Методическая статья

Процедура оценки эффективности флокулянтов для удаления дисперсных частиц из растительных экстрактов

8.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53940

⸱

9 апреля 2016 г.

1Institute for Molecular Biology and Applied Ecology IME, Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e. V., 2Institute for Molecular Biotechnology, RWTH Aachen University

В этой статье

Краткое содержание

Представленная здесь процедура планирования экспериментов позволяет оценить различные флокулянты с точки зрения их способности агрегировать дисперсные частицы в растительных экстрактах, тем самым снижая мутность и затраты на последующую обработку.

Аннотация

Растения важны для людей не только потому, что они обеспечивают такие товары, как пища, корма и сырье, но и все чаще потому, что их можно использовать в качестве производственных платформ для продуктов с добавленной стоимостью, таких как биофармацевтические препараты. В обоих случаях может потребоваться осветление жидких растительных экстрактов для удаления твердых частиц. Оптимальное осветление снижает затраты на фильтрацию и центрифугирование за счет увеличения производительности и долговечности. Это может быть достигнуто путем введения заряженных полимеров, известных как флокулянты, которые сшивают дисперсные частицы для облегчения разделения твердой и жидкой фаз. Не существует механистических моделей флокуляции для сложных смесей, таких как растительные экстракты, поэтому вместо них используются эмпирические модели. В этой статье описывается процедура планирования экспериментов, которая позволяет проводить быстрый скрининг различных флокулянтов, оптимизируя осветление растительных экстрактов и значительно снижая мутность. Полученные прогностические модели позволяют идентифицировать устойчивые технологические условия и наборы полимеров с комплементарными свойствами, например, эффективную флокуляцию в экстрактах с определенной проводимостью. Представленные результаты для экстрактов листьев табака могут быть легко адаптированы к другим видам растений или тканям и, таким образом, будут способствовать разработке более экономически эффективных последующих процессов для сырьевых товаров и фармацевтических препаратов растительного происхождения.

Введение

Растения широко используются для производства продовольственных товаров , таких как фруктовые соки, но они также могут быть разработаны в качестве платформы для производства более ценных продуктов биофармацевтических 1-3. В обоих случаях, вниз по течению обработки (DSP) часто начинается с извлечения жидкости из тканей , таких как листья или плоды, а затем разъяснении частиц нагруженные экстрактов 4,5. Для изготовления биофармацевтических, стоимость DSP может составлять до 80% от общих расходов 6,7 производства , и это отчасти отражает высокий частиц шихты , присутствующий в экстрактах , полученных с помощью подрывных методов , таких как лезвия на основе усреднении 8,9 , Несмотря на то, рациональный отбор фильтрующих слоев в соответствии с распределением частиц по размерам в экстракте может увеличить пропускную способность фильтра и снизить затраты 10,11, улучшение никогда не может превышать потолок абсолютной мощности , определенной по числу частиц , которые должны быть сохранены вединица площади фильтра для достижения разъяснения.

Потолок может быть поднята , если меньше частиц достигают поверхности лучших фильтров в фильтрационной поезде, и это может быть достигнуто , если диспергированные частицы смешивают с полимерами , известными в качестве флокулянтов , которые способствуют агрегации с образованием больших хлопьев 12. Такие Хлопья могут быть сохранены дальше вверх по течению от более грубых и менее дорогие фильтры мешка, уменьшая нагрузку частиц, достигающего тоньше и более дорогие глубины фильтров. Полимеры должны иметь профили безопасности , подходящие для их применения, например , для биофармацевтических они должны быть совместимы с надлежащей производственной практики (GMP), и , как правило , они должны иметь молекулярную массу> 100 кДа и может либо быть нейтральным или заряженный 13. В то время как нейтральные флокулянты в общем действуют сшивкой дисперсные частицы , что приводит к их агрегации и образование флокул диаметром> 1 мм 11, заряженные полимеры нейтрализуют заряд Dispersed частицы, уменьшая их растворимость и , таким образом , вызывая осаждение 14.

Флокуляции может быть улучшена за счет регулировки таких параметров, как буфера рН или проводимость, а также от типа полимера или концентрации, чтобы соответствовать свойствам экстракта 15,16. Что касается табачных экстрактов , предварительно обработанных с 0,5-5,0 г L -1 полиэтиленимина (PEI), большее , чем 2-кратное увеличение емкости глубинного фильтра сообщалось в процессе опытно-промышленные 100-L. Стоимость этого полимера меньше , чем € 10 кг -1 поэтому его введение в процесс привело к экономии около € 6000 для фильтров и расходных материалов на партию 16 или даже больше , когда в сочетании с целлюлозой на основе фильтрующих средств 17. Тем не менее , прогностические модели должны оценивать априорных экономические выгоды от флокулянтов , потому что их включение может потребовать шаги трюме 15-30 мин 16,18, в результате дальнейших инвестиционных затрат на хранениетанки. Тем не менее, в настоящее время нет механистические модели доступны, которые могут предсказать исход таких экспериментов из-за сложного характера флокуляции. Таким образом, подход 19 более соответствующие эксперименты дизайн-оф-(DOE) был разработан , как описано в этой статье. Протокол общей процедуре МЭ Недавно были опубликованы 20.

Небольшие устройства теперь доступны для высокопроизводительного скрининга условий флокуляции 21. Тем не менее, эти устройства не могут реально имитировать условия во время флокуляции экстрактов растений, так как размеры реакционного сосуда (~ 7 мм для лунок на 96-луночный планшет) и частиц или хлопьев может быть меньше, чем на порядок друг от друга. Это может повлиять на смешивание модели и, следовательно, предсказательная сила модели. Кроме того, это может быть трудно сократить масштабы процессов с участием осадков из-за нелинейных изменений в поведении и смешивания осадка ГНА22 ность. Поэтому в данной статье излагается стендовая масштабную систему скрининга с пропускной способностью 50-75 образцов в день, что дает результаты, которые масштабируются от исходного 20 мл реакционного объема в процессе 16 опытно-промышленные 100 л. В сочетании с подходом DOE, это позволяет прогностические модели, которые будут использоваться для оптимизации процесса и документации в рамках концепции качества по-дизайну.

Метод , описанный ниже , может также быть адаптирован к биофармацевтических , производимых в процессе культивирования клеток на основе, где флокулянт также рассматриваются в качестве инструмента 23 экономии. Он также может быть использован для моделирования осаждения белков - мишеней из неочищенного экстракта в качестве составной части стратегии очистки, как показано на бета-глюкуронидазы , полученного в канолы, кукурузы и сои 24,25. Подробное описание флокулянтов свойств можно найти в других 16,26 и важно , чтобы гарантировать , что полимер концентрations либо нетоксичный или ниже вредных уровней в конечном продукте 11.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Разработка адекватной экспериментальной стратегии

  1. Определение параметров окружающей среды и процессов , которые имеют отношение к процедуре флокуляции быть установлены или оптимизированы, т.е. какие факторы оказывают наиболее сильное влияние на флокуляции. Как правило, существует несколько таких параметров , так подход НООо недавно описанным 20 необходимо из - за отсутствия механистических моделей.
    1. Выбор параметров (факторов) на основе литературных данных 12, предварительных знаний и опыта работы с системой. Типичные факторы включают буфера рН, буфера проводимость, время инкубации и температуры, а также типа полимера и концентрации 15,16,27.
    2. Используйте те же ссылки (см 1.1), чтобы определить значимые диапазоны для каждого числового фактора и уровни для категориальных факторов.
    3. Определить экспериментальные результаты (реакции), чтобы контролировать и использовать для оценки эффективности флокуляции. В зависимости от системы, этаможет быть фильтрат или надосадочную мутность, скорость осаждения, совокупный размер или емкость последующего фильтра 16,23,28-30.
    4. Убедитесь, что анализы, используемые для измерения ответов количественные, надежные и воспроизводимые / воспроизводимые таким образом, чтобы полученные данные высокого качества могут быть дополнены экспериментов, проведенных позднее этого срока или другим оператором.
  2. Выберите тип DoE устраивающего количество факторов необходимо исследовать и степень знаний уже накопилось о системе. Используйте имеющуюся литературу , чтобы определить подходящий тип DoE 20.
    1. Выберите дизайн скрининга, если имеется мало информации о системе флокуляции необходимо исследовать, большое количество параметров должны быть экранированы или мало известно о значимых диапазонах для параметров. Типовые конструкции скрининга являются полными и дробные факторные планы. Включают центральные точки в конструкции , если , как ожидается , параметры , чтобы иметь нелинейную воздействие, например , Насыщение выше некоторого порогового значения 19.
    2. Выбор методологии поверхности отклика (RSM), например , центральный композитный дизайн (CCD) 31 или оптимальная 32,33, если только несколько факторов , с хорошо известными диапазонах должны быть охарактеризованы точно.
  3. Настройка УОО с соответствующим программным обеспечением, что обеспечивает априорных критериев качества , таких как доля пространства дизайна выполнены 20.

