Методическая статья

Индукция экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита у мышей и оценка болезни зависимого распределения иммунных клеток в различных тканях

24.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53933

⸱

8 мая 2016 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Clinical Pharmacology, Goethe University Hospital Frankfurt, 2Project Group for Translational Medicine & Pharmacology, Fraunhofer IME

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В этой рукописи описываются методы индукции и оценки экспериментальной модели аутоиммунного энцефаломиелита (ЭАЭ), а также оценка распределения иммунных клеток и уровней мРНК-цитокинов в лимфатических узлах, селезенке, крови и спинном мозге с использованием проточной цитометрии и количественной ПЦР, соответственно, на различных фазах заболевания.

Аннотация

Рассеянный склероз, как предполагают, воспалительное аутоиммунное заболевание, которое характеризуется образованием поражения центральной нервной системы (ЦНС), что приводит к когнитивной и двигательных нарушений. Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЭАЭ) является полезной животной моделью MS, так как он также характеризуется образованием поражением ЦНС, нарушение двигательной и также определяется аутоиммунных и воспалительных реакций. Одна из моделей EAE индуцируют с пептидом , полученным из миелин олигодендроцитов белка (MOG) 35-55 у мышей. Мыши EAE разработать прогрессивное течение заболевания. Этот курс делится на три фазы: доклинические фазы (день 0 - 9), начало заболевания (день 10 - 11) и острой фазы (день 12 - 14). МС и ЕАЕ индуцируются аутореактивных Т-клеток, которые проникают в ЦНС. Эти Т-клетки секретируют хемокины и цитокины, которые приводят к набору дополнительных иммунных клеток. Таким образом, распределение иммунных клеток в спинном мозге Dйти во время трех фаз заболевания была исследована. Для того, чтобы выделить момент времени болезни, при которой начинается активация / пролиферации / накопление Т-клеток, В-клеток и моноцитов, распределение иммунных клеток в лимфатических узлах, селезенке и крови также оценивали. Кроме того, уровни ряда цитокинов (IL-1 & beta;, IL-6, IL-23, TNF-alpha, IFN & gamma;) в трех фазах заболевания были определены, чтобы получить представление о воспалительных процессах заболевания. В заключение отметим, что данные обеспечивают обзор функционального профиля иммунных клеток в процессе EAE патологии.

Введение

Рассеянный склероз (РС) и соответствующая модель животного, экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЭАЭ), показывают, аутоиммунные изменения нейровоспаления в центральной нервной системе (ЦНС). Ранние активные поражения MS и EAE характеризуются наличием проникших иммунных клеток. Этиология МС остается неизвестным, но широко считается вовлечь разрушение миелина, опосредованного аутореактивных Т-клеток. Эти аутореактивные Т-клетки секретируют провоспалительные цитокины и хемокины, которые привлекают другие иммунные клетки, такие как В-клетки, моноциты и нейтрофилы из кровообращения. Моноциты дифференцируются в макрофаги. Интерферон гамма (IFN & gamma;), секретируемые аутореактивного Т-клетки поляризует макрофаги в текущем провоспалительных макрофагов. Провоспалительных макрофаги высвобождения цитокинов и активных форм кислорода, которые способствуют апоптозу в олигодендроциты. Смерть олигодендроцитов приводит к демиелинизации. Кроме того, В-клетки дифференцировались в рКлетки Lāsma и высвобождения аутоантитела против миелиновой оболочки, в конечном счете, приводит к ухудшению миелина. Потеря миелина приводит к деградации аксонов и нейронов и тем самым к образованию участков поражения в ЦНС , которые представляют собой основную характеристику МС 1. На периферии, Т-клетки и В-клетки активируются в лимфатических узлах, они пролиферируют в селезенке и мигрируют через циркуляцию в центральную нервную систему. Моноциты и нейтрофилы пролиферировать в костном мозге, а также мигрируют через циркуляцию в центральную нервную систему.

