Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Разработка Этанол-индуцированной фиброзных модели печени в данио рерио для изучения прогениторных клеток-гепатоцитов опосредуется Регенерация

8.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54002

⸱

13 мая 2016 г.

 ,  , 
1School of Biology, Parker H. Petit Institute for Bioengineering and Bioscience, Georgia Institute of Technology

В этой статье

Краткое содержание

Устойчивый фиброз с отложением избыточного количества белков внеклеточного матрикса приводит к циррозу печени. Злоупотребление алкоголем является одной из основных причин тяжелых заболеваний печени. Мы создали индуцированную этанолом фиброзную модель печени рыбок данио-рерио для изучения механизмов и стратегий содействия регенерации гепатоцитов при повреждении, вызванном алкоголем.

Аннотация

Устойчивый фиброз печени с продолжением накопления белка во внеклеточном матриксе (ВКМ) приводит к потере клеточной компетентности печени, что приводит к циррозу печени с гепатоцеллюлярной дисфункцией. Помимо многочисленных печеночных поражений, злоупотребление алкоголем может привести к серьезным проблемам со здоровьем, включая печеночную недостаточность и гепатоцеллюлярную карциному. Тем не менее, идентичность эндогенных клеточных источников, которые регенерируют гепатоциты в ответ на алкоголь, не была должным образом исследована. Более того, лишь в немногих исследованиях была эффективно смоделирована регенерация гепатоцитов на основе повреждения, вызванного алкоголем. Недавно мы сообщили о создании индуцированной этанолом (EtOH) фиброзной модели печени у рыбок данио, в которой печеночные клетки-предшественники (ГПК) давали начало гепатоцитам при почти полной потере гепатоцитов в присутствии фиброгенного стимула. Кроме того, с помощью химического скрининга с использованием этой модели мы идентифицировали несколько малых молекул, которые усиливают регенерацию гепатоцитов. Здесь мы подробно опишем процедуры для разработки модели фиброзной печени, индуцированной EtOH, и для проведения химического скрининга с использованием этой модели у рыбок данио. Этот протокол станет важнейшим инструментом для определения молекулярных и клеточных механизмов регенерации гепатоцитов в фиброзной печени. Кроме того, эти методы будут способствовать потенциальному открытию новых терапевтических стратегий для хронических заболеваний печени in vivo.

Введение

Несмотря на замечательные способности к регенерации гепатоцитов 1, которые являются основным типом клеток паренхимы печени, хронической печеночной недостаточности снижает эту способность, что приводит к печеночной клеток - предшественников (HPC) , зависящему регенерации 2.

Хроническое повреждение печени в основном происходит от злоупотребления алкоголем, хронического вируса гепатита С (ВГС) инфекции 3 и безалкогольной жировой болезни печени (НАЖБП) 4. Это приводит к устойчивому фиброза печени, что связано с накоплением внеклеточного матрикса (ECM) белков. Упорно накопление ECM искажает неповрежденную печеночную архитектуру путем формирования фиброзной рубцовой ткани 5, впоследствии приводит к циррозу печени с высокой заболеваемостью и смертностью. Много попыток было сделано , чтобы смягчить фиброзную реакцию , главным образом, сосредоточив внимание на ингибировании профиброгенных цитокины и активированные миофибробласты 6. Последнее в первую очередь получают из звездчатых клеток печени (НSCS), принцип печени не-паренхиматозные клетки , ответственные за формирование рубцовой печени 4. Тем не менее, регенеративной терапии, которые стимулируют эндогенные клеточные источники, включая HPCS для регенерации гепатоцитов в присутствии устойчивых фиброгенных оскорблений ожидают дальнейшего расследования.

Многие экспериментальные модели фиброза печени были описаны у млекопитающих. Повторные инъекции четыреххлористого углерода (CCl 4) широко используется для индукции фиброза печени у мышей и крыс моделей 7. В сочетании с высоким содержанием жиров (HF) диеты, алкоголь привело к существенному усилению активности профиброгенного экспрессии генов и фиброза печени 8. В то время как стеатоз (липидный накопление) является результатом острого воздействия алкоголя, он делает печень восприимчивой к более тяжелой печеночной травмы 9.

Данио, Danio rerio, стала бесценным позвоночного модельной системы для изучения регенерации. Хотьдругие низшие позвоночные , такие как тритонов и аксолотлей обладают замечательной способностью к регенерации, то данио имеет преимущества по сравнению с другими системами модели в отношении стратегии генной инженерии и визуализации , необходимых для манипулирования потенциальной регенерирующим факторов 10. Данио также представляет собой привлекательную модель для изучения позвоночное алкогольные заболевания печени (ALD) путем простого добавления этанола (этанол) в их воде. Острое воздействие этанола личинок и взрослых данио причиной стеатоз печени 11-13. Когда взрослые данио получил расширенную экспозицию этанола, отложение коллагена наблюдалось с повышающей регуляции фиброзом связанных генов 14. Тем не менее, существует необходимость разработки моделей для изучения регенерации печени в ответ на этаноле в качестве фиброгенным стимула.

