Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Выделение мыши ишемическая эндотелиальных клеток

11.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/53985

⸱

3 июля 2016 г.

 ,  , 
1Department of Physiology, University of Arizona, Tucson

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол подготовлен для того, чтобы поделиться нашим методом выделения коронарных эндотелиальных клеток мышей с целью визуализации или проведения молекулярно-биологических экспериментов.

Аннотация

Эндотелиальные клетки выстилают внутреннюю стенку кровеносных сосудов и играют важную роль в регуляции сосудистого тонуса, проницаемости сосудов и новой сосудистой формации. Эндотелиальной дисфункции клеток вовлечена в развитие и прогрессирование многих сердечно-сосудистых заболеваний, в том числе ишемической болезни сердца. Для изучения функции и характеристики коронарных эндотелиальных клеток, клеток изоляции является первым шагом, и это требует высокой степени чистоты и количества для проведения последующих экспериментов. Этот протокол описывает эффективный метод, чтобы изолировать взрослых мышей коронарные эндотелиальные клетки. Сердце мыши рассекают и измельчали ​​на мелкие кусочки. После того, как переваривание сердца с помощью диспазу и коллагеназы II, клетки промывали и инкубировали с магнитными шариками, которые сопрягаются с анти-CD31 антителом. Шарики с эндотелиальные клетки промывают несколько раз и готовы к использованию в различных приложениях, в том числе изображений и молекулярно-биологической experimeNTS. Эффективная изоляция дает приблизительно 10 4 клеток на одно сердце с чистотой более 90%.

Введение

Мышиные модели различных сердечно-сосудистых заболеваний и нарушений обмена веществ несут физиологические и молекулярные изменения, которые аналогичны тем, которые встречаются у пациентов. Кроме того, генетическое изменение мышей является мощным инструментом, который позволяет исследовать патогенную роль специфических генов в развитии и прогрессировании заболеваний. В настоящее время, ген-забивные камерного типа специфических или отъезда мышей легко образуются во многих лабораториях и измерения мРНК и уровня белка в определенных типах клеток является первым шагом в определении того, мыши были действительно генетически модифицированы.

Эндотелий представляет собой тонкий один слой эндотелиальных клеток (ЭКС), что линии внутренней стенки сосуда. Эндотелиальные клетки играют важную роль в регуляции сосудистого тонуса, проницаемости сосудов, а также новые сосудистые образования 1,2. Эндотелиальная дисфункция является отличительной чертой многих патологических состояний и изменений в эндотелиальной функции может привести к различным автомобилясосудистых заболеваний 3,4. Таким образом, существенным для изучения функции эндотелиальных клеток в физиологических и патофизиологических условиях.

Есть несколько способов , чтобы изолировать ECs 5-8 и метод изоляции должен быть оптимизирован в зависимости от того, который будет использоваться тканей и видов. Это происходит потому , что КЭ из разных тканей показывают высокий уровень неоднородности по отношению к их поверхности маркеров и экспрессии белка 9. Успешное выделение эндотелиальных клеток часто может быть сложным и требует некоторой степени обучения и практики. После того, как достигнуто, способ выделения предложенного в данном протоколе оказывается стабильной и эффективной.

Общая цель этого метода является получение мыши коронарных (MCECs ECs) высокого качества и количества. Даже при том, что количество клеток, выделенных из сердца меньше, чем клетки, собранные из других тканей с использованием других методов, этот метод все еще обеспечивает ставкуКачество тер. Чистота эндотелиальных клеток в результате популяции превышает 90%. Таким образом, этот метод был бы идеальным для приложений, которые опираются на чисто изолированных эндотелиальных клетках, таких как клетки визуализации.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Исследования на мышах было одобрено животных по уходу и использованию комитета (Institutional IACUC) из Университета штата Аризона и по проводили в соответствии с Национальным институтом здоровья (NIH) руководящих принципов.

Примечание: В разделах 1, 2 и 3 следует проводить за день до начала эксперимента в качестве установки.

1. приготовления растворов

  1. CD31 буфер (50 мл)
    1. Добавить 50 мл 1 × забуференного физраствора (PBS) в 50 мл пробирку. Взвешивают 0,05 г бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 0,037 г этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) и добавляют к 50 мл трубку и положить трубку, чтобы вращаться в течение приблизительно 1 ч до порошка не растворится. Регулировка рН до 7,4, фильтруют через фильтр с размером пор 0,2 мкм в новую 50 мл пробирку, и хранят при температуре 4 ° С до использования.
  2. Ханка сбалансированный солевой раствор (HBSS) с HEPES (500 мл)
    1. Добавьте 1.1915 г HEPES сделать 10 мМ HEPES в растворе HBSS и хорошо перемешать. Измерьте рН и отрегулировать до 7,4. Фильтр и хранить при температуре 4˚C.
  3. раствор 1x Кребса (1 л)
    1. Добавляют 100 мл раствора 10 × Кребса [Таблица 1] в дважды дистиллированной воде в колбу емкостью 1 л. Взвешивают 2,1 г бикарбоната натрия и 2 г D-глюкозы и добавляют в колбу. Смешать и довести общий объем до 1 л
    2. Bubble раствор с 95% O 2/5% CO 2 газа в течение 30 мин и фильтровальной раствора внутри капота. Хранить при температуре 4 ° С и держать на льду во время эксперимента.

2. Подготовка магнитных шариков

  1. Добавляют 1 мл CD31 буфера в каждую 1,5 мл трубки (одна трубка на образец). Смешайте овец против крысиного IgG шарики и добавить соответствующее количество для каждого образца [Таблица 1]. Встряхнуть пробирки энергично 30 раз и поместить их в магнитной пластине в течение 1 мин встряхивания. Откройте трубки в то время как на пластине и складывать решения в ведро.
  2. Добавить 1 мл CD31 буфера в каждую пробирку. Добавьте 2 мкл анти-мышиных анти CD31тела в каждую пробирку и вращать трубы O / N при 4 ° С.

3. автоклавирования

  1. Автоклав все инструменты хирургии и пипеток. Обрежьте концы пипеток, так что есть наконечники с 4-х различных диаметров, от самой широкой до узкой. Приблизительные диаметры для наконечников 3 мм, 2,5 мм, 2 мм и 1,5 мм соответственно. Обрежьте кончики и автоклав за день до 30 мин стерилизации при температуре 121 ° С.
    Примечание: Разделы 4 - 11 должны проводиться на день эксперимента.

4. Решения Готовимся

  1. Приготовьте промывочный буфер, содержащий 2% обогащенные железом телячьей сыворотки (МФХБ) в M199. Для получения изображений, подготовить 30 мл / мышь.
  2. Готовят раствор фермента (10 мл / образец). Взвешивают 0,6 ед / мл диспаза и 1 мг / мл коллагеназы типа II в 50 мл пробирку. Добавить M199 и вращать трубу при температуре 4 ° С в течение 15 мин. Смесь фильтруют через фильтр 0,2 мкм в новую 50 мл трубки insidе капот и держать при температуре 4 ° С до использования.
  3. Приготовьте HBSS / HEPES с гепарином. Добавьте 10 мл HBSS с 10 мМ HEPES в 15 мл пробирку. Добавьте 100 мкл гепарин в пробирку и хранить при температуре 4 ° С до использования.

5. Стиральная Бусы

  1. Выньте пробирки с бусинами из ротатора при 4 ° С и привести к капоту. Место труб в магнитной пластины и встряхивают в течение 1 мин. Свалка раствора и добавляют 1 мл буфера CD31 в каждую пробирку.
  2. Возьмите трубы из магнитной пластины и энергично встряхивают в 30 раз. Поместите трубки обратно в магнитной пластины и повторить в общей сложности 3 стирок. После завершения, поместите пробирки обратно в 4С и держать вращая до использования.

6. Вскрытие

  1. Впрыскивать мышей внутрибрюшинно 0,1 мл гепарин для предотвращения свертывания крови. Подождите 10 минут, а затем обезболить мышей с использованием внутрибрюшинную инъекцию 0,01 мл пентобарбитала. Проверьте, если мышь чувствуетболи, зажимая ногу.
  2. Поместите мышь на полистирольной доске с головы и держать руки иголками. Используйте пинцет и жесткие-CUT-ножницы, чтобы разрезать кожу на верхней грудной области до горла.
  3. Делают разрез в центре грудной клетки, как раз над диафрагмой. Вырежьте кость в сторону и вверх по направлению к горлу, чтобы сделать треугольник, раскрывающую сердце и легкие. Вырезать аорту чуть выше диафрагмы.
  4. Держите тимус с пинцетом, не вытаскивая и использовать ножницы, чтобы тщательно вырезать любой соединительной ткани, чтобы удалить легкие и сердце вместе. Место ткани в химическом стакане с 1 × Кребса, трясти с пинцетом и передать 6 см блюдо с 1 × Кребса.
  5. Удалите долей легких с помощью ножниц и щипцов. Вставьте 20 G стерильный катетер в аорту. Промойте кровь в коронарной системы кровообращения с HBSS / гепарин. Сделайте небольшой разрез в желудочке, трясти сердце и переносят в пробирку из M199. Хранить трубы на льду.
класс = "jove_title"> 7. Ткань Переваривание

  1. Перенести сердце на 6 см чашку, наполненную 10 мл раствора фермента и фарша его на мелкие кусочки с помощью ножниц. Поместите посуду в 37 ºC инкубаторе в течение 15 мин. Перемешайте переваривается материалы пипетированием вверх и вниз 30 раз через наконечник с конца разреза, чтобы ткань, чтобы пройти через легче.
  2. Положите его обратно в 37 ºC инкубаторе в течение еще 15 мин. Повторите агитацию в три раза, каждый раз с помощью пипеток из самых больших отверстий в узком и 15 мин инкубации между собой.
  3. После последней 15-минутной инкубации, берут пробы, и в капот. Пипеткой решение вверх и вниз 30 раз, используя пипеткой наконечник с отверстием и узкому проходят через 40 мкм клеточный фильтр с в новый 50 мл пробирку.
  4. Мойте блюдо с буфером для промывки 10 мл с помощью 10 мл пипетки и переносят на клеточный фильтр. Поместите 50 мл пробирки в центрифуге и спина при 400 г в течение 10 мин при комнатной температуре.
Заголовка "> 8. Стирка и Сопряжение с бисером

  1. Удалить супернатант, не нарушая гранул. Вымойте клеток с буфером для промывки 5 мл дважды.
  2. Получить один из предварительно приготовленный 1,5 мл пробирки с бисером и работы на одной трубе одновременно. Положите одну 1,5 мл трубки в магнитной пластине, встряхнуть 3 раза и открыть его.
  3. После последнего центрифугирования, удалить как можно больше супернатант насколько это возможно, не нарушая гранул. Разъединить сгустки клеток Смахивающее энергично.
  4. Добавить 1 мл промывочного буфера в 50 мл пробирку и смешать клетки с 1 мл пипетки. Дамп раствора из 1,5 мл трубки и прибавляют 1 мл клеточной суспензии из 50 мл пробирку с гранулами. Флик трубок 30 раз затем, вращая при 4 ° С в течение 30 мин.

9. Подготовка к клеточной культуре / визуализации

  1. Подготовка камеры для металлизации ячеек. Добавить раствор желатина (5% вес / объем, 300 мкл) в камере и для покрытия поверхности и инкубировали в течение 30 мин при 37 ° С. После инкубации РЗМОве желатин и сухой поверхности.
  2. Выньте пробирки с бисером / клеток через 30 мин вращения и положить в магнитной пластины внутри вытяжки. Встряхивают в течение 2 мин, свалка и добавьте 1 мл промывочного буфера.
  3. Возьмите трубы из пластины, энергично встряхивают 30 раз, то Флик в 30 раз. Положите их обратно в магнитную пластину и встряхивают в течение 1 мин. Повторить 4 раза в общей сложности 5 промываний, но с 1 мин встряхивая на тарелке.
  4. После последней промывки, вынуть одну трубку и работать на каждой трубке по одному за раз. Взболтать 30 раз затем вылить в 30 раз. Положите его на магнитную пластину и встряхивают в течение 1 мин. Свалка и добавить 1 мл 20% СМИ МФХБ EC (предварительно нагревают при 37 ° С).
  5. Энергично встряхивают 30 раз затем вылить в 30 раз. Отрегулируйте пипетку до 500 мкл и пипеткой вверх и вниз 10 раз. Перенести 500 мкл в каждую камеру.
  6. Помещенный при 37 ºC инкубатора и оставить O / N. На следующий день, мыть клетки с 10% FBS СМИ ЕС.

10. Подготовка к вестерн-блот (ВБ) Образцы

  1. Takе из пробирки с бисером / клеток через 1 ч вращения. Поместите их в магнитную пластину и встряхивают в течение 2 мин. Свалка супернатант и добавляют 1 мл холодного HBSS. Энергично встряхивают 30 раз затем вылить в 30 раз. Повторите дважды в течение 3 стирок, но с 1 мин встряхивая на тарелке.
  2. После последней промывки, положить трубы на магнитной пластине и встряхивают в течение 1 мин. Удалить буфер с помощью пипетки и лизиса клеток для WB с использованием метода ранее описанного 11,12. Собранная лизат обычно содержит около 30 мкг белка.

11. обработки изображений

  1. Промыть клетки 3 раза с помощью средств массовой информации, с конечным объемом 250 мкл для камеры. Добавить 1,5 мкл Dil-AcLDL к клеткам. С этой точки зрения, сохранить клетки в темноте.
  2. Инкубируют в течение 3,5 ч при 37 ° С. Добавить 1,5 мкл Hoechst, хорошо перемешивают и инкубируют в течение 30 мин при 37 ˚C.Wash клеток с PBS и зафиксировать 4% параформальдегида (PFA) в течение 20 мин при комнатной температуре.
  3. Промыть два раза с PBS и блокируют с 5% BSA-PBS в течение 30 мип при комнатной температуре. Промыть два раза с 1% BSA-PBS. Развести BS-лектин-FITC с использованием 1% BSA-PBS, до концентрации 2 мкг / мл и добавляют по 300 мкл в каждую камеру.
  4. Поместите камеру на орбитальном шейкере при комнатной температуре в течение 30 мин. Мытье с PBS 3 раза.
  5. Визуализируйте клетки под флуоресцентным микроскопом с временем экспозиции 200 мс для FITC (лектина окрашивания, с маркером ЕС, возбуждение / излучения 488 нм / 519 нм), 30 мс для DAPI (Hoechst, ядерное окрашивание, возбуждения / эмиссии при 358 нм / 461 нм), и 300 мс для TRITC (AcLDL окрашивания, с маркером ЕС, возбуждения / эмиссии при 557 нм / 576 нм). Получение изображений с использованием 20X объектив.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Успешное выделение коронарных эндотелиальных клеток из сердца мыши обычно дает около 10 4 клеток с более чем 90% чистоты с помощью формы булыжник. Для получения чистой популяции эндотелиальных клеток, следует соблюдать осторожность в течение всего протокола для обеспечения стерильной среде, свободной от каких-либо загрязнений. Появление удлиненных клеток или увеличенных клеток в популяции указывает на загрязнение с другими типами клеток, клеток и фибробластов гладкой мускулату...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Наиболее широко используемые эндотелиальные клетки в исследовании являются эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVECs) из-за их удобства и простоты культивирования. Тем не менее, много исследований требует наличия физиологической модели достигается за счет выделения эндотелиальных клеток от других конкретных органов 10. Эндотелиальные клетки составляют очень незначительную популяцию клеток в ткани сердца; их изоляция и культивирование может оказаться очень трудным.

Есть ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантом Национального института здоровья (HL115578 А. Макино).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
BSASigmaA3311-10G
EDTAFisherBP120-500
HBSSFisherSH3026801
HepesSigma-AldrichH4034-500G
Бикарбонат натрия SigmaS5761
D-(+)-глюкоза SigmaG7021-1KG
DynaBeads сковорода для мыши IgG beads Thermo Fisher Scientific11035
Антитело к мышам CD31BD Biosciences550274
IFCS FisherSH30072.04
M199Диспаза FisherMT10060-CV
(нейтральная протеаза)Worthington Biochemical Corp./FisherLS02109
коллагеназа типа II Worthington Biochemical Corp./FisherLS004176
глицерин FisherBP381-1
IgepalSigmaI3021-50 мл
Коктейль ингибиторов фосфатазыSigmaP0044-1 мл
Коктейль ингибиторов протеазыSigmaP8340-1 мл
Гепарин SigmaH3149-100KU
FBS Fisher/MediatechMT35010CV
D-ValineSigmaV1255-5G
EGSCorning356006
пенициллин/стрептомицинFisher/MediatechMT-30-002-CI

Ссылки

  1. Michiels, C. Endothelial cell functions. J Cell Physiol. 196, 430-443 (2003).
  2. Sumpio, B. E., Riley, J. T., Dardik, A. Cells in focus: endothelial cell. Int J Biochem Cell Biol. 34, 1508-1512 (2002).
  3. Cines, D. B., et al. Endothelial cells in physiology and in the pathophysiology of vascular disorders. Blood. 91, 3527-3561 (1998).
  4. Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction: testing and clinical relevance. Circulation. 115, 1285-1295 (2007).
  5. Jin, Y., Liu, Y., Antonyak, M., Peng, X. Isolation and characterization of vascular endothelial cells from murine heart and lung. Methods Mol Biol. 843, 147-154 (2012).
  6. Makino, A., Platoshyn, O., Suarez, J., Yuan, J. X., Dillmann, W. H. Downregulation of connexin40 is associated with coronary endothelial cell dysfunction in streptozotocin-induced diabetic mice. Am J Physiol Cell Physiol. 295, C221-C230 (2008).
  7. Marelli-Berg, F. M., Peek, E., Lidington, E. A., Stauss, H. J., Lechler, R. I. Isolation of endothelial cells from murine tissue. J Immunol Methods. 244, 205-215 (2000).
  8. van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., vander Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nat Protoc. 3, 1085-1091 (2008).
  9. Nolan, D. J., et al. Molecular signatures of tissue-specific microvascular endothelial cell heterogeneity in organ maintenance and regeneration. Dev Cell. 26, 204-219 (2013).
  10. Sobczak, M., Dargatz, J., Chrzanowska-Wodnicka, M. Isolation and culture of pulmonary endothelial cells from neonatal mice. J Vis Exp. , (2010).
  11. Makino, A., Dai, A., Han, Y., Youssef, K. D., Wang, W., Donthamsetty, R., Scott, B. T., Wang, H., Dillmann, W. H. O-GlcNAcase overexpression reverses coronary endothelial cell dysfunction in type 1 diabetic mice. Am J Physiol Cell Physiol. 309, C593-C599 (2015).
  12. Sasaki, K., Donthamsetty, R., Heldak, M., Cho, Y., Scott, B. T., Makino, A. VDAC: old protein with new roles in diabetes. Am J Physiol Cell Physiol. 303, C1055-C1060 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

CD31
Выделение мыши ишемическая эндотелиальных клеток
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.