Лейкоцитов из костного мозга, селезенки и лимфатических узлов в кровь или из кровотока в ЦНС является многоэтапный процесс, который зависит от нескольких факторов, в том числе молекулярных взаимодействий между лейкоцитами и эндотелием, опосредованных хемокинов и рецепторов хемокинов. Производство хемокинов различными типами клеток могут быть вызваны во время иммунной reactioN цитокинами , такими как фактор некроза опухоли альфа (ФНО), IFN & gamma ; и интерлейкина-6 (ИЛ-6), который впоследствии вербует иммунные клетки к месту воспаления 2,3. Иммунные клетки представляют подмножество рецепторов хемокинов на их поверхности, в зависимости от типа клеток и пути миграции в воспаленном участке. Таким образом, CXCR2, CCR1 и CXCR1 экспрессируются на зрелых нейтрофилов в костном мозге и крови 4, и связывание его лигандов, CXCL2, CCL5 или CXCL6, соответственно, активирует нейтрофилы и способствует их адгезии к эндотелию и в дальнейшем, миграцию клеток в ткани 5-9. CCL2 и CCL20 привлекают моноциты и клетки Th1 / Th17 10, которые выражают CCR2 11 и CCR6 12, соответственно. CCR1 и CCR5, выраженное различными типами клеток, включая Т - клетки, моноциты и макрофаги 13, связывают CCL3, CCL5 и CCL7 и усиливает свою активность во время МС 14. CXCR3 экспрессируется на Т-клетках и связывает CCL9, CCL10 иCCL11 15.

Одной из основных стратегия лечения рассеянного склероза является истощение иммунных клеток или предотвращение инфильтрации клеток иммунной в ЦНС. Таким образом, блокада специфических рецепторов хемокинов было исследовано в EAE. Антагонизм или генетическое удаление CCR1 16, CCR2 17, CCR7 18 или CXCR2 19 уменьшает EAE патологии, в то время как антагонизм или генетического удаления CCR1 20, 20 CCR5 или CXCR3 21 не снижали патологии. Следовательно, экспрессия специфических рецепторов хемокинов на лейкоцитах является решающим для проникновения последнего в ЦНС и диктует ход EAE.

Истощение иммунных клеток является эффективной стратегией для лечения пациентов с рассеянным склерозом, так как внедренные иммунные клетки высвобождают цитокины, такие как TNF & alpha ; , IL-6 и IL-1 , который, в свою очередь, способствуют воспалительного процесса или деградацию нейронов 22. Кроме того, ав-реактивные Th1-клетки, релиз IFN & gamma; в свою очередь, стимулирует макрофаги к выпуску TNF-alpha, IL-1 & beta; и IL-23.

Эта рукопись описывает индукцию ЭАЭ, определения распределения иммунных клеток и уровни цитокинов (мРНК) в различных тканях у мышей EAE. Клетки были выделены в различные моменты времени в течение болезни, чтобы обеспечить обзор воспалительных процессов, которые в конце концов приводят к образованию поражений в ЦНС зависит от времени.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

ЭТИКА ЗАЯВЛЕНИЕ: Наши экспериментальные процедуры одобрены Комитетом по этике Regierungspräsidium Дармштадт (Германия) по и подтвердить к национальным и европейским нормам. Все усилия были сделаны, чтобы минимизировать страдания животных и уменьшить количество используемых животных.

1. EAE модель

  1. Индукция модели EAE
    1. Используйте 10- до 13-недельного возраста самка 129S4 мышей / SvJae × C57BL / 6 для индукции EAE.
    2. Дайте Мышей подкожную инъекцию, в верхней и нижней части спины, на энцефалитогенных МОГ 35 - 55 (миелин олигодендроцитов гликопротеин) пептида (200 мкг), эмульгированного в 200 мкл полной Freund`s адъювантной (CFA) , содержащей 400 мкг микобактерии туберкулеза.
      Примечание: В качестве отрицательного, немедицинские индуцирующего контроля мнимого, неполный адъювант Фрейнда , содержащий микобактерии туберкулеза, в том же объеме и по тому же маршруту, могут быть использованы.
    3. Thereafter, и снова 24 часа позже, дают Мышам внутрибрюшинно инъекцию коклюшного токсина (всего 0,2 мкг, разведенного в 200 мкл фосфатно-буферным солевым раствором PBS). Использование необработанных мышей в качестве контрольной группы, чтобы иметь возможность сравнить больное со здоровыми животными.
      Примечание: Кроме того , можно индуцировать EAE с 200 - 300 мкг MOG 35 - 55 пептида, 300 - 500 мкг микобактерий туберкулеза в CFA и 0,2 - 0,3 мкг коклюшного токсина в объеме 0,1 - 0,2 мл на инъекцию.
    4. Начиная через одну неделю после инъекции мышам ежедневно EXAMINE для клинических симптомов (см шаг 1.2.1)
      Примечание: В день начала болезни варьирует в различных экспериментах, но в условиях, в нашей лаборатории, это около 11-й день и, таким образом, здесь день 14 определяется как через 3 дня после начала заболевания. У всех мышей в данном исследовании разработаны клинические симптомы.
  2. Скоринг мышей
    1. Классифицировать клинические симптомы клинической оценки следующим образом:0) Нет признаков, 0,5) дистальный паралич хвоста, 1) полный паралич хвоста, 1,5) хромать хвост и мягкий слабость задних ног, 2) хромать хвост и сильная слабость задних ног, 2,5) хромать хвост и паралич одна задняя нога, 3) хромать хвост и паралич обеих задних конечностей, 3,5) паралич обеих задних конечностей и слабость одной передней конечности (мыши достигающие этот счет были подвергнуты эвтаназии, в соответствии с местными этическими нормами).

2. Получение одиночных клеток для анализа потока цитометрии

Примечание: Смесь антитело состоит из 1 мкл CD45-Vioblue, 2 мкл CD8-eFluor650, 0,5 мкл CD11b-eFluor605, 0,5 мкл F4 / 80-PE-Cy7, 1 мкл CD3-PE-CF594, CD4-V500, 0,5 мкл CD11c -AlexaFluor700, 1 мкл CD19-APC-H7 и 1 мкл Ly6G-APC-Cy7.

Примечание: Если вы берете кровь, лимфатические узлы, селезенка и спинного мозга, то процедура выглядит следующим образом: Мыши глубоко анестезию комбинацией isoflurane (2% в карбогена в минуту) и кетамина (100 мг / кг массы тела). Затем откройте грудную клетку, удалить кровь с внутрисердечной палкой и заливать мышей внутрисердечно с холодным PBS. Затем удалите лимфатические узлы с последующим селезенке и, наконец, спинной мозг. Если вам не нужно заливать мышей внутрисердечно затем усыпить мышей под глубокой анестезией вывих шеи.

  1. Выделение спленоцитов
    1. Анестезировать мышей с комбинацией изофлуран (2% в карбогена в минуту) и кетамина (100 мг / кг массы тела).
    2. Влажная зона надрез с 80% изопропилового спирта, чтобы избежать каких-либо загрязнений с волосками и открыть грудной клетки в продольном направлении, не прокалывая глубокие ткани, с помощью ножниц.
    3. Заливать мышей внутрисердечно с холодным PBS рН 7,0 23.
      Примечание: Селезенка расположена в левой верхней абдоминальной квадранте под грудной клеткой. Если только селезенку изучаться, этот орган может быть удален перед перфузией для того, чтобы Retaiп все типы клеток, представляющих интерес.
    4. Удалить селезенку и отрезать примерно 1/8 и взвесить его. Храните образец в PBS на льду.
    5. Сжать ткань селезенки через сито 70 мкм (помещенном над 50 мл трубки), с помощью плунжера 2 мл шприца.
    6. Промойте сетку с 5 мл PBS. Центрифуга при 1800 мкг в течение 3 мин. Ресуспендируют осадок в 500 мкл раствора лизиса.
      Примечание: На этом этапе, может быть необходимо, чтобы сделать рассчитывать дифференциальный клетка, если, позже, альтернативный метод анализа FACS используется, который не использует бусинки (смотри раздел 3).
    7. Инкубировать в течение 10 мин при комнатной температуре (RT) и добавляют 500 мкл PBS. Центрифуга в течение 6 мин при 650 мкг при комнатной температуре (RT).
    8. Повторите этап промывки с 500 мкл PBS. Жидкость над осадком сливают, ресуспендируют осадок клеток в 100 мкл 0,2% бычьего сывороточного альбумина (БСА) / PBS, добавляют 2 мкл Fc-рецептора-1 (FcRI) блокирующего буфера и инкубируют в течение 15 мин при комнатной температуре в темноте.
    9. Добавить 13 мклtibody смесь, инкубировать 15 минут при комнатной температуре в темноте, добавьте 500 мкл PBS и центрифуге в течение 6 мин при 650 х г при комнатной температуре. Удалите супернатант.
      Примечание: Процедура окрашивания производителя рекомендует единую стирку, но дополнительное снижение фонового окрашивания может быть достигнуто за счет необходимости повторение стадии отмывки больше один или два раза.
    10. Ресуспендируют осадок клеток в 500 мкл PBS (или, возможно, работает буфер для разделения белков, чтобы потенциально уменьшить клеток комков) и передать его в проточной цитометрии трубки. Сохранить клетки на льду.
  2. Выделение клеток лимфоузлов
    1. Анестезировать мышей с комбинацией изофлуран (2% в карбогена в минуту) и кетамина (100 мг / кг массы тела).
    2. Влажные Разрез область с 80% изопропилового спирта и открыть грудную клетку в продольном направлении с помощью ножниц. Заливать мышей внутрисердечно с холодным PBS рН 7,0 23.
    3. Для того, чтобы изолировать паховый лимфатический узел, осторожно снимите кожу в области Hiр и выбрать лимфатический узел тщательно из жировой ткани с щипцами. Взвесьте паховый лимфатический узел и хранить образцы в PBS на льду.
      Примечание: Мы использовали паховые лимфатические узлы в наших исследованиях , так как О'Коннор и др. обнаружили , что большое число активированных моноцитов, макрофагов, нейтрофилов и Т - клеток , были все присутствующие в паховых лимфатических узлах после индукции ЕАЕ 24.
