Intra-подвздошной артерией Инъекции для эффективного и селективного моделирования Микроскопическое костными метастазами

Краткое содержание

В этой рукописи подробно описана процедура инъекции внутриподвздошной артерии (IIA), техника доставки раковых клеток конкретно в ткани задних конечностей, включая кости, для установления экспериментальных метастазов в кости. Несмотря на то, что первоначально этот протокол был разработан для моделей опухолей молочной железы, его можно легко распространить на другие типы рака.

Аннотация

Инъекция внутриподвздошной артерии (ИИИ) является эффективным подходом к введению метастатических поражений различных раковых клеток у животных. По сравнению с широко используемыми внутрисердечными и внутрибольшеберцовыми инъекциями, инъекции ИБИ имеют ряд преимуществ. Во-первых, он может доставлять большое количество раковых клеток конкретно в кости задних конечностей, тем самым обеспечивая пространственно-временные синхронизированные события колонизации на ранних стадиях и обеспечивая надежную количественную оценку и быстрое обнаружение диссеминированных опухолевых клеток. Во-вторых, он вводит раковые клетки в кровоток, не повреждая местные ткани, тем самым предотвращая воспалительные и ранозаживляющие процессы, которые затрудняют процесс колонизации костей. В-третьих, инъекция ИИА вызывает очень слабый рост метастазов в некостных органах, тем самым предотвращая развитие других жизненно важных метастазов у животных и позволяя непрерывно контролировать вялотекущие повреждения костей. Эти преимущества особенно полезны для изучения прогрессирования от одиночных раковых клеток к многоклеточным микрометастазам, что в прошлом было в значительной степени неуловимо. В сочетании с передовыми подходами биологической визуализации и гистологии костей инъекции IIA могут применяться для различных исследовательских целей, связанных с метастазами в кости.

Введение

Метастазы приходится более 90% случаев смерти, вызванных солидных опухолей. Кость является наиболее распространенным органом, пострадавших от метастазов различных видов рака, особенно рака молочной железы и рака простаты. Когда поставлен диагноз в клинике, метастазы в кости, как правило, уже вошли в продвинутую стадию либо с остеолитических или остеобластов изменений в костной ткани, часто сопровождается неврологической симптоматикой.

Предыдущие исследования в основном сосредоточены на откровенных остеолитических костных метастазов ^1-3, однако мы в настоящее время имеют ограниченное понимание микрометастаз в костях до начала процесса остеолитического. Это, по крайней мере, частично из-за отсутствия соответствующих экспериментальных моделей и подходов. Генетически сконструированные мышиные модели рака молочной железы часто метастазирует в легкие, но гораздо менее эффективно для костей ^4. Аналогично, ортотопически пересаженные опухоли развиваются редко спонтанные метастазы в кости, с некоторыми кости тропических 4Т1 молочных желез carcinomсуб-клоны и MSP избыточно экспрессируется PyMT трансгенной мышиной модели как исключения ^5-7. Intra-большеберцовый бурение может доставить раковые клетки до костей ^8-10, но он также получает повреждения и воспаление местных тканей. В настоящее время внутри сердца инъекции линии клеток рака молочной железы был основным подходом к расследованию кости колонизацию ^11-13. Тем не менее, после того, как раковые клетки вводят в левый желудочек лишь ограниченную часть, наконец, достигнет кости и костный мозг, что делает его трудно отслеживать микроскопические метастазы в измеримой моды.

В данном исследовании мы устанавливаем технику, а именно внутри подвздошной артерии (IIA) раствор для инъекций ^14, чтобы передавать раковые клетки в ткани задней конечности, тем самым обогащая раковые клетки в кости и костного мозга , не причиняя ущерба местным тканям. Из-за специфичности кости, такой подход также позволяет достаточно времени для индолентными раковых клеток, чтобы в конечном счете колонизировать до ANimals поддаваться первичных опухолей или метастазов в других жизненно важных органов. В сочетании с различными другими способами, такими как биолюминесценции визуализации, иммунофлуоресцентного окрашивания и гистоморфометрии кости, IIА инъекции является потенциально полезным для широкого круга научных целей, связанных с костными метастазами, особенно для отслеживания прогресса в направлении от одиночных раковых клеток к многоканальному клетки микрометастазов. В частности, мы показали, что ИВР инъекции позволяет визуализировать взаимодействия между раковыми клетками и различными типами окружающих клеток в костном микросреды.

Протокол

Все для животных работа была проделана в соответствии с руководящими принципами по уходу за животными в Бейлор медицинского колледжа.