2. Подготовка экспериментов флокуляции

figure-protocol-1
Рисунок 1: растительный экстракт флокуляции рабочий процесс: масштабный процесс (слева) и шкала настольном (справа). После экстракции белка водных буферах, дисперсные частицы остатков клеток агрегируются путем добавления флокулянта. Агрегаты затем удаляют каскадом мешка и глубинной фильтрации и способности этихфильтры вместе с фильтратом мути может быть использован непосредственно для измерения эффективности флокуляции.

  1. Разработка общей экспериментальной работы Flow (Рисунок 1).
    1. С помощью устройства для экстракции , что приводит к такой же распределение частиц по размерам ожидаемой (или уже отмечалось) в конечном масштабе приложения, например , специализированной гомогенизатора. Если это возможно, разработать Масштабное вниз модель экстрактора , как описано для гомогенизации листьев табака 10.
    2. Определить объемы экстракта, используемые в процессе флокуляции экспериментов (здесь 20 мл). Выберите том , который позволяет репрезентативное количество частиц , чтобы присутствовать в реакционном сосуде, например , эксперименты флокуляции в 20 аликвоты дали воспроизводимые и масштабируемые результаты для табачных экстрактов , содержащих ~ 7% [Вт / v] твердых частиц 34 и размерами частиц ~ 0,5 мкм до ~ 3 мм 16.
    3. Дизайн все операции мониторинга и пост-флокуляции, так что йEY репрезентативны конечного масштаба приложения, например , выберите фильтры с таким же поведением удержания частиц , как те , которые используются в производственном масштабе.
  2. Выращивают растений, из которых экстракты будут получены.
    1. Используйте ту же самую линию растений, здесь Табак обыкновенный резюме. Petit Havana SR1, а также условия культивирования , которые будут использоваться в процессе производства , как описано выше 33.
    2. Если другие запасы корма будут обработаны, готовить эти запасы кормов , так что они являются репрезентативными для окончательного масштаба применения, например , использовать аутентичные буферы, принимать во внимание любые шаги разбавления во время процесса и придерживаться ожидаемого рН и проводимости, здесь рН 7,5 и проводимость 30 мСм см -1.
  3. Подготовить Фильтрационные Utilities, мутность-устройства контроля и отбора проб судов.
    1. Вырезать фильтрующие материалы с требуемыми размерами, здесь 15 х 15 см 2, если они не готовы к наме модули. Убедитесь, что все устройства мониторинга и анализа функциональных и маркировать все пробирки с образцами.
    2. Даже если эти простые задачи, подготовить эти вещи во времени, чтобы гарантировать, что они не будут вызывать перерывы во время реальных экспериментов флокуляции. Во избежание задержек, поскольку они могут повлиять на результаты, учитывая, что флокуляции представляет собой процесс, зависящий от времени.
  4. Подготовка Флокулянт маточных растворов. ВНИМАНИЕ: Используйте соответствующие средства индивидуальной защиты при работе с флокулянтов, например , перчатки. Материалы могут быть опасными (знаки опасности в соответствии с Europe UE 67/548 / CEE, 1999/45 / CE включают N, Xi или Xn). Избегайте пыли и ссылаться на данные о безопасности материала. Работа под вытяжкой.
    1. Выберите концентрацию запаса для каждого флокулянта, здесь 80,0 г L -1 для двух флокулянтов PEI , которые были использованы. Выбор концентрации как можно выше, чтобы избежать разведения проб при добавлении флокулянта, что приведет к уменьшению Concentra частицции и, таким образом, влияют на эффективность флокуляции.
    2. Счет для любого предварительного разведения , который отражает формулировку производителя полимера, например , если полимер уже поставляется в виде водного 50% [вес / объем] раствора. [Вес / объем] были найдены Флокулянта Маточные растворы 4-8%, чтобы быть наиболее подходящим до сих пор.
    3. Принимая во внимание пункты, описанные выше, убедитесь, что концентрация флокулянта не создает чрезвычайно вязкий раствор, который ингибирует пипетирования, потенциально может привести к ошибкам, так как конечная концентрация флокулянта не настроена правильно.
    4. Используйте ту же концентрацию запаса для всех флокулянтов, если это возможно, потому что это облегчит настройку схемы пипетирования (2.5), таким образом, снижая вероятность возникновения ошибок.
    5. Доводят рН и проводимость каждого флокулянта исходного раствора в соответствии с условиями экстрактов, здесь рН 4-10 и проводимость 15-55 мСм см -1. Подготовьте отдельные акции для одного флокулянта, если труды, чем один набор рН и / или электропроводности на условиях проверяется на наличие этого полимера.
    6. Приготовить флокулянта растворы свеже, не более чем за 48 часов до использования. Несмотря на то, флокуляции может быть индуцирована с полимерными запасов, хранившихся в течение более 4 недель, эффективность может снижаться из-за гидролиза полимера при высоких или низких значениях рН. Обратитесь к документации производителя для получения более подробной информации.
    7. Убедитесь , что параметры , выбранные для DoE можно отрегулировать точно для каждого образца во время эксперимента, например , обеспечить наличие ванны нагрева / охлаждения , доступные для регулировки температуры инкубации, здесь 4 ° C, 20 ° C и 37 ° C. Если смешивание во время флокуляции является частью эксперимента, убедитесь, что устройство смешивания является представителем конечного масштаба применения с точки зрения критических параметров, таких как потребляемая мощность.
  5. Преобразование УОО расписание в пипетирующие схеме.
    1. Преобразование различных концентраций флокулянта быть TESTed в объемах исходного раствора, которые будут добавлены к образцам экстракта: разделить конечные концентрации флокулянт концентрацией акций и умножить на объем образца, используемого в экспериментах флокуляции. Определить наибольший полученный конечный объем, например , если 20 мл образца смешивают с максимумом 2 мл флокулянта исходного раствора это будет 22 мл.
    2. Вычислить объемы буфера , необходимого для поддержания того же конечного объема во всех аликвот флокуляции на основе наибольшего объема флокулянта запаса следует добавить, например , если 0,75 мл флокулянта запаса должны быть добавлены к пробе затем 1,25 мл буфера требуется для поддержания Конечный объем пробы 22 мл (2.5.1).
    3. Суммируем объемы исходного раствора флокулянта для каждого полимера и флокуляции условием для расчета абсолютных объемов исходного раствора, которые необходимы для НОО.
  6. Урожай табака Листья и приготовления экстракта.
    1. Снимите верхнюю шесть LeaVES (или столько , сколько указано в инструкции процесса) от табачных растений соответствующего возраста, например , 6 недель, и передача соответствующего устройства для экстракции , такие как гомогенизатор или винтового пресса.
    2. Добавьте три тома буфера для экстракции на грамм биомассы, например , 300 мл на 100 г, и смесь в течение 8 мин.
    3. Подготовить отдельные выдержки с соответствующими буферами, если она отличается рН и / или проводимостей проходят испытания. Вот, это включает в себя гомогенизацию растительного материала в течение 3 х 30 сек в блендере или соковыжималке 34.
    4. В качестве альтернативы, приготовления экстракта таким образом, что является представителем исследуемого процесса.
  7. Алиготе извлечение и буфера.
    1. Вручную и тщательно перемешайте экстракт в течение всей процедуры, чтобы обеспечить образцы однородны с равномерным распределением частиц.
    2. Точно распределить экстракт среди предварительно меченных реакционных труб путем декантации,здесь 20 мл в каждом сосуде. Само-стоя 50 мл трубки упрощают обработку и идеально подходят для 20 образцов мл.
    3. Добавить объем каждого экстракционного буфера, необходимого для поддержания фиксированного конечного объема для каждой отдельной реакционной трубке с использованием подходящей пипетки.

3. флоккулят растительных экстрактов с различными полимерами

  1. Пипетировать необходимый объем флокулянта исходного раствора, здесь 0,1-2,0 мл, к образцам последовательно, как это указано в рандомизированном порядке выполнения НОО. Тщательно перемешать каждую пробу сразу после добавления флокулянта под воздействием интенсивного руководства встряхивания в течение ровно 20 с.
    1. При необходимости отрегулировать время встряхивания для других кормовых запасов, чтобы обеспечить тщательное смешивание, но строго обеспечить постоянное время смешивания для всех образцов. Имейте в виду, что длительное смешивание может привести к необратимому нарушению хлопьями и непоследовательно применили силу при сотрясении может исказить результаты флокуляции.
  2. Необязательно: Измените процедуру, описанную выше, для одновременного применения двух или более флокулянтов.
    1. Вариант 1: Вместо одного полимера добавляют смесь из двух или более флокулянтов, здесь PEI и хитозана. Используйте флокулянта комбинации, определенные в НОО. Включать соотношение и абсолютные концентрации полимеров в качестве индивидуальных параметров во время установки DoE (1.1).
    2. Вариант 2: Добавление двух или более полимеров последовательно к экстракту.
      1. Используйте отдельные концентрации полимера, их тип и время инкубации между каждым добавлением к экстракту, в качестве дополнительных факторов в процессе установки НОО.
      2. Также используют этот подход, чтобы проверить, является ли повторное добавление одного полимера может улучшить флокуляции. Используйте ступенчатое добавление для имитации медленное добавление флокулянта, например , четыре этапа, каждый из которых добавляет 0,25 мл 80 г л -1 флокулянта запас до 20 мл объема в течение 4 мин может имитировать добавление флокулянта сскорость потока 0,25 мл · мин -1.
      3. Во всех случаях, определить новый максимальный конечный объем выборки для этой установки путем добавления максимальных объемов всех флокулянтов к объему образца, вот еще 22 мл, и повторно вычислить необходимые объемы флокулянта маточных растворов и буферов для регулировки громкости при необходимости.
  3. Инкубируйте образцы в течение времени, определенных в НОО, как правило, 3-30 мин, чтобы обеспечить образование хлопьев. Убедитесь , что все другие условия инкубации, например , температуры, устанавливаются в соответствии с НОО.
  4. Обратите внимание и формирование документов флок. Записывают ход образования флокул по мере необходимости, например , в качестве мм осаждения таких в минуту путем измерения высоты оседлых твердых частиц. При необходимости, продлить срок флокуляции в течение длительного периода времени, например в течение ночи.
  5. Фильтр экстракт флокулированная.
    1. Используйте фильтрующие материалы, подготовленные ранее (2.3) для уточнения флоккулированной экстракта после соответствующейВремя инкубации путем декантации флокулированной образцов через фильтрующий материал и в чистый сосуд или реакционной трубки.
      1. Не ресуспендируйте осажденных хлопь перед фильтрацией и применять экстракт с со скоростью ~ 300 мл · мин -1 до фильтра, что соответствует 3-4 сек в течение 20 мл образца.
      2. Подтверждения эффективности стадии фильтрации , если иной материал используется в стендовых экспериментах по сравнению с конечным процессом с точки зрения удержания частиц, например , путем измерения распределения частиц по размерам в обоих типов образцов 11.
    2. Анализ фильтрата с точки зрения мутности и / или распределения частиц по размерам в соответствии с требованиями с использованием соответствующих устройств, например, мутномере.
    3. Дополнительно: повторить анализ после продолжительного времени инкубации, например , 12-24 ч, чтобы исследовать образование или реформацию нестабильных хлопьями.
  6. Анализа образцов в терминах Prе определенные ответы (1.1.3).
    1. Возьмите образцы из фильтратов и анализировать их для дополнительных параметров реакции, например , концентрации различных белков - мишеней или ценных продуктов.
    2. Дополнительно: Анализ ретентата (в основном твердых веществ) для одних и тех же параметров, чтобы закрыть массовый баланс процесса. В частности, количественно влияние флокулянтов на жидком восстановление путем сравнения твердых веществ масса оставшихся после того, как образцы обрабатывают или не обрабатывают флокулянта.
  7. Подтвердите качество данных и передачи результатов в программу НОО.
    1. Посмотрите на экстремальные значения в собранных данных ответа, например , неожиданно высокие значения.
    2. Убедитесь в том, что все данные ответа правильно выровнены с соответствующими условиями эксперимента.
    3. Передача результатов в программное обеспечение НОО и убедитесь, что стандартные и рандомизированные заказы прогона не перепутать.

4. ОценкаУОО

  1. С помощью встроенных средств анализа данных программного обеспечения МЭ разработать прогностическую модель , как описано выше 20.
    1. Выберите правильный режим преобразования данных при необходимости для облегчения построения модели, здесь log 10. Соотношение больше , чем 10 для самого большого по сравнению наименьшим значением отклика указывает на то, что преобразование данных может потребоваться. Определить наиболее подходящее преобразование , используя соответствующие статистические инструменты, например, сюжет Box-Cox 35.
    2. Выбрали базовую модель , которая (я) соответствует к выбранному DoE (1.2) и (II) согласуется с предыдущими знаниями о рассматриваемой системе , основанной на анализе отклонений (ANOVA) инструментов программного обеспечения Doe, например, полином второго порядка часто лучше подходит для наблюдаемого эффекта времени инкубации, чем полином первого порядка.
    3. Удалить незначительные факторы модели, например , р> 0,05, или фактор взаимодействия итеративно, отменив их,льтате уменьшая сложность модели и увеличивая его предсказательной силы.
    4. Подтвердите качество модели путем сравнения R 2, с доведением R 2 и предсказал R 2 вместе с нормальной вероятностью участке Стьюдентизированная остатков, невязок-против-бега, предсказывал-против-фактическое и Box-Cox участки 36. Все значения R 2 должны быть в пределах 0,2 диапазона.
    5. Убедитесь , что окончательная модель согласуется с основными предположениями физики и термодинамики, например , никаких отрицательных концентраций не прогнозируется.
  2. Используйте модель для прогнозирования условий, которые являются наиболее благоприятными для исследуемой системы, то здесь низкой мутности.
    1. Выберите наиболее важные ответы и их предпочтительные состояния, например , минимальную мутность. Объедините эти выборы путем максимизации функции желательности или аналогичные инструменты, которые встроенные функции нескольких программных пакетов Doe 36.
    2. В зависимости от предполагаемого применения Oе модели, выберите подтверждение выполняется для проверки оптимальных условий и / или предсказательную силу модели в целом, например , если условия по прогнозам, будет наиболее благоприятным не были частью первоначального DoE выбрать их в качестве последующих экспериментов.

5. Улучшение модели и Проверка предсказательной силы

  1. Конкретизируйте первоначальный дизайн пространства для самых желательных условий эксплуатации, например , низкая мутность в диапазоне 0-1000 нефелометрических единиц мутности (NTU), на основе предсказаний модели (4.2).
  2. Установить новый DoE в этих диапазонах, в том числе только те факторы, которые были идентифицированы как значимые или соответствующие (4.1.2)).
    Примечание: Коэффициент может быть существенным с точки зрения анализа модели , но не имеет значения для процесса, т.е. его влияние на реакции составляет <1% по сравнению с другими факторами.
  3. Повторите шаги 1-5.2, пока качество предсказаний модели не соответствует ТРЕБОВАНИЯтс, например , стандартное отклонение модели , как указано программное обеспечение является достаточным для предполагаемого применения. Изменить экспериментальную стратегию , если требуется для этих итераций, например , использовать только один флокулянт в уточнении.
  4. Передача и подтвердить результаты по шкале вниз модели в пилотном масштабе или окончательного масштаба производства.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Флокуляция экстракта табака с различными полимерами

Описанный выше способ был успешно применен к разработке процесса флокуляции табачных экстрактов при производстве моноклональных антител (ВИЧ-нейтрализующих антител 2G12) и флуоресцентный белок (DsRed) (рис 1) 16, и с тех пор были переданы других белков, включая лектины, кандидатов вакцины против малярии и слитых белков (неопубликованные данные). Ка...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Самый важный аспект необходимо учитывать при создании DoE для характеристики флокуляции частиц является то , что конструкция в принципе должна быть в состоянии обнаружить и описать предполагаемые или возможные эффекты 36,38, например , влияние рН, типа полимера и концентрации 16 полимера. Поэтому, важно, чтобы оценить долю пространства дизайна (FDS) перед началом реальных экспериментов. FDS есть доля многомерного экспериментального пространства (охватываемой проектных факторов, наприме...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Автор не имеет конфликта интересов раскрывать.

Благодарности

Я хотел бы выразить признательность доктору Томасу Радемахеру за предоставление трансгенных семян табака и Ибрагиму Аль Амеди за выращивание табака. Я хотел бы поблагодарить д-ра Ричарда М. Тваймана за помощь в редактировании и профессора д-ра Райнера Фишера за плодотворные дискуссии. Эта работа была частично профинансирована за счет гранта Европейского исследовательского совета «Future-Pharma», предложение No 269110, Фонда Фраунгофера-Zukunftsstiftung (Фонд будущего Фраунгофера) и внутренних программ Общества Фраунгофера в рамках гранта No. Привлечь 125-600164.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Портативный мутометр 2100PHach4650000Турбидиметр
2G12 антителоPolymunAB002Референсное антитело
Biacore T200GE Healthcare28-9750-01SPR устройство
BP-410Furh2632410001Рукавный фильтр
Catiofast VSHBASF79002360Флокулятор
Центрифуга 5415DEppendorf5424 000.410Центрифуга Центрифуга
Пробирка 15 млПробирка для реакцииLabomedic2017106
Пробирка для центрифуги 50 мл Самостоятельнаядля1110504Реакционная пробирка
ХитозанCarl Roth GmbH5375.1Флокулятивный агент
Дизайн-Эксперт(R) 8Stat-Ease, Inc.n.a.DoEпрограммное обеспечение
ДинатрийфосфатCarl Roth GmbH  4984.3 Мультимедийная составляющая
Ferty 2 MegaKammlott5.220072Удобрение
Forma -86C ULT морозильная камераThermoFisher88400Морозильная камера
Теплица n.a.n.a.Длявыращивания растений
Grodan Rockwool Cubes 10 x 10 смGrodan102446Блок минеральной ваты
HEPESCarl Roth GmbH9105.3Медиа компонент
K700P 60DPall5302305Глубинный фильтрующий слой
KS50P 60DPallB12486Глубинный фильтрующий слой
MiraclothLabomedic475855-1RФильтровальная ткань
MultiLine Multi 3410 IDSWTWWTW_2020pH-метр / кондуктометр
Osram холодный белый 36 ВтOsram4930440Источник света
PhytotronIlka Zellн.а.Длявыращивания растений
Polymin PBASF79002360Флокулятор
POLYTRON PT 6100 DKinematica11010110Гомогенизатор с помощью специального лезвия
Protein ALife technologies10-1006Антителосвязывающий белок
Хлорид натрияCarl Roth GmbHP029.2Медиакомпонент
Synergy HTBioTekSIAFRTСчитыватель флуоресцентных пластин
TRISCarl Roth GmbH4855.3Медиакомпонент
Tween-20Carl Roth GmbH9127.3Медиакомпонент
VelaPad 60PallVP60G03KNH4Корпус фильтра
Zetasizer Nano ZSMalvernZEN3600DLS Измерение распределения частиц по размерам
пробирка

Ссылки

  1. Godfray, H. C. J., et al. Food Security: The Challenge of Feeding 9 Billion People. Science. 327, 812-818 (2010).
  2. Fischer, R., Schillberg, S., Buyel, J. F., Twyman, R. M. Commercial aspects of pharmaceutical protein production in plants. Curr. Pharm. Des. 19, 5471-5477 (2013).
  3. Pastores, G. M., et al. A Phase 3, multicenter, open-label, switchover trial to assess the safety and efficacy of taliglucerase alfa, a plant cell-expressed recombinant human glucocerebrosidase, in adult and pediatric patients with Gaucher disease previously treated with imiglucerase. Blood Cells Mol. Dis. 53, 253-260 (2014).
  4. De Paepe, D., et al. A comparative study between spiral-filter press and belt press implemented in a cloudy apple juice production process. Food Chem. 173, 986-996 (2015).
  5. Buyel, J. F., Twyman, R. M., Fischer, R. Extraction and downstream processing of plant-derived recombinant proteins. Biotechnol. Adv. 33, 902-913 (2015).
  6. Wilken, L. R., Nikolov, Z. L. Recovery and purification of plant-made recombinant proteins. Biotechnol. Adv. 30, 419-433 (2012).
  7. Buyel, J. F. Process development trategies in plant molecular farming. Curr. Pharm. Biotechnol. 16, 966-982 (2015).
  8. Hassan, S., Keshavarz-Moore, E., Ma, J., Thomas, C. Breakage of transgenic tobacco roots for monoclonal antibody release in an ultra-scale down shearing device. Biotechnol. Bioeng. 111, 196-201 (2014).
  9. Hassan, S., van Dolleweerd, C. J., Ioakeimidis, F., Keshavarz-Moore, E., Ma, J. K. Considerations for extraction of monoclonal antibodies targeted to different subcellular compartments in transgenic tobacco plants. Plant Biotechnol. J. 6, 733-748 (2008).
  10. Buyel, J. F., Fischer, R. Scale-down models to optimize a filter train for the downstream purification of recombinant pharmaceutical proteins produced in tobacco leaves. Biotechnol. J. 9, 415-425 (2014).
  11. Buyel, J. F., Fischer, R. Downstream processing of biopharmaceutical proteins produced in plants: the pros and cons of flocculants. Bioengineered. 5, 138-142 (2014).
  12. Gregory, J., Barany, S. Adsorption and flocculation by polymers and polymer mixtures. Adv. Colloid Interface Sci. 169, 1-12 (2011).
  13. Zhou, Y., Franks, G. V. Flocculation mechanism induced by cationic polymers investigated by light scattering. Langmuir. 22, 6775-6786 (2006).
  14. Runkana, V., Somasundaran, P., Kapur, P. C. Mathematical modeling of polymer-induced flocculation by charge neutralization. J. Colloid Interface Sci. 270, 347-358 (2004).
  15. Hjorth, M., Jorgensen, B. U. Polymer flocculation mechanism in animal slurry established by charge neutralization. Water Res. 46, 1045-1051 (2012).
  16. Buyel, J. F., Fischer, R. Flocculation increases the efficacy of depth filtration during the downstream processing of recombinant pharmaceutical proteins produced in tobacco. Plant Biotechnol. J. 12, 240-252 (2014).
  17. Buyel, J. F., Opdensteinen, P., Fischer, R. Cellulose-based filter aids increase the capacity of depth filters during the downstream processing of plant-derived biopharmaceutical proteins. Biotechnol. J. 10, 584-591 (2014).
  18. Yasarla, L. R., Ramarao, B. V. Dynamics of Flocculation of Lignocellulosic Hydrolyzates by Polymers. Ind. Eng. Chem. Res. 51, 6847-6861 (2012).
  19. Montgomery, D. C. Design and Analysis of Experiments. , John Wiley & Sons Incorporated. (2007).
  20. Buyel, J. F., Fischer, R. Characterization of complex systems using the design of experiments approach: transient protein expression in tobacco as a case study. J. Vis. Exp. , e51216(2014).
  21. Espuny Garcia Del Real, G., Davies, J., Bracewell, D. G. Scale-down characterization of post-centrifuge flocculation processes for high-throughput process development. Biotechnol. Bioeng. 111, 2486-2498 (2014).
  22. Rathore, A. S., Sofer, G. Process Validation in Manufacturing of Biopharmaceuticals, 3rd edn, Vol. 1. , Taylor & Francis. (2012).
  23. Kang, Y., et al. Development of a Novel and Efficient Cell Culture Flocculation Process Using a Stimulus Responsive Polymer to Streamline Antibody Purification Processes. Biotechnol. Bioeng. 110, 2928-2937 (2013).
  24. Menkhaus, T. J., Eriksson, S. U., Whitson, P. B., Glatz, C. E. Host selection as a downstream strategy: Polyelectrolyte precipitation of beta-glucuronidase from plant extracts. Biotechnol. Bioeng. 77, 148-154 (2002).
  25. Holler, C., Vaughan, D., Zhang, C. M. Polyethyleneimine precipitation versus anion exchange chromatography in fractionating recombinant beta-glucuronidase from transgenic tobacco extract. J. Chromatogr. A. 1142, 98-105 (2007).
  26. Buyel, J. F., Fischer, R. Synthetic polymers are more effective than natural flocculants for the clarification of tobacco leaf extracts. J. Biotechnol. 195, 37-42 (2014).
  27. Pearson, C. R., Heng, M., Gebert, M., Glatz, C. E. Zeta potential as a measure of polyelectrolyte flocculation and the effect of polymer dosing conditions on cell removal from fermentation broth. Biotechnol. Bioeng. 87, 54-60 (2004).
  28. Buyel, J. F., Gruchow, H. M., Boes, A., Fischer, R. Rational design of a host cell protein heat precipitation step simplifies the subsequent purification of recombinant proteins from tobacco. Biochem. Eng. J. 88, 162-170 (2014).
  29. Wang, S., Liu, C., Li, Q. Impact of polymer flocculants on coagulation-microfiltration of surface water. Water Res. 47, 4538-4546 (2013).
  30. Menkhaus, T. J., Anderson, J., Lane, S., Waddell, E. Polyelectrolyte flocculation of grain stillage for improved clarification and water recovery within bioethanol production facilities. Bioresour. Technol. 101, 2280-2286 (2010).
  31. Mune, M. A. M., Minka, S. R., Mbome, I. L. Optimising functional properties during preparation of cowpea protein concentrate. Food Chem. 154, 32-37 (2014).
  32. Buyel, J. F., Fischer, R. Predictive models for transient protein expression in tobacco (Nicotiana tabacum L.) can optimize process time, yield, and downstream costs. Biotechnol. Bioeng. 109, 2575-2588 (2012).
  33. Buyel, J. F., Kaever, T., Buyel, J. J., Fischer, R. Predictive models for the accumulation of a fluorescent marker protein in tobacco leaves according to the promoter/5'UTR combination. Biotechnol. Bioeng. 110, 471-482 (2013).
  34. Buyel, J. F., Fischer, R. A juice extractor can simplify the downstream processing of plant-derived biopharmaceutical proteins compared to blade-based homogenizers. Process Biochem. 50, 859-866 (2014).
  35. Anderson, M. J., Whitcomb, P. J. DOE Simplified: Practical Tools for Effective Experimentation. Vol. 1. 1, Taylor & Francis. (2000).
  36. Anderson, M. J., Whitcomb, P. J. Response Surface Methods Simplified. , Productivity Press. (2005).
  37. Buyel, J. F., Fischer, R. Generic chromatography-based purification strategies accelerate the development of downstream processes for biopharmaceutical proteins produced in plants. Biotechnol. J. 9, 566-577 (2014).
  38. Myers, R. H., Montgomery, D. C., Anderson-Cook, C. M. Response Surface Methodology: Process and Product Optimization Using Designed Experiments. , Wiley. (2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи