальных инфекций производят биопленку. В силу окружающей среды, бактерии, ассоциированные с биопленкой, часто фенотипически устойчивы к лекарствам. Таким образом, новые антибактериальные молекулы, которые убивают бактерии в биопленках, имеют высокий приоритет. Мы проводим анализ для быстрого скрининга антимикробных соединений, эффективных для уничтожения биопленок.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Большинство патогенных бактерий способны образовывать биопленки во время инфекции, но из-за сложности манипуляций и оценки биопленок, подавляющее большинство лабораторных работ проводится с планктонными клетками. В данной статье мы описываем анализ биопленки с помощью колышковой пластины, проведенный с Staphylococcus aureus. Бактериальные биопленки выращиваются на колышках, прикрепленных к 96-луночной крышке микротитровальной пластины, промываются путем осторожного погружения в буфер и помещаются в планшет для приема лекарств. После последующей инкубации их снова промывают и перемещают в финальную восстановительную тарелку, в которой флуоресцентный краситель резазурин служит индикатором жизнеспособности. Этот анализ обеспечивает значительно повышенную простоту использования, надежность и воспроизводимость, а также большой объем данных при проведении в виде кинетического считывания. Более того, этот анализ может быть адаптирован к подходу к скринингу лекарств со средней пропускной способностью, при котором вместо этого берется флуоресцентное считывание конечной точки, что открывает путь для усилий по открытию лекарств.
Введение
Патогенные микроорганизмы могут образовывать биопленки в естественных условиях , приводящих к неострыми хронических инфекций 1. Биопленки-ассоциированной инфекции является серьезным фактором риска медицинских процедур, связанных с вживление инородных предметов (например, искусственные замены костей, грудные имплантаты) или установку трахеи трубок или мочевые катетеры 2. В этом контексте, антиинфекционной терапии почти всегда необходимо , так как биопленка на основе инфекции редко очищается самостоятельно, даже у иммунокомпетентных лиц. Золотистый стафилококк является одним из наиболее часто встречающихся патогенов , причастным биопленки осложнений , связанных , возникающих в процессе использования инвазивные медицинские устройства 3.
К сожалению, сама природа биопленок как защитный барьер делает их более устойчивыми к лечению , чем планктонных клеток 1,4, и оценка прогнозируемой клинической эффективности является важной частью как начальнаяразработки лекарственных средств, а также надзор за лекарственной устойчивостью. Существует все больше признание того, что лабораторные условия, ориентированные на планктонных культур, не может точно представлять реальную болезнь 5. Еще более усугубляет проблему, репликация биопленки фенотипов трудно, и существующие модели биопленки являются утомительным и страдают от высокой меж- и изменчивости внутри анализа 6. Таким образом, многие исследователи, по необходимости, по умолчанию планктонных клеток анализов лекарственной чувствительности, тем самым потенциально пренебрегая важный аспект бактериальной вирулентности и болезни.
Здесь мы опишем протокол для опробования бактерий, в частности S. стафилококк, в предварительно выращенных биопленок с использованием 96-луночного системы на основе биопленки 7,8. Хотя протокол для образования биопленки и вызов следует по существу рекомендации производителя, мы представляем альтернативную информацию богатой методологии для количественной оценки жизнеспособности biofILM после заражения. Вкратце, бактерии культивировали в колок пластине, где биопленки образуют на выступающими штифтами, прикрепленных к крышке пластины. После образования биопленки, колышки осторожно опускают в лунки свежей пластинки, заполненной PBS, чтобы удалить планктонные клетки. Колышек крышкой, с биопленок прикрепленными, переносится на новый вызов пластины, содержащей различные концентрации антибиотиков, которые будут проанализированы. После второй инкубации крышки снова удаляют, промывают, и переносили на пластину, содержащую восстановления резазурин краситель, где они подвергаются окончательному инкубацию. преобразование ресазурин могут быть записаны кинетически или взяты в качестве конечной точки чтения после определенного периода восстановления. Этот метод на основе красителя количественной оценки жизнеспособности биопленки значительно отличается от утомительных (образующих единиц колонии) КОЕ методологии рассчитывать на основе описанной в первоначальном протоколе 7. OD 600 измерения провокационной наркотиков пластины и резазурин кинетики превращения служат жизнеспособности чтениявыходы планктонных и биопленки клеток, соответственно, предлагая быстрый, надежный, богатый информацией и технически простой анализ для выживания биопленки.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. биопленки Инициирование
- Выращивают культуру биопленки продуцирующего организма в питательной среде, богатой. Привить стафилококка штамм Ньюмена в 10 мл Мюллера-Хинтон среды из глицерина запасов. Выполнение всех работ , связанных с обращение с S. стафилококк в перчатках и в кабинете биологической безопасности.
- Инкубируют в течение 16 часов при 37 ° С на ротационном шейкере (100-200 оборотов в минуту).
- Определение OD 600 культуры , используя спектрофотометр и стандартную кювету (длина пути: 1 см).
- Рассчитать объем (V) культуры , необходимой для приготовления 20 мл инокулята с OD 600 (прививочный материал ) от 0,1 в chelexed Roswell Institute Memorial Park медиа (CRPMI) 9 с использованием формулы: [V = 20 мл * 0,1 / OD 600 (культура )]
Примечание: Ссылка 9 содержит подробные сведения о подготовке CRPMI.- Добавить расчетный объем культуры (сверху) в центрифужную пробирку и гранул клеток путем прядения в течение 1 мин при 10000 х г. Для Подготовительномповторно биопленки инокулята, аспирация истощенной средой роста и ресуспендируют осадок клеток в 20 мл CRPMI.
- Налейте прививочный материал в 25 мл резервуар.
- Осторожно снимите крышку из стерильной 96-луночного колышек пластины, потянув ее прямо вверх.
Примечание: Необходимо соблюдать осторожность, чтобы не загрязнить колышки свисающие с крышкой. Крышка может быть перевернут на чистую поверхность внутри шкафа биологической безопасности. - С помощью пипетки 200 мкл многоканальный, добавьте 125 мкл посевного материала в каждую лунку ряды А до G нижней пластины.
- Заполните 125 мкл стерильной среды CRPMI в каждую лунку ряда H в качестве контроля стерильности.
- Возьмите Peg-крышку и держать ее над пластиной дна с колышками лицевой стороной вниз. Тщательно выровняйте отдельные колышки с их соответствующие лунки. Избегайте физического контакта между пластиной и колышков. После того, как выровнен, опустите крышку вниз осторожно. Избегайте перекосов, как перенастройка выполняемые после колышками коснулись нижней плиты может CONTaminate управления стерильность в строке H.
- Закрыть крышку к пластине с парафиновой пленкой для предотвращения испарения и место в закрывающийся пластиковый пакет, уплотнение плотно. Держите объем воздуха в сумке как можно более низкой, чтобы свести к минимуму испарение.
- Выдержите без встряхивания при 37 ° С в течение 48 ч в атмосфере 5% СО 2 инкубаторе.
Примечание: 48 ч роста было оптимальным для S. стафилококк, но будет меняться в зависимости от используемого организма.
Примечание: Хотя статическая Инкубационный является хорошей отправной точкой для оптимизации анализа, осторожно встряхивая при 150 оборотах в минуту на микропланшетов шейкере возможное изменение , которое может усилить образование биопленки некоторых S. стафилококка изолятов.
2. Подготовка биопленки Вызова плиты
- В день биопленка вызов принимают свежий 96-луночный планшет и добавляют 100 мкл CRPMI, сравняться с комнатной температуры, в каждую лунку рядов Б к H. Чтобы избежать противоречивые результаты, используют 96-луночный планшет, который может содержать 200 мклсредств массовой информации, когда колки находятся внутри, и особенности скважины с размерами, аналогичными инициирующего биопленки пластины.
- Развести до 4-х тестируемых соединений по отдельности в 1,0 мл CRPMI до 2x желаемой конечной концентрации, с целью учета для окончательного разведения в шаге 2.7.
Примечание: Хорошей отправной точкой в 8 раз выше подавляющей концентрации планктонных клеток. - Добавить 200 мкл соединения 1 в лунках А1 до А3, соединение 2 в колодцах А4 до А6, соединение 3 в колодцах А7-А9 и соединения 4 в скважинах A10 до A12.
- Серийно разбавить тестируемых соединений с помощью многоканальной пипетки и передачи 100 мкл из ряда А до ряда В и перемешать.
- Таким образом, по-прежнему передавать 100 мкл скважины к скважине. Смешайте после каждой передачи и остановки в строке F.
- После смешивания, высылать по 100 мкл из ряда F в контейнер для отходов. Не передавать любую жидкость в строки G и H.
- Добавьте 100 мкл CRPMI в каждую лунку планшета с помощью многоканальной пипетки длядовести объем до 200 мкл. На рисунке 1 окончательной компоновки пластины.
3. биопленки вызов
- Добавьте 200 мкл фосфатно-буферного раствора (PBS) в свежую стерильную 96-луночного планшета, который показывает скважины с размерами, аналогичными инициирующего биопленки пластины.
- Удалите пластиковый пакет и парафиновую пленку из инкубированных инициации биопленки пластины.
- Поднимите крышку вертикально вверх. Избегайте контакта между колышками и пластиной дна, так как это может привести к повреждению биопленки. Держите нижнюю часть для последующего анализа OD 600 (см 3.8).
- Смывать планктонные клетки путем размещения Peg-крышку на пластину, содержащую PBS (со стадии 3.1). Погрузитесь колышки в течение 5 секунд, поднимите из PBS, и погрузите еще раз, соблюдая осторожность, чтобы не ударить колышки против сторон а.
- Поместите промытый Peg-крышку в вызов пластины. Избегать ненужного контакта между колышками и нижней пластиной, так как это приведет к повреждению биопленки приводит кпротиворечивые результаты.
- Уплотнение плита с парафиновой пленки и поместить в закрывающийся пластиковый пакет, как описано в шаге 1.10.
- Инкубируйте планшет без встряхивания в течение 24 ч при 37 ° С в атмосфере 5% СО 2 инкубаторе.
- Возьмите нижнюю часть инициации биопленки пластины из 3.3. Ресуспендируют бактерии в каждую лунку с помощью многоканальной пипетки и измерить OD 600 с помощью подходящего микропланшет - ридером , чтобы подтвердить рост происходит во всех скважинах , кроме контроля стерильности в строке H.
Определение 4. биопленки
- С помощью планшет-ридер, оснащенный инкубационной камере и способный принимать кинетические Измерение флюоресценции для обнаружения ресазурина преобразования. Настройка кинетического измерения флуоресценции 24 ч, используя 530 нм возбуждение и на 590 нм излучение.
- Установите температуру в камере до 37 ° С и имеют пластины чтения каждые 20 мин. Установите планшет-ридера для измерения от нижней части пластины в соответствии с обу изготовителяции.
- Приготовьте промывочный пластины путем добавления 200 мкл PBS с помощью многоканальной пипетки в стерильную 96-луночного планшета.
- Подготовка биопленки среды восстановления путем добавления 400 мкл 0,8 мг / мл маточного раствора резазурин к 20 мл CRPMI среды до конечной концентрации 16 мкг / мл резазурин.
Примечание: ресазурин является известным раздражителем кожи. Используйте лабораторный халат, Очкидлязащитыотбрызг и перчатки при работе. CRPMI как восстановление биопленки сред используют потому, что он обеспечивает самый низкий фоновый сигнал, но он может быть заменен на Мюллера-Хинтона сред, если это необходимо. - Добавьте 150 мкл среды биопленки восстановления с помощью многоканальной пипетки в каждую лунку свежей 96-луночного планшета.
- Передача вызов пластины из инкубатора в шкаф биологической безопасности и осторожно снимите полиэтиленовый мешок и уплотнительную пленку.
- Удалите Peg-крышку с провокационной пластины и смыть планктонные клетки в PBS, как описано в разделе 3.4. Держите нижнюю часть пластины вызов для последующего OD 600 анализис (см 4.10).
- После промывки поместите Peg-крышку в нижней части пластины, содержащей среду восстановления биопленки.
- Оберните сторону плиты с парафиновой пленки, стараясь не мешать нижней части периметра скважин. Сразу же после того, как оберточная пластину, поместите его на планшет-ридере и начать кинетическую чтение в течение периода 24 ч, инициируя ранее сделал ресазурин кинетического протокола с шага 4.1.
- Для количественной оценки роста планктонных клеток , которые могут или не могут возникнуть во время вызова, читать OD 600 всей нижней задачей пластины с помощью микро - ридере. Следуйте инструкциям, приведенным в пункте 3.8.
Примечание: Тщательно ресуспендирования содержимое каждой лунки, как клетки, проливающие от биопленки, как правило, растут в сгустки на дне колодца. Любые пузырьки внутри скважины будет сильно мешать OD 600 показаний и его следует избегать или удалены до чтения.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Анализ ресазурин достаточно чувствителен, чтобы надежно обнаружить очень мало жизнеспособных клеток, способных к репликации в среде без наркотиков после того, как вызов. В этой методологии мы определяем минимальную биопленки искоренении концентрацию как самую низкую концентрацию, при которой никакое преобразование ресазурин не рассматривается в течение 24 часов. Анализ ресазурин зависит от окислительных молекул, обнаруженных в метаболически активных клеток, которые трансформируют цвет кр...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Здесь мы описали модифицированный анализ биопленки для определения активности тестируемых ингибиторов на S. стафилококк биопленки сосредоточив внимание на метаболического состояния биопленки ассоциированных клеток. В то время как рекомендации в основном имитировали производитель описанный биопленки инициации и процедуры вызов, использование резазурин краситель для выявления и количественной оценки биопленки ассоциированных клеток, которые выживают 24 ч ингибитора вызов значительно упрощает рекомендуемую процеду...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Благодарим Сарана Купула за техническую помощь. Эта работа была частично поддержана грантом NIH R01-AI104952 для FW. Дальнейшая поддержка была оказана Центром исследований ВИЧ/СПИДа (CFAR) Университета Алабамы в Бирмингеме (UAB), программой, финансируемой NIH (P30 AI027767), которая стала возможной благодаря следующим институтам NIH: NIAID, NIMH, NIDA, NICHD, NHLDI, NIA.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Mueller-Hinton Medium | Oxoid | CM0405 | Следуйте рекомендациям производителя |
| RPMI-medium | Corning | 17-105-CV | |
| CRPMI | Ref 9 | RPMI-1640 средний хелекс в течение 1 часа со смолой Chelex 100 с последующим добавлением 10% нехелексированной RPMI-1640 | |
| Chelex 100 Смола | Bio Rad | 142-2822 | |
| MBEC-пластины | Innovotech | 19111 | |
| Резазурин Натриевая соль | Sigma | R7017 | 800 &; г/мл в воде DI Стерильная |
| платформа для встряхивания микропланшетов с фильтром | Heidolph Titramax 1000 | ||
| Cytation 3 Планшетный ридер | Biotek | ||
| Gen5 программное обеспечение | Biotek | Запись и анализ резазуриновой конверсии | |
| Neocuproine | Sigma N1501 | подготовить 10 мМ бульона в 100% этаноле, хранить при -80 °Ордм; C | |
| Медный купорос | Акрос Органикс | 7758-99-8 | приготовить в воде 100 мМ стокового раствора, хранить при 4 м°М; C |
| Cu-неокупроин | собственного производства | Получен путем смешивания равных молярностей неокупроина и сульфата меди. Смесь разводили в среде CRPMI до требуемой концентрации. | |
| Гентамицин | Сигма | G3632-1G |
Ссылки
- Bjarnsholt, T., Ciofu, O., Molin, S., Givskov, M., Hoiby, N. Applying insights from biofilm biology to drug development - can a new approach be developed. Nat Rev Drug Discov. 12, 791-808 (2013).
- Song, Z., et al. Prosthesis infections after orthopedic joint replacement: the possible role of bacterial biofilms. Orthop Rev (Pavia). 5, 65-71 (2013).
- Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases). Nat Rev Microbiol. 2, 95-108 (2004).
- Bordi, C., de Bentzmann, S. Hacking into bacterial biofilms: a new therapeutic challenge. Ann Intensive Care. 1, 19(2011).
- Fux, C. A., Shirtliff, M., Stoodley, P., Costerton, J. W. Can laboratory reference strains mirror 'real-world' pathogenesis? Trends Microbiol. 13, 58-63 (2005).
- Kwasny, S. M., Opperman, T. J. Static biofilm cultures of Gram-positive pathogens grown in a microtiter format used for anti-biofilm drug discovery. Curr Protoc Pharmacol. Chapter 13, Unit 13A 18(2010).
- Ceri, H., et al. The MBEC Assay System: multiple equivalent biofilms for antibiotic and biocide susceptibility testing. Methods Enzymol. 337, 377-385 (2001).
- Ceri, H., et al. The Calgary Biofilm Device: new technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms. J Clinical Microbiol. 37, 1771-1776 (1999).
- Baker, J., et al. Copper stress induces a global stress response in Staphylococcus aureus and represses sae and agr expression and biofilm formation. Appl Environ Microbiol. 76, 150-160 (2010).
- Haeili, M., et al. Copper complexation screen reveals compounds with potent antibiotic properties against methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother. 58, 3727-3736 (2014).
- O'Brien, J., Wilson, I., Orton, T., Pognan, F. Investigation of the Alamar Blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity. Eur J Biochem. 267, 5421-5426 (2000).
- Mah, T. F. Establishing the minimal bactericidal concentration of an antimicrobial agent for planktonic cells (MBC-P) and biofilm cells (MBC-B). J Vis Exp. (83), e50854(2014).
- Junker, L. M., Clardy, J. High-throughput screens for small-molecule inhibitors of Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Antimicrob Agents Chemother. 51, 3582-3590 (2007).
- Shah, D., et al. Persisters: a distinct physiological state of E. coli. BMC Microbiol. 6, 53(2006).
- Lewis, K. Riddle of biofilm resistance. Antimicrob Agents Chemother. 45, 999-1007 (2001).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