В последнее время мы разработали этанол-индуцированной фиброзной модель печени у данио 15. Мы объединили гепатоцитов конкретной системы генетической абляции с лечением в смеси этанол личинками и ADULт данио. Мы создали два трансгенных линий, Tg (fabp10a: CFP-NTR) GT1 и Tg (fabp10a: mCherry-NTR) GT2, в котором Е. coli нитроредуктаза (NTR) слиты с бирюзового и mCherry флуоресцентного белка, соответственно, под контролем гепатоцитов специфических жирных кислот связывающего белка 10А, печени основной (fabp10a) промотор. В этой системе, НТР преобразует нетоксичное пролекарство метронидазола (MTZ) в ДНК между прядей сшивающего агента 16, вызывая явную гибель гепатоцитов. Используя эту модель, мы показали, что популяция клеток печени, которые реагируют на передачу сигналов Notch, преобразованный в гепатоциты в ближайшем отсутствии гепатоцитов и в избытке ECM. Мы обозначены эти клетки в качестве HPCS. Кроме того, с помощью химических экранов, мы идентифицировали молекулы активаторы малые передачи сигналов Wnt и ингибиторы передачи сигналов Notch, которые усиливают регенерацию гепатоцитов в печени фиброзной. Therefoповторно, наша фиброзных модель печени в данио представляет собой превосходную химическую систему скрининга по сравнению с клеточной или системы с учетом культурных скрининга млекопитающих на основе. Она представляет собой систему в естественных условиях со значительным с точки зрения затрат и экономии времени преимущества. Здесь мы опишем подробные процедуры для создания фиброзной модель печени EtOH-индуцированных и для осуществления химических экранов с использованием этой модели в данио. Кроме того, анализ времени курса были проведены, чтобы исследовать, как гепатоцитов регенерации происходит в печени фиброзной. Этот протокол обеспечит бесценным инструментом для изучения механизмов и стратегий усиления регенерации гепатоцитов в печени фиброзной.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Рерио были подняты и размножались с использованием стандартного протокола, который отвечает критериям, изложенным в Национальных институтов здравоохранения и одобренных Технологический институт Джорджии Институциональные уходу и использованию животных комитета.

1. Приготовление растворов

  1. Приготовьте 20 л воды яйцо (взаимозаменяемы с 'эмбрионального среды') для поддержания эмбриональных / личиночной данио. Растворить 1,5 г CaSO 4 и 6 г морской соли мгновенного океана в 250 мл дистиллированной воды. Налить в бутыль, заполненную 20 л дистиллированной воды и перемешивать.
  2. Готовят 1 л 1-фенил-2-тиомочевины (PTU) раствор (20x). Растворить 0,6 г PTU порошка в 1 л дистиллированной воды. Добавить 1 мл маточного раствора на 20 мл раствора эмбриональной среде до конечной концентрации 0,003% в качестве рабочего раствора.
    ВНИМАНИЕ: PTU может привести к системной токсичности после вдыхания или воздействии через кожу. Подготовка и использование в соответствии с надлежащими руководящими принципами обработки.
  3. Готовят 1 л этилового эфира 3-aminobenzoate метансульфонат (Tricaine) раствор (20x). Разведите 4 г порошка Tricaine в дистиллированной воде. Регулировка рН до 7 путем добавления 1 М Трис-буфера (рН 9), и довести конечный объем до 1 л дистиллированной водой. Алиготе в 50 мл и хранят при -20 ° С. Разморозить перед употреблением.
    ВНИМАНИЕ: Tricaine может вызвать потерю чувствительности. Подготовка и использование в соответствии с надлежащими руководящими принципами обработки.
  4. Приготовьте 100 мл личиночной метронидазол (MTZ) рабочего раствора. Сделать свежий 15 мМ раствора MTZ путем растворения 0,25 г MTZ порошка в 0,1% диметилсульфоксида (ДМСО) в 100 мл среды эмбриона. Растворите порошок MTZ полностью энергичном встряхивании. Сделать свежий раствор MTZ и использовать алюминиевую фольгу для предотвращения фотокаталитической деградации MTZ.
    ВНИМАНИЕ: MTZ может вызвать раздражение. Подготовка и использование в соответствии с надлежащими руководящими принципами обработки.
  5. Приготовьте 100 мл личиночной этанол / метронидазол (этанол / MTZ) рабочего раствора. Сделать свежий раствор MTZ и использовать алюминиевую фольгу для предотвращения фотокаталитический деградация MTZ. Добавить 1,5 мл 100% этанола в 100 мл раствора MTZ до конечной концентрации 1,5% непосредственно перед использованием.
  6. Приготовьте 500 мл рабочего раствора для взрослых MTZ. Сделать свежий 10 мМ раствора MTZ путем растворения 0,83 г порошка MTZ в 0,1% ДМСО в 500 мл воды в системе. Растворите порошок MTZ полностью энергичном встряхивании. Сделать свежий раствор MTZ и использовать алюминиевую фольгу для предотвращения фотокаталитической деградации MTZ.
  7. Готовят 1 л PEM буфера. Растворить 30,2 г ТРУБ 0,74 г EGTA и 0,12 г MgSO 4 в дистиллированной воде. Отрегулируйте рН до 7 с помощью NaOH. Довести конечный объем до 1 л дистиллированной водой.

2. Приготовление личиночной данио рерио

  1. Настройка спаривание [Tg (fabp10a: CFP-NTR) gt1; Tg (Tp1: mCherry) jh11] 15,17 взрослых данио с Tg (Hand2: EGFP) PD24 13 взрослых данио в спаривании цистернах. Используйте разделители для проведения приурочен спаривание.
  2. Удалите дivider следующее утро и позволяют рыбе спариваться без прерывания работы. Урожай эмбрионов 2 часа позже, напрягая воды в системе и перенос эмбрионов в 100 мм чашки Петри с эмбрионом среды.
  3. Хранить не более 100 эмбрионов на чашку Петри. Под стереомикроскопа, удалить неоплодотворенные яйца с помощью стеклянной пипетки. Grow эмбрионов при 28 ° С и добавляют фенилтиомочевину (PTU) до конечной концентрации 0,003% после 10 часов-после оплодотворения (ФВЧ) ингибировать развитие пигмента.

3. Этанол, метронидазол Лечение и печени Регенерация на личиночной данио рерио

  1. Готовят свежий раствор этанола путем добавления этанола в эмбрион среