Этот протокол подготовлен для того, чтобы поделиться нашим методом выделения коронарных эндотелиальных клеток мышей с целью визуализации или проведения молекулярно-биологических экспериментов.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Выделение мыши ишемическая эндотелиальных клеток
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Эндотелиальные клетки выстилают внутреннюю стенку кровеносных сосудов и играют важную роль в регуляции сосудистого тонуса, проницаемости сосудов и новой сосудистой формации. Эндотелиальной дисфункции клеток вовлечена в развитие и прогрессирование многих сердечно-сосудистых заболеваний, в том числе ишемической болезни сердца. Для изучения функции и характеристики коронарных эндотелиальных клеток, клеток изоляции является первым шагом, и это требует высокой степени чистоты и количества для проведения последующих экспериментов. Этот протокол описывает эффективный метод, чтобы изолировать взрослых мышей коронарные эндотелиальные клетки. Сердце мыши рассекают и измельчали на мелкие кусочки. После того, как переваривание сердца с помощью диспазу и коллагеназы II, клетки промывали и инкубировали с магнитными шариками, которые сопрягаются с анти-CD31 антителом. Шарики с эндотелиальные клетки промывают несколько раз и готовы к использованию в различных приложениях, в том числе изображений и молекулярно-биологической experimeNTS. Эффективная изоляция дает приблизительно 10 4 клеток на одно сердце с чистотой более 90%.
Введение
Мышиные модели различных сердечно-сосудистых заболеваний и нарушений обмена веществ несут физиологические и молекулярные изменения, которые аналогичны тем, которые встречаются у пациентов. Кроме того, генетическое изменение мышей является мощным инструментом, который позволяет исследовать патогенную роль специфических генов в развитии и прогрессировании заболеваний. В настоящее время, ген-забивные камерного типа специфических или отъезда мышей легко образуются во многих лабораториях и измерения мРНК и уровня белка в определенных типах клеток является первым шагом в определении того, мыши были действительно генетически модифицированы.
Эндо....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Исследования на мышах было одобрено животных по уходу и использованию комитета (Institutional IACUC) из Университета штата Аризона и по проводили в соответствии с Национальным институтом здоровья (NIH) руководящих принципов.
Примечание: В разделах 1, 2 и 3 следует проводить за день до начала эксперимента в качестве установки.
1. приготовления растворов
- CD31 буфер (50 мл)
- Добавить 50 мл 1 × забуференного физраствора (PBS) в 50 мл пробирку. Взвешивают 0,05 г бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 0,037 г этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) и добавляют к 50 мл трубку и положить трубку, чтобы вращаться в течение приблизительно 1 ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Успешное выделение коронарных эндотелиальных клеток из сердца мыши обычно дает около 10 4 клеток с более чем 90% чистоты с помощью формы булыжник. Для получения чистой популяции эндотелиальных клеток, следует соблюдать осторожность в течение всего протокола для обеспечения стерильной среде, свободной от каких-либо загрязнений. Появление удлиненных клеток или увеличенных клеток в популяции указывает на загрязнение с другими типами клеток, клеток и фибробластов гладкой мускулату.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Наиболее широко используемые эндотелиальные клетки в исследовании являются эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVECs) из-за их удобства и простоты культивирования. Тем не менее, много исследований требует наличия физиологической модели достигается за счет выделения эндотелиальных клеток от других конкретных органов 10. Эндотелиальные клетки составляют очень незначительную популяцию клеток в ткани сердца; их изоляция и культивирование может оказаться очень трудным.
Есть .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Эта работа была поддержана грантом Национального института здоровья (HL115578 А. Макино).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| BSA | Sigma | A3311-10G | |
| EDTA | Fisher | BP120-500 | |
| HBSS | Fisher | SH3026801 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H4034-500G | |
| Бикарбонат натрия | Sigma | S5761 | |
| D-(+)-глюкоза | Sigma | G7021-1KG | |
| DynaBeads сковорода для мыши IgG beads | Thermo Fisher Scientific | 11035 | |
| Антитело к мышам CD31 | BD Biosciences | 550274 | |
| IFCS | Fisher | SH30072.04 | |
| M199 | Диспаза Fisher | MT10060-CV | |
| (нейтральная протеаза) | Worthington Biochemical Corp./Fisher | LS02109 | |
| коллагеназа типа II | Worthington Biochemical Corp./Fisher | LS004176 | |
| глицерин | Fisher | BP381-1 | |
| Igepal | Sigma | I3021-50 мл | |
| Коктейль ингибиторов фосфатазы | Sigma | P0044-1 мл | |
| Коктейль ингибиторов протеазы | Sigma | P8340-1 мл | |
| Гепарин | Sigma | H3149-100KU | |
| FBS | Fisher/Mediatech | MT35010CV | |
| D-Valine | Sigma | V1255-5G | |
| EGS | Corning | 356006 | |
| пенициллин/стрептомицин | Fisher/Mediatech | MT-30-002-CI |
Ссылки
- Michiels, C. Endothelial cell functions. J Cell Physiol. 196, 430-443 (2003).
- Sumpio, B. E., Riley, J. T., Dardik, A. Cells in focus: endothelial cell. Int J Biochem Cell Biol. 34, 1508-1512 (2002).
- Cines, D. B., et al.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