1. Подготовка сотового

Примечание: Различные линии раковых клеток могут быть использованы для МИС инъекции в зависимости от целей исследования. Мы использовали клеточные линии рака молочной железы MCF7, 4T1, 4T07, MDA-MB-361, MDA-MB-231, MDA-MB-436 и линия клеток рака простаты C4-2 в нашем исследовании. Обычно мы используем как GFP- и люциферазы светлячка меченных раковые клетки для нашего исследования и показать некоторые данные здесь из GFP-люциферазы-меченой клеточной линии MCF7.

1. Поддержание клеток в среде DMEM , содержащей 10% FBS и 0,1 мг / мл пенициллина-стрептомицина , при 37 ° С в 5% CO _2.
2. Перед IIA инъекции, Trypsinize клетки на 80 - 90% слияния с 0,25% -ным раствором / ЭДТА трипсина. Использование холодной PBS, чтобы промыть клетки дважды, и вновь приостановить клеток в 10 мл PBS для подсчета клеток. Для того, чтобы удалить PBS, центрифуга клетки при 800 мкг в течение 5 мин.
3. Повторное приостановить клеткипри концентрации 5 × 10 ⁶ клеток / мл в охлажденном льдом PBS.
4. Используйте 100 мкл GFP- и люциферазы светляков-меченых раковые клетки для IIA инъекции одной мыши.
   Примечание:. Таким образом, число клеток , полученных у каждого животного составляет 5 х 10 ⁵ Это число , возможно , потребуется , чтобы быть изменен на основе агрессивностью клеточных линий.
5. Держите клеточные суспензии на льду.
   Примечание: Вибрации могут быть необходимы для предотвращения агрегации клеток каждые несколько минут, пока он не будет готов к инъекции. Для некоторых клеточных линий (например, MDA-MB-231), более строгие процедуры (например, проходя через ячейки фильтра 45 мкм) могут быть необходимы для предотвращения агрегации. Обратите внимание, что забивают сосудов может вызвать некроз тканей, и, следовательно, не оправдав эксперименты.

2. Подготовка животных

1. Для лечения боли на животных, дают 5 мг / кг / день карпрофен (или другой анальгетик) с биологически активной добавки к мышам не менее 24 ч до операции. администрироватьв дозе 0,1 мг / мл бупренорфин подкожно 60 мин до операции. Примечание: необязательная процедура имплантировать эстрадиола поддон в задней части животных, чтобы обеспечить дополнительное эстрадиол. Это ускорит выросшее от ER + раковых клеток (например, MCF-7 клеток) ^9.
2. Обезболить 4 - в возрасте 6 недель мышь (примерно 20 г) с кетамином (80 - 100 мг / кг) и ксилазина (10 -12,5 мг / мл) путем внутрибрюшинной инъекции.
3. Подтвердить соответствующий уровень седации 20 г мыши по носке и щепоткой наблюдения снижения частоты дыхания на 50% и розовые слизистые оболочки (например, кожи мыши уха и лапа кожи). Держите мониторинг этих жизненно важных признаков каждые 15 минут во время операции. Примечание: Ни один движение животного не указывает на то, что животное достаточно наркозом и готов к операции.
4. Используйте ветеринара мазь на глаз, чтобы предотвратить сухость кожи.
5. Бритье мыши на нижней части живота, особенно правой паховой области, где хирургия и инъекции будетпроисходит.
   Примечание: В этом нет необходимости, если используются бестимусных голых мышей.
6. Положите мышь на спине разведите ноги в своих естественных позиций и придерживаться пальцы на мобильный рассечение картона с лентой.
7. Протрите правой паховой области с 70% изопропилового этанол смоченные стерильным ватным тампоном, а затем с бетадин хирургической скраб несколько раз.

3. Общие подвздошной вены и артерии Место и Разделение

1. Сделать кожу надрезать 1,0 - 1,2 см длиной между 4 - ^м и 5 - ^м сосками в нижней правой части живота , используя стерильные, # 10 углерода лезвия стали скальпель удерживаемых в № 3 ручки. Затем используют стерильные хирургические драпировка для покрытия тела животного, за исключением участка разреза.
2. Переместить животное на стандартный стенд сверху рассечение микроскопом. Используйте увеличение в 4 раза для инъекций.
3. Под 4-кратным увеличением рассечение микроскопа, вставить тупые щипцов разделения между жировой тканью и peritoneuм, и раздвинуть ткани наружу с обеих сторон , чтобы выставить подвздошных сосудов и нервов (см рисунок 1).
   Примечание: артерии между аортой от средней линии и нижней части ветвей артерии называется общей подвздошной артерии. Это где инъекции происходит.
4. Используйте одну пару прямых тонких щипцов прорвать соединительной ткани (например, мембраны) между судами и нерва, ближе к сосудам.
5. Переключение прямых тонких щипцов в левую руку. Возьмите пару наклонных тонких щипцов, используя правую руку. Вставьте правую руку щипцов в текущем же положении, в котором были разбиты соединительной ткани. И затем придерживаться правильных щипцов руку через, под сосуды.
6. В то же время, вставить левую руку щипцов в соединительной ткани на левой стороне сосудов для руководства правой руки пинцет, проходящие через.
7. После того, как правая рука Щипцы получает под сосуды, пытаются отделить суда от окружающих тиСГУП немного больше, а затем держать их на вершине правой руки щипцов.
8. Используйте левую щипцов для рук, чтобы доставить кончик 4-0 шелковой нити к правой руке пинцетом, а затем потяните нить осторожно и медленно через под сосуды. Примечание: В настоящее время обе общие вены и артерии сосуды вознесен швом (рисунок 2).

4. Инъекции и после инъекции Care

1. Подготовка клетки для инъекций в 31 G инсулиновый шприц. С помощью 100 мкл суспензии клеток в PBS на инъекцию. Убедитесь в том, чтобы пипеткой вверх и вниз несколько раз, чтобы отделить клетки и избежать агрегации, так что введенные клетки не засоряют и блокируют кровоток.
2. С помощью угловых пинцетом в левой руке, положить щипцов под судов по руководством шовного материала, а затем откройте две руки пинцета, имея сосуды проводятся осторожно пинцетом.
   Примечание: Интервал между двумя рукавами пинцетом будет ясайт njection.
3. Держите 31 G иглу 100 мкл суспензии клеток в правой руке, со скосом иглы вверх, готовый для инъекций.
4. Вставьте иглу в просвет артерии (кровь будет ввести кончик иглы). Затем надавите клеточную суспензию медленно вводить клетки. Суспензию клеток оттолкнет красной крови в сосуде. Постарайтесь, чтобы не сломать сосуды или утечки суспензии клеток вне.
5. Когда впрыск закончен, осторожно потяните назад иглу и продолжайте удерживать сосуды вверх на левой руке пинцетом, чтобы остановить кровотечение. Затем отодвигать швом.
6. Отодвигать левый пинцетом руки, и быстро использовать ватный тампон, чтобы нажать на область разреза артерии, чтобы остановить кровотечение.
   Примечание: Как правило, 5 - 10 мин постоянное давление достаточно, чтобы остановить кровотечение.
7. Когда кровотечение останавливается, использовать клей кожи, чтобы закрыть кожу края области хирургии. Сделать ушной тег, и проверьте биолюминесценции сигнализации для изучения распределения инжектированных клеток. <бр /> Примечание: Успешная инъекция приведет к изображение , похожее на рисунок 3.
   1. Проверить сигнализацию биолюминесценции путем инъекции 100 мкл 15 мг / мл в PBS люциферин при 75 мг / кг концентрации мыши через внутри орбитального синуса.
      1. Для внутридневных-орбитальным инъекции, положил пальцы на обеих сторонах глаза мыши, использовать давление, чтобы сделать глаз мяч слегка выскочить из рамы глаза, вкладыш 28 G иглы инсулиновый шприц между глазного яблока и носа, а затем медленно толкать шприц, чтобы впрыснуть люциферин ,
         Примечание: При правильном положении, игла должна быть в состоянии достигнуть глубину 2 - 3 мм до попадания твердых тканей (кости).
      2. Поместите мышь в системе формирования изображения в естественных условиях для всего животного изображения в течение 10 - 60 секунд в течение 5 минут (смотрите рисунок 3).
         Примечание: Необязательное процедура имплантировать эстрадиола гранул в заднюю часть животных, чтобы обеспечить дополнительное эстрадиол. Это позволит ускорить рост ER + раковых клеток (например, MCF-7клетки) ^15.
8. Оставьте мышь на теплую грелку, пока он не просыпается. Монитор кровотечение, отек, признаки зияние и боли во время послеоперационного периода. Положите мышей обратно в клетку с покрытием болеутоляющего (carprofin диетическая добавка рекомендуется) не дается для лечения боли, пока никаких признаков боли. Обратите особое внимание и заботу к животным в течение 7 дней после операции.

5. Мониторинг роста Метастатическим

1. Гистоморфометрия:
   1. Урожай несущих опухоль костной ткани, фиксируют кости в 4% параформальдегида в течение 24 ч, затем декальцинировать их в рН 7,0 14% раствор ЭДТА в течение 3 - 5 дней, и подвергать их в парафин , как описано выше ^14.
   2. Раздел парафиновые-встраивать костные ткани при толщине 3 мкм и выполнить стандартный гистологический метод гематоксилин / эозином , как описано выше ^14.
2. Immunohistochemisпытаться:
   1. Тема парафин подшипник опухоль кости скользит по иммуногистохимии окрашивания для различных целей , как описано выше ^14. Вкратце, immunostain раковых клеток MCF7 анти-GFP антитела и immunostain остеогенных клеток (пре-остеобластов и остеобластов) анти-Osterix антител и анти-щелочной фосфатазы (ALP) антител, соответственно.

Результаты

На рисунке 1 показана анатомическое расположение и взаимосвязь общей подвздошной артерии (красный) и вены (синий).

На рисунке 2 показано относительное положение подвздошных сосудов и нервов при рассечение микроскопии. Как показано на рисунке 2А, сосуды и нервы прямо под брюшной стенкой и может быть раскрыта после того , как разрез кожи и брюшины отталкивается. Общей подвздошно...

Обсуждение

Хотя только подвздошной артерии является мишенью для инъекций для раковых клеток, мы рекомендуем разделение обеих подвздошной вены и артерии от окружающих тканей, а также поднять их вместе в виде пучка. Это происходит потому, что вены и артерии широко контактируют друг с другом, и венозной стенки сосуда тонкая и легко сломать. Таким образом, для успешной инъекции, он экономит время и усилия, чтобы задержать два судна вместе, хотя раковые клетки вводят только в артерии. 4-0 шелковый шов используется , чтобы помочь этому ...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Materials
DMEM	HyClone	SH30022.01
FBS	Gibco	16000
Pen/Strep Amphatericin B	Lonza Biowhittaker	17-745E
PBS	Lonza Biowhittaker	17-516F
Trypsin/EDTA раствор	HyClone	SH30042.01
45 μ М-клеточный фильтр	VWR International Laboratory	195-2545
MediGel CPF с карпрофеном	Контролируемый предмет от ветеринарной помощи в BCM		Для обезболивания
Бупренорфин	Контролируемый предмет от ветеринарной службы в BCM		Для обезболивания
Эстрадиол в гранулах	Инновационные исследования Америки	SE-121
Кетамин и ксилазин	Контролируемый предмет от ветеринарной помощи в BCM
Ветеринарная мазь	Контролируемый предмет от ветеринарной помощи в BCM		Избегайте сухости глаз
Бритва	Oster	78005-050	Для пушистые мыши
Изопропилэтанол	ACROS	67-63-0
Бетадин хирургический скраб	Контролируемый предмет из ветеринарной помощи в скальпелевых лезвиях BCM
#10	Ted Pella, Inc	549-3CS-10	Множественная
ручка No 3	Ted Pella, Inc	541-31	Необходимо автоклавировать
Стерильная хирургическая простыня	Sai Infusion Technology	PSS-SD1
Прямой щипцы	Хирургический инструмент Roboz	RS-5132	Необходимо автоклавирование
Прямые тонкие щипцы	Инструменты для тонкой науки	11253-20	Необходимо автоклавирование
Тонкие щипцы с краями	Инструменты для тонкой науки	11253-25	Необходимо автоклавирование
4-0 Шелковый шов Vicryl	Johnson & Johnson Health Care	J214H
31 г инсулиновые шприцы	BD	328418	Многократные
ватные палочки ватные палочки (стерильные)	VWR International Laboratory	89031-272
Клей для кожи	Henry Schein Animal Health	31477	Для закрытия кожи в месте операции
Аппликатор ушных бирок	Fine Science Tools	24220-00
Ушные бирки	Fine Science Tools	24220-50
D-люциферин	Gold Biotechnology	LUCK	Избегайте света и положите на лед
инсулиновые шприцы 28 г	BD	329410	Для внутриорбитального введения
Paraformadehyde	Alfa Aesar	30525-89-4	Для фиксации тканей
EDTA	OmniPur	4050	Для декальфикации костной ткани
< strong>Название<	strong>Company	>Номер в каталоге	Комментарии
Оборудование
Dissection микроскоп	Leica	Leica S6E стерео
IVIS Lumina II Система визуализации	Advanced Molecular Vision
Name<	strong>Company	Номер в каталоге	Комментарии
>Антитела
Anti-GFP антитела (JL-8)	Clontech	632381
Анти-ALP антитела	Abcam	ab108337
Anti-Osterix антитела	Abcam	ab22552