    4. Сожмите лимфоузел через сито 70 мкм (расположенную над 50 мл трубки), используя поршень 2 мл шприца.
    5. Промойте сетку с 5 мл PBS. Центрифуга при 2400 мкг в течение 8 мин. Ресуспендируют осадок клеток в 100 мкл 0,2% BSA / PBS, добавляют 2 мкл FcRI блокирующего буфера и инкубируют в течение 15 мин при комнатной температуре в темноте.
    6. Добавить 13 мкл антител смеси, инкубировать 15 минут при комнатной температуре в темноте, добавить 500 мкл PBS и центрифуге в течение 6 мин при 650 х г при комнатной температуре.
    7. Жидкость над осадком сливают, ресуспендируют осадок клеток в 300 мкл PBS (или подходящего рабочего буфера) и передать егок проточной цитометрии трубки.
  3. Выделение клеток крови
    1. Добавить 50 мкл 20 мМ HEPES до 50 мкл крови (стабилизированный с ЭДТА) и добавляют 500 мкл раствора Lysing. Инкубировать в течение 10 мин при комнатной температуре и добавляют 500 мкл PBS. Центрифуга в течение 6 мин при 650 мкг при комнатной температуре. Удалите супернатант и повторите стадию промывки.
    2. Ресуспендируют осадок клеток в 100 мкл 0,2% BSA / PBS, добавляют 2 мкл FcRI блокирующего буфера и инкубируют в течение 15 мин при комнатной температуре в темноте.
    3. Добавить 13 мкл антител смеси, инкубировать 15 минут при комнатной температуре в темноте, добавить 500 мкл PBS и центрифуге в течение 6 мин при 650 х г при комнатной температуре. Жидкость над осадком сливают, ресуспендируют осадок клеток в 300 мкл PBS и передачи его в проточной цитометрии трубки.
  4. Выделение клеток спинного мозга
    1. Анестезировать мышей с комбинацией изофлуран (2% в карбогена в минуту) и кетамина (100 мг / кг массы тела).
    2. Влажная зона надрез с 80% изопропилового спирта и открыть грудной клетки в продольном направлениис помощью ножниц. Заливать мышей внутрисердечно с холодным PBS рН 7,0 23.
    3. Влажные области надреза на спине и сделать снова продольный разрез скальпелем и снимите кожу.
    4. Вырежьте поясничного отдела позвоночника (который иннервирует задние конечности) и промойте его с PBS заполненный шприц для извлечения спинного мозга. Вырез примерно 1/3 поясничном шнура, весить это и хранить образцы в PBS на льду.
    5. Центрифуга при 250 х г в течение 2 мин при температуре 4 ° С. Жидкость над осадком сливают, добавляют 500 мкл раствора открепления клеток и HBSS (1: 1). Добавить 3 мг / мл коллагеназы А и 1 ед / мл ДНКазы I, разрывать клетки путем неоднократного вверх и вниз пипеткой и инкубировать в течение 30 мин при встряхивании при 37 ° C при 400 оборотах в минуту.
      Примечание: При желании суспензию клеток может быть очищен от загрязняющего миелина и клеточных остатков центрифугирования в градиенте плотности, которые могут улучшить чувствительность проточной цитометрии измерения, таким образом, уменьшая фон автофлюоресценции А.Н.d число событий, которые должны быть приобретены (смотри раздел 3.5).
    6. Центрифуга при 250 х г в течение 2 мин при комнатной температуре. Жидкость над осадком сливают, ресуспендируют осадок в 1 мл 10% фетальной телячьей сыворотки (FCS) / минимальная поддерживающая среда Дульбекко (DMEM), и разрывать клетки снова многократным вверх и вниз пипеткой.
    7. Центрифуга при 250 х г в течение 2 мин при комнатной температуре. Повторите шаг стирки.
    8. Ресуспендируют осадок клеток в 1 мл PBS и сжимают спинной мозг через сито 70 мкм (помещенном над 50 мл трубки), используя поршень 2 мл шприца.
    9. Промойте сетку с 4 мл PBS. Центрифуга при 1,800 мкг в течение 3 мин при комнатной температуре. Жидкость над осадком сливают, ресуспендируют осадок клеток в 100 мкл 0,2% BSA / PBS, добавляют 2 мкл FcRI блокирующий реагент и инкубируют в течение 15 мин при комнатной температуре в темноте.
    10. Добавить 13 мкл антител смеси, инкубировать 15 минут при комнатной температуре в темноте, добавить 500 мкл PBS и центрифуге в течение 6 мин при 650 х г при комнатной температуре.
    11. Удалите супернатант, ресуспендируют Pelle клетокт в 500 мкл PBS (или подходящего рабочего буфера) и передать его на поточной цитометрии трубки.

