Foraging Протокол Путь длиной для Дрозофилы личинки

Краткое содержание

Мы предоставляем подробный протокол для анализа длины пути поиска пищи у Drosophila melanogaster. Мы обсуждаем подготовку и обращение с подопытными животными, как проводить анализ и анализировать данные.

Аннотация

MELANOGASTER личиночной путь длиной фенотип Drosophila является установленным мерой , используемой для изучения генетических и экологических вклад в поведенческие изменения. Личиночной анализ длины пути был разработан для измерения индивидуальных различий в поведении поиска пищи , которые впоследствии были связаны с нагула гена. Личинки путь длиной является забиваются легко черта, которая облегчает сбор больших размеров выборки, при минимальных затратах, для генетических экранов. Здесь мы приводим подробное описание текущего протокола для личиночной анализа длины пути, впервые примененный Соколовского. Протокол подробно описано, как воспроизводимое обработки тестовых животных, выполняют поведенческий анализ и анализ данных. Пример того, как анализ может быть использован для измерения поведенческой пластичностью в ответ на изменения окружающей среды, путем манипулирования подачей среды перед выполнением анализа, также предусмотрено. И, наконец, соответствующий дизайн испытаний, а также факторы окружающей среды, которые могут изменитьличиночной путь длины, такие как качество продуктов питания, возраста и развития дневных эффектов обсуждаются.

Введение

С момента открытия белого гена в лаборатории Томаса Ханта Моргана в 1910 году плодовая мушка, дрозофилы (дрозофилы), был использован в качестве модели для изучения молекулярных и физиологических основ различных биологических процессов. Популярность D. MELANOGASTER во многом связано с большим количеством и разнообразием генетических инструментов. маленький размер дрозофилы, в относительной легкости в обращении и короткое время поколения делают ее идеальной моделью для генетических исследований. Не менее важным является потенциал дрозофилы, чтобы продемонстрировать многие из фенотипов , выраженных более сложных организмов , включая млекопитающих. Это включает в себя сложные фенотипы, такие как поведение, которые стоят на границе раздела между организмом и окружающей средой. Как таковые, поведенческие исследования дрозофилы внесли существенный вклад в наше понимание того, как гены и окружающая среда опосредуют поведение1.

Одним из первых исследований Д. MELANOGASTER личиночной поведение исследованы индивидуальные различия в личиночной стратегиях поиска пищи путем измерения длины путей личинок ² во время кормления. Путь длины определялась как общее расстояние, пройденное одной личинкой на дрожжах, в течение пяти минут. Оба лабораторных штаммов и мух из природной популяции в Торонто варьировалась в их нагула поведения и был генетический компонент индивидуальных различий в пути длины. Два личиночные нагула морфы были описаны из распределений количественных путь длины, и они были названы ровер и няню. Роверы демонстрируют более длинные длины путей во время прохождения большей площади в то время как на подложке пищи, чем натурщиков. Используя этот путь длины анализа, де Бель и др. ³ сопоставляются нагула (для) ген , лежащий в основе этих индивидуальных различий в поведении в дискретном месте на chromosome- 2 (24A3-24C5). D. мelanogaster для гена позже была клонирована ⁴ и показал быть цГМФ зависимой протеинкиназы ^5, модулятор физиологии и поведения у дрозофилы и других организмов ^6.

Здесь мы приводим текущий протокол для личиночной анализа длины пути , изначально разработанной в Соколовского ^2. Хотя некоторые аспекты анализа изменились за эти годы, концепция лежит в основе дизайна не имеет. Мы также предоставляем данные, иллюстрирующие потенциал Пробирной для оценки генетических и экологических вклад в индивидуальные различия в поведении нагула личинок дрозофилы. Личиночной анализ пути длины является простым, эффективным, и тем не менее надежный. Один человек может проверить до 500 личинок с легкостью через четыре часа и результаты могут быть получены с высоким уровнем воспроизводимости. Изначально разработанный для локализации для, его можно использовать в генетических экраны, количественного картирования локуса признаков, а также в исследованияхгена-по-среде (GXE) взаимодействий. Кроме того, его простота и воспроизводимости делают его отличным ресурсом для Вузовский.

Протокол

1. Подготовьте виноградные листы и удерживания бутылок для сбора личинок

1. Для того, чтобы удерживающие бутылки, вырезать отверстия в одну сторону 6 унций бутылки муха культуры, достаточно большой , чтобы соответствовать муху флакон штекер для подачи воздуха (рис. 1D).
2. Для того, чтобы винограда пластины, готовят 250 мл виноградного сока среды (1,8% агар, 45% виноградного сока, 2,5% уксусной кислоты, 2,5% этанола) при кипячении агар, виноградный сок и большую часть воды, охлаждают до 70 ° С ( перемешиваться при охлаждении), а затем добавить уксусную кислоту и этанол, и довести до нужного объема водой.
3. Используйте шприц (без иглы) , чтобы заполнить 35 х 10 мм чашки Петри крышки , пока поверхность виноградного сока среды не делает купол над кромкой крышки (рис. 1А).
4. Магазин винограда пластины во влажном и герметичном контейнере при температуре 4 ° С до использования (до максимум 2 недели).

2. Приготовление еды Плиты

1. Подготовьте стандартный рецепт лету пищи.
   Примечание: ТEST эффекты качества выращивания продуктов питания на пути длины мы использовали низкое содержание питательных веществ летучую пищи: 10% сахарозы, 1,3% агара, 0,8% натриевого тартрата калия, 0,1% первичный кислый фосфат кали, 0,05% хлорида натрия, 0,05% хлорида кальция, 0,05% хлорида магния, 0,05% сульфат железа, 5% дрожжей и 0,5% пропионовой кислоты в воде; и высокое содержание питательных веществ муха пища: 1,5% сахарозы, 1,4% агара, 3% глюкозы, 1,5% кукурузной муки, 1% зародышей пшеницы, 1% соевой муки, 3% патоки, 3,5% дрожжей, 0,5% пропионовой кислоты, 0,2% Tegosept и 1 % этанола в воде. Для обоих продуктов автоклава решение и охладить до 50 ^° С перед добавлением пропионовой кислоты, Tegosept и этанол.
2. Налейте 40 мл летучей пищи в 100 х 15 мм чашки Петри.
3. Продовольственный магазин пластины во влажном и герметичном контейнере при температуре 4 ° С до использования (до максимум 2 недели).

3. Приготовьте листы Test

1. Приготовьте 58 х 25 см, толщиной 6 мм черные плексигласа пластины с 10, 1 мм глубиной круговых скважин, 10 см в диаметре и расположены в 2 х 5 днейESIGN (рис. 1С) , чтобы проверить личинок.
   Примечание: до 30 личинок могут быть проверены в то время, если 3 или более из вышеуказанных Plexiglas пластин доступны. В качестве альтернативы, личинки могут быть испытаны в чашки Петри, 10 см в диаметре. Этот вариант является гораздо более трудоемким и позволяет меньшим количеством личинок для тестирования.
2. Получить черный 39 х 8 см, толщиной 6 мм из плексигласа разбрасыватель для распространения дрожжевой пасты на тестовых пластинах из оргстекла.
3. Подготовьте 100 х 15 мм чашки Петри крышки для записи личиночной длины путей путем отделения крышки от днища заранее.

4. Настройка Родительского групп населения

1. Держите условия выращивания постоянной на протяжении всего анализа (например, 25 ° С , влажность воздуха 60% и 12:12 свет: темнота на стандартной летучей пищи).
2. Повышение родительского населения в тех же условиях выращивания.
3. Соберите 100 - 150 самок и 50 - 75 мужчин и возраст их в течение 5 ± 1 дней для оптимального плодовитости.
4. Разрешить пemales и самцы спариваться в течение ночи в 6 унций летучей культуры бутылки со стандартной зольной пищи.
5. Передача летит в бутылку холдинга и обеспечить виноградный пластину (небольшое количество свежих дрожжей пасты на виноградной пластины будет способствовать яйценоскость;. Фиг.1В) над верхней частью с клейкой лентой (. Рис 1E).
6. Оставьте бутылки , стоящие вверх ногами (рис. 1F), с виноградным пластиной в нижней части, чтобы позволить взрослым откладывают яйца на тарелке винограда.
7. Выбросьте первый виноградный пластину через 24 часа и поместите новый виноградный пластину в бутылке холдинга. Это будет виноград пластины, из которых личинки собираются на следующий день.
   Примечание: виноградные пластины должны быть очищены от личинок 22 ч после того , как установить, настроить пластины таким образом , что они могут быть очищены в начале следующего дня (. , Например, установить пластину в 12 часов и ясно , в 10 часов утра на следующий день). Желательно, чтобы отбросить первую виноградную пластину, чтобы избежать каких-либо яйца, которые самки, возможно, были удержанию и тхат может быть выдвинуто в стадии разработки.

5. Соберите L1 (личиночных) Личинки из винограда Плиты

1. Удалить виноградные пластины из бутылок 22 ч после того, как они были созданы и место в 60 х 15 мм чашки Петри.
2. Поместите новый виноградный тарелку со свежими дрожжами пасты на бутылке холдинга.
3. Очистить и отбросить все личинки из сеяной винограда пластины с использованием рассекает зонда.
4. Инкубировать очистили виноградные пластины в течение 4 часов в стандартных условиях.
5. Через 4 часа, забрать 100 личинок L1 на штамм из виноградных пластин и помещают на пищевых пластинах.
   1. Поместите личинки на пищу аккуратно (без перфорирования пищи и хоронить личинок) и избегать скученности путем распределения личинок по всей пищевой пластины.
6. Выдержите пищевые пластины до тех пор, подопытные животные не приблизительно 10 ч до начала странствий.
   Примечание: При температуре 25 ° С, 10 ч, прежде чем блуждающих в целом соответствует 72 - 96 ч после вылупления. exacт количество времени инкубации должна быть определена до начала эксперимента, собирая начальный набор личинок для каждого штамма и не записывать количество часов до начала странствий (блуждающих личинки будут двигаться из пищи на сторонах и крышке пищи тарелки).
   Примечание: При необходимости, одни и те же родители могут быть использованы для сбора личинок в течение 3 - 4 дней тестирования, повторяя шаги 4.7 до 5.5. Изменение порядка, в котором штаммы настроены и протестированы через дней, чтобы избежать эффекта тестовый заказ на пути длины. Проверьте один и тот же "контроль" напряжение / напрягает каждый день тестирования для контроля дневных эффектов.
7. Если многие штаммы тестируют, шатаются настройки и сбора раз личинок, чтобы проводить тестирование каждого штамма в соответствующий момент времени в дальнейшем.

6. Личинки Путь длиной испытания

1. Растворить сухой активный пекарских дрожжей в воде при соотношении 1: 2 (вес к объему). Готовое дрожжи паста должна быть тоньше, чем в годncake жидкое тесто, таким образом, что при подъеме ложку из пасты, она капает и оставляет позади ленты на поверхности пасты, которая быстро растает.
   Примечание: Последовательность дрожжевой пасты имеет важное значение и должно быть постоянным в течение всего эксперимента. Точные дрожжи: соотношение вода, возможно, придется быть скорректирована в зависимости от марки и партии дрожжей.
2. Осторожно выбрать личинки первого штамма быть испытанным из пищевой пластины с помощью кисти.
3. Сбор личинок в чашку Петри и осторожно промыть водой, чтобы удалить все продукты питания.
   1. Быстро промыть личинки с 1 - 2 мл воды и осторожно лиманда личинки насухо лаборатории протирать, чтобы избежать переноса любой воды при помещении личинок на испытательной пластине. Для того, чтобы избежать стресса, держать личинок влажной, но не погружать в воде.
4. Расположить три тестовые пластины бок о бок и установить 5 мин таймер для каждой испытательной пластины.
5. Нанесите дрожжевую пасту к верхней части тестовых пластин и с помощью шпателя, распространение тонкий Layэр дрожжевой пасты на каждой испытательной пластине таким образом, что все скважины имеют ровный слой дрожжей.
6. Аккуратно поместите одну личинку в центре каждой лунки, начиная с 5 мин после того, как таймер размещения первого личинки на каждой пластине. Примечание: Три пластины может быть сделано в то время, что дает размер выборки 30 / штамм / день тестирования, в общей сложности до 500 личинок.
7. Поместите блюдо крышкой Петри в верхней части каждой лунки.
8. Когда таймер закончится, не снимая личинок из пластины, начните отслеживании длины путей, оставленных в дрожжах, используя постоянный маркер. Микроэлементы длины путей в том же порядке, что и личинки были помещены на испытательных пластин.
   1. Выполните трассировку с той же скоростью, как личинки были помещены на планшетах. Для обеспечения согласованности в последующего анализа данных, использовать один и тот же маркер для всех длин путей. Рекомендуется постоянный маркер.
9. Повторите шаги 6.2 для 6.8.1 для каждого штамма, подлежащего испытанию. Выберите каждый штамм из пищи непосредственно перед тестированием, чтобы избежать воздействия на голодном годовыхй длины.

7. Пищевая Лишение

1. Если личинки быть пищей лишены перед испытанием, собирать личинок , как описано в пунктах 6.2 до 6.3, но необходимое количество времени лишение пищи ранее (например, если личинки в пищу лишены в течение 4 часов, собирают личинки 4 ч до того время тестирования).
2. Разделить промытый личинок на две группы и поместите продукты лишены группы в 60 х 15 мм чашки Петри с 5 мл 1% агара, и контрольной группой в чашку Петри с помощью 5 мл пищевого стандарта.
3. Поместите вес на вершине перевернутой крышке чашки Петри (в противном случае личинки способны выползать при поиске пищи).
4. Выдержите в течение ранее установленного срока лишения пищи и приступить к тестированию, как описано в пунктах 6.2 до 6.9.
5. Если многие штаммы должны быть испытаны, потрясают лишение пищи времени начала, чтобы позволить для тестирования каждого штамма в соответствующий момент времени.

Анализ 8. Данные

Примечание: В данном разделе описывается метод анализа данных с использованием ImageJ ⁷ или ⁸ Фиджи для обработки длины путей, хотя и другое программное обеспечение может быть использовано.

1. Используйте легкий стол, чтобы передать все прослежены длины путей от чашки Петри крышек на белой бумаге (крышки можно промывают этанолом и повторно использовать для дальнейшей записи пути длины).
2. Трассировка 50 мм прямой опорной линии на одном из листов бумаги.
3. Сканирование длины путей при разрешении 300 точек на дюйм и сохранить в виде растровых или TIFF файлов изображений.
4. Откройте файл изображения, выберите вкладку "Процесс"> "двоичный"> "Make двоичным". Затем на вкладке "Process", выберите "Binary"> "скелетируют". Это дает ширину линии один пиксель, независимо от толщины следа.
5. Убедитесь, что каждый путь длины появляется в виде непрерывной одной строки без каких-либо кроссоверов.
6. Отделить любые пересечения с помощью "Straight Линэ инструмент "и окраска белой линии (непрерывность пути можно проверить с помощью" "(кальку) инструмента Wand, весь путь должен быть выделены желтым цветом (рис. 2).
7. Выберите "Анализировать" на вкладке> Установить измерения и выберите "Периметр" и "Display" ярлык.
8. Выберите вкладку "Проанализировать"> "Установить масштаб" и выберите "Удалить масштаб".
9. На изображении, выберите опорную линию только, выберите вкладку "Проанализировать"> "Проанализировать частицы" и выберите "Показать: Контуры", "Показывать результаты" и "Очистить результаты таблицы". Примечание: Выход покажет количество пикселей, соответствующих масштабу линии 50 мм.
10. Выберите "Проанализировать"> вкладка "Установить масштаб" и заполнить числа пикселей в "Расстояние в пикселях" и соответствующее расстояние (50 мм) в "известном расстоянии".
11. И, наконец, выбрать все пути длины рисунки одного генотипата времени, выберите вкладку "Проанализировать"> "Проанализировать частицы" и выберите "Показать: контуры", "Показывать результаты" и "Очистить результаты таблицы".
    1. Удалите любые письменные этикетки или явные посторонние маркировки (они будут признаны в качестве длины путей) в пределах выбранной области, выбрав область и заполняя его белым цветом.
12. Осмотреть "очертаний" выходного файла, чтобы обеспечить периметры были правильно установлены. Выход покажет путь длины в мм для каждого пути длины рисунка в отборе. Это можно легко экспортировать в электронную таблицу и проанализированы с помощью любого статистического программного обеспечения.

Результаты

Различия в пути длины ровера и няней для штаммов , а также влияние лишения пищи на пути длины показаны на рис. . 3 Данные , собранные в течение трех последовательных дней тестирования показали значительный эффект деформации (F _(1,421) = 351,89, р <2,20 х 10 ^-16;. Фиг.3А), с марсохода путешествует дальше , чем натурщиков. В дополнение к эффекту деформации, существует также значительное влияние обработки п...

Обсуждение

Анализ пути длины изложены здесь предлагает надежную и простую меру нагула поведения личинок дрозофилы. Протокол следует общей методологии , описанной в Sokolowski ^2, но в отношении эффективности и экспериментальных управления с тех пор была улучшена. Насколько нам известно, этот метод является единственным доступным методом для измерения личиночной пути длины. Оригинальная версия пути длиной протокола ^{2, 3, 15, 16} проходят личинок на чашки Петри с тонким слоем дрожжевой пасты наносится с ...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
6 унций&nbл; бутылки для культуры мух	Fisher Scientific	AS355
Пробки для флаконов	Droso-Plugs	59-201
35 x 10 мм чашки Петри	Чашки Петри Falcon	351008
100 x 15 мм	Фишер	875712
60 x 15 мм чашки Петри	VWR	25384-168
Препарирующие щупы	Almedic	2325-58-5300
Дрожжевая	лаборатория Scientific	FLY-8040-20F