3. Cytometric анализ потока

  1. Titrate все антитела заранее , чтобы определить оптимальные концентрации , как описано Olesch и др. 25.
  2. Использование антител захвата компенсации шарики для компенсации одноцветной для создания многоцветных матриц компенсации в соответствии с инструкциями изготовителя.
  3. Контроль калибровки прибора ежедневно, используя специальные шарики в соответствии с инструкциями изготовителя.
  4. Непосредственно перед проточной цитометрии измерения, добавьте 30 мкл проточной цитометрии абсолютного количества стандарта к клеткам (для изоляции смотри раздел 2.1, 2.2, 2.3, 2.4) для определения абсолютного количества клеток. Вместо того чтобы использовать подсчета бусинки клетки могут быть подсчитаны.
  5. Возьмите образцы (клетки из селезенки, лимфатических узлов и крови: 100000 событий, спинного мозга: 500000 событий) в проточном цитометрей анализ с помощью специального программного обеспечения цитометрии потока.
    1. Откройте программное обеспечение проточной цитометрии и добавьте FCS 3.0 файлы, нажав на кнопку "добавить образцы".
    2. Откройте файл добавлен двойным щелчком. Настройте каналы для х- и у-оси. Для выбора популяции клеток , представляющих интерес создать ворота (смотри рисунок 4).

4. Количественный ПЦР анализ

  1. Выделение мРНК и транскрипции в кДНК
    1. Извлечение мРНК из поясничного отдела спинного мозга (1/3), селезенка (1/8) и паховых лимфатических узлов с помощью фенол-хлороформом и осаждают этанолом 26.
      1. Для этого, гомогенизацию ткани в 1 мл гуанидин тиоцианат-фенол смеси инкубируют в течение 10 мин. Добавить 200 мкл хлороформа и инкубировать в течение 10 мин.
      2. После центрифугирования (18 000 мкг в течение 15 мин при температуре 4 ° С), промывать верхнюю водную фазу с помощью 500 мкл изопропанола и центрифугу (18.000 х г в течение 8 мин при 4° С).
      3. Промывают осадок 500 мкл этанола и после стадии центрифугирования (18 000 мкг в течение 5 мин при температуре 4 ° С), сухой осадок в вакуумной концентратором (5 мин при 30 ° С). После этого, ресуспендируют осадок в 30 мкл воды.
    2. Для извлечения мРНК из крови, центрифуга 500 мкл ЭДТА-стабилизированной крови (300 мкг в 10 мин 4 ° С).
      1. Возьмем поглощающее покрытие, содержащая белые клетки крови, и разбавить в 1 мл лизирующего раствора (150 мМ NH 4 Cl, 100 мМ NaHCO 3, 0,1 мМ Na-ЭДТА , рН 7,4).
      2. После 10 мин инкубации при комнатной температуре, центрифугировать клетки при 650 х г в течение 6 минут, а затем промыть в два раза с PBS.
      3. Извлечение мРНК из белых кровяных телец (WBCs) с использованием набора для экстракции РНК в соответствии с инструкциями изготовителя.
    3. Выполните синтез кДНК с использованием набора для синтеза кДНК в том числе случайных гексамерах в соответствии с инструкциями изготовителя. Используйте 200 нг мРНК для CdnСинтез.
  2. Количественная ПЦР
    1. Для количественной оценки количества специфической мРНК, используют 1 мкл кДНК, 1 мкМ вперед / назад праймера и флуоресцентный краситель ДНК связывания в соответствии с инструкциями изготовителя 27. Приведены в таблице 1 для последовательностей для наборов праймеров. Мера CT-значения IL-1, IL-6, IL-23, IFN & gamma;, TNF-alpha и PPIA (пептидил-пролил-изомеразы) с использованием системы количественного ПЦР.
    2. Для определения экспрессии мРНК по сравнению с помощью метода 27 сравнительный CT (пороговый цикл).
      1. Для этого, нормализовать CT-значения генов - мишеней на уровни экспрессии PPIA путем вычитания среднего CT-значение PPIA от гена - мишени, как описано в предыдущих исследованиях (Barthelmes и др. 28, Шиффманна и др. 29, Шиффманна и др. 30). Впоследствии, вычислить так называемые ΔΔCT-значения, с помощью которых, нормализовать значения & Delta; CТ-генов-мишеней от мышей EAE до уровня экспрессии генов-мишеней необработанных мышей, снова путем вычитания среднего & Delta; CТ-значение в необработанных мышей от & Delta; CТ-значения у мышей EAE.
      2. Для того, чтобы получить относительный уровень экспрессии мРНК гена - мишени, вычислить отношение с помощью следующей формулы: 2 - ΔΔct.
  3. Проверьте специфичность каждого праймера. Определить усиленную размер фрагмента , используя агарозном геле 2% 31. Размер фрагмента показана в таблице 1.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

На рисунке 1 приведен схематический обзор различных способов , описанных в этой статье. 1) Мыши получали инъекцию MOG 35-55 антигена и развить начальные клинические симптомы после 10,7 ± 0,3 дней 28. Представитель Конечно болезнь EAE мышей показано на рисунке 1. 2) Различные ткани (селезенка, лимфатические узлы, поясничного спинного мозга) и крови извлекаются из контрольных и ЕАЕ мышей в различные м...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Модель EAE , описанный здесь получил наибольшее внимание как модель MS и обычно используется при тестировании терапевтических стратегий для MS 32. Заболевание мыши обладает многими клинические и гистологические характеристики МС и обусловлена ​​индукцией аутоиммунитета к нейрональных антигенов. Сенсибилизация к миелиновых антигенов связано с гематоэнцефалического барьера дисфункции и, таким образом, инфильтрация клеток иммунной в ЦНС. Наши результаты показывают, что иммунные клетки увеличивают скоротечно в ли...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

MJP является консультантом Xellia и Leo Pharmaceuticals.

Благодарности

Эта работа была поддержана Исследовательской учебной группой Фонда Эльзы Крёнера-Фрезениуса (EKFS) Translational Research Innovation - Pharma (TRIP) и "Landesoffensive zur Entwicklung wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz (LOEWE), Schwerpunkt: Anwendungsorientierte Arzneimittelforschung" земли Гессен.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Система детектирования последовательностей ABI Prism 7500 Applied Biosystems, Остин, СШАколичественная ПЦР-система
AccutaseSigma Aldrich Мюнхен, ГерманияA6964раствор для отсоединения клеток
CD3-PE-CF594BD, Гейдельберг, Германия562286
CD4-V500BD, Гейдельберг, Германия560782
CD8-eFluor650 eBioscience, Франкфурт, Германия95-0081-42
CD11b-eFluor605eBioscience, Франкфурт, Германия93-0112-42
CD11c-AlexaFluor700BD, Гейдельберг, Германия560583
CD19-APC-H7 BD, Гейдельберг, Германия560143
CD45-Vioblue Miltenyi Biotec, Бергиш Гладбах, Германия130-092-910
CompBeadsBD, Гейдельберг, Германия552843компенсационные шарики
Коллагеназа АСигма Олдрич Мюнхен, ГерманияC0130
Цитометрический стандарт абсолютного числа Polyscience, Эппельхайм, ГерманияBLI-580-10
Настройка цитометра и отслеживание бусин BD, Гейдельберг, Германия642412
DNase ISigma Aldrich Munich, ГерманияD5025
EAE KitHooke Laboratories, Lawrence, СШАEK2110
F4/80-PE-Cy7 BioLegend, Фелл, Германия123114
набор для синтеза кДНК первой нити Thermo Scientific, Шверте, ГерманияK1612
Fc-рецептор-1 блокирующий буфер Miltenyi Biotec, Бергиш Гладбах, Германия130-092-575
Стандарт абсолютного подсчета проточных цитометрических данныхPolyscience, Эппельхайм, Германия580
Программное обеспечение FlowJo v10 Treestar, Ашленд, СШАпрограммное обеспечение для проточной цитометрии
LSRII/Fortessa BD, Гейдельберг, Германияпроточный цитометр
Ly6G-APC-Cy7 BD, Гейдельберг, Германия560600
Лизирующий раствор BD, Гейдельберг, Германия349202
Maxima SYBR Green Thermo Scientific, Шверте, ГерманияK0221флуоресцентный ДНК-связывающий краситель 
RNeasy Mini Kit Qiagen, Hilden, Германия74104Набор для экстракции РНК

Ссылки

  1. McFarland, H. F., Martin, R. Multiple sclerosis: a complicated picture of autoimmunity. Nat Immunol. 8, 913-919 (2007).
  2. Proudfoot, A. E. Chemokine receptors: multifaceted therapeutic targets. Nat Rev Immunol. 2, 106-115 (2002).
  3. Mihara, M., Hashizume, M., Yoshida, H., Suzuki, M., Shiina, M. IL-6/IL-6 receptor system and its role in physiological and pathological conditions. Clin Sci (Lond). 122, 143-159 (2012).
  4. Strydom, N., Rankin, S. M. Regulation of circulating neutrophil numbers under homeostasis and in disease. J Innate Immun. 5, 304-314 (2013).
  5. Kerstetter, A. E., Padovani-Claudio, D. A., Bai, L., Miller, R. H. Inhibition of CXCR2 signaling promotes recovery in models of multiple sclerosis. Exp Neurol. 220, 44-56 (2009).
  6. Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nat Rev Immunol. 13, 159-175 (2013).
  7. Fan, X., et al. Murine CXCR1 is a functional receptor for GCP-2/CXCL6 and interleukin-8/CXCL8. J Biol Chem. 282, 11658-11666 (2007).
  8. Hartl, D., et al. Infiltrated neutrophils acquire novel chemokine receptor expression and chemokine responsiveness in chronic inflammatory lung diseases. J Immunol. 181, 8053-8067 (2008).
  9. Barcelos, L. S., et al. Role of the chemokines CCL3/MIP-1 alpha and CCL5/RANTES in sponge-induced inflammatory angiogenesis in mice. Microvasc Res. 78, 148-154 (2009).
  10. Wojkowska, D. W., Szpakowski, P., Ksiazek-Winiarek, D., Leszczynski, M., Glabinski, A. Interactions between neutrophils, Th17 cells, and chemokines during the initiation of experimental model of multiple sclerosis. Mediators Inflamm. , 590409(2014).
  11. Bose, S., Cho, J. Role of chemokine CCL2 and its receptor CCR2 in neurodegenerative diseases. Arch Pharm Res. 36, 1039-1050 (2013).
  12. Mony, J. T., Khorooshi, R., Owens, T. Chemokine receptor expression by inflammatory T cells in EAE. Front Cell Neurosci. 8, 187(2014).
  13. Katschke, K. J. Jr, et al. Differential expression of chemokine receptors on peripheral blood, synovial fluid, and synovial tissue monocytes/macrophages in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 44, 1022-1032 (2001).
  14. Trebst, C., et al. CCR1+/CCR5+ mononuclear phagocytes accumulate in the central nervous system of patients with multiple sclerosis. Am J Pathol. 159, 1701-1710 (2001).
  15. Karin, N., Wildbaum, G. The role of chemokines in adjusting the balance between CD4+ effector T cell subsets and FOXp3-negative regulatory T cells. Int Immunopharmacol. , (2015).
  16. Rottman, J. B., et al. Leukocyte recruitment during onset of experimental allergic encephalomyelitis is CCR1 dependent. Eur J Immunol. 30, 2372-2377 (2000).
  17. Izikson, L., Klein, R. S., Charo, I. F., Weiner, H. L., Luster, A. D. Resistance to experimental autoimmune encephalomyelitis in mice lacking the CC chemokine receptor (CCR)2. J Exp Med. 192, 1075-1080 (2000).
  18. Kuwabara, T., et al. CCR7 ligands are required for development of experimental autoimmune encephalomyelitis through generating IL-23-dependent Th17 cells. J Immunol. 183, 2513-2521 (2009).
  19. Liu, L., et al. Myelin repair is accelerated by inactivating CXCR2 on nonhematopoietic cells. J Neurosci. 30, 9074-9083 (2010).
  20. Matsui, M., et al. Treatment of experimental autoimmune encephalomyelitis with the chemokine receptor antagonist Met-RANTES. J Neuroimmunol. 128, 16-22 (2002).
  21. Liu, L., et al. Severe disease, unaltered leukocyte migration, and reduced IFN-gamma production in CXCR3-/- mice with experimental autoimmune encephalomyelitis. J Immunol. 176, 4399-4409 (2006).
  22. Lee, M., Suk, K., Kang, Y., McGeer, E., McGeer, P. L. Neurotoxic factors released by stimulated human monocytes and THP-1 cells. Brain Res. 1400, 99-111 (2011).
  23. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. , (2012).
  24. O'Connor, R. A., et al. Adjuvant immunotherapy of experimental autoimmune encephalomyelitis: immature myeloid cells expressing CXCL10 and CXCL16 attract CXCR3+CXCR6+ and myelin-specific T cells to the draining lymph nodes rather than the central nervous system. J Immunol. 188, 2093-2101 (2012).
  25. Olesch, C., et al. MPGES-1-derived PGE2 suppresses CD80 expression on tumor-associated phagocytes to inhibit anti-tumor immune responses in breast cancer. Oncotarget. 6, 10284-10296 (2015).
  26. Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem. 162, 156-159 (1987).
  27. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25, 402-408 (2001).
  28. Barthelmes, J., et al. Lack of ceramide synthase 2 suppresses the development of experimental autoimmune encephalomyelitis by impairing the migratory capacity of neutrophils. Brain Behav Immun. 46, 280-292 (2015).
  29. Schiffmann, S., et al. Ceramide synthase 6 plays a critical role in the development of experimental autoimmune encephalomyelitis. J Immunol. 188, 5723-5733 (2012).
  30. Schiffmann, S., et al. PGE2/EP4 signaling in peripheral immune cells promotes development of experimental autoimmune encephalomyelitis. Biochem Pharmacol. 87, 625-635 (2014).
  31. Giglio, S., Monis, P. T., Saint, C. P. Demonstration of preferential binding of SYBR Green I to specific DNA fragments in real-time multiplex PCR. Nucleic Acids Res. 31, e136(2003).
  32. Vesterinen, H. M., et al. Improving the translational hit of experimental treatments in multiple sclerosis. Mult Scler. 16, 1044-1055 (2010).
  33. 't Hart, B. A., Gran, B., Weissert, R. EAE: imperfect but useful models of multiple sclerosis. Trends Mol Med. 17, 119-125 (2011).
  34. Serada, S., et al. IL-6 blockade inhibits the induction of myelin antigen-specific Th17 cells and Th1 cells in experimental autoimmune encephalomyelitis. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 9041-9046 (2008).
  35. Berer, K., et al. Commensal microbiota and myelin autoantigen cooperate to trigger autoimmune demyelination. Nature. 479, 538-541 (2011).
  36. Shetty, A., et al. Immunodominant T-cell epitopes of MOG reside in its transmembrane and cytoplasmic domains in EAE. Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 1, 22-22 (2014).
  37. Schmitz, K., et al. R-flurbiprofen attenuates experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. EMBO Mol Med. 6, 1398-1422 (2014).
  38. Procaccini, C., De Rosa, V., Pucino, V., Formisano, L., Matarese, G. Animal models of Multiple Sclerosis. Eur J Pharmacol. 759, 182-191 (2015).
  39. Pollinger, B., et al. Spontaneous relapsing-remitting EAE in the SJL/J mouse: MOG-reactive transgenic T cells recruit endogenous MOG-specific B cells. J Exp Med. 206, 1303-1316 (2009).
  40. Rodriguez, M., Oleszak, E., Leibowitz, J. Theiler's murine encephalomyelitis: a model of demyelination and persistence of virus. Crit Rev Immunol. 7, 325-365 (1987).
  41. Lipton, H. L. Theiler's virus infection in mice: an unusual biphasic disease process leading to demyelination. Infect Immun. 11, 1147-1155 (1975).
  42. Matsushima, G. K., Morell, P. The neurotoxicant, cuprizone, as a model to study demyelination and remyelination in the central nervous system. Brain Pathol. 11, 107-116 (2001).
  43. El-behi, M., Rostami, A., Ciric, B. Current views on the roles of Th1 and Th17 cells in experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neuroimmune Pharmacol. 5, 189-197 (2010).
  44. Mann, M. K., Ray, A., Basu, S., Karp, C. L., Dittel, B. N. Pathogenic and regulatory roles for B cells in experimental autoimmune encephalomyelitis. Autoimmunity. 45, 388-399 (2012).
  45. Lassmann, H., Bruck, W., Lucchinetti, C. F. The immunopathology of multiple sclerosis: an overview. Brain Pathol. 17, 210-218 (2007).
  46. Simmons, S. B., Pierson, E. R., Lee, S. Y., Goverman, J. M. Modeling the heterogeneity of multiple sclerosis in animals. Trends Immunol. 34, 410-422 (2013).
  47. Praet, J., Guglielmetti, C., Berneman, Z., Vander Linden, A., Ponsaerts, P. Cellular and molecular neuropathology of the cuprizone mouse model: clinical relevance for multiple sclerosis. Neurosci Biobehav Rev. 47, 485-505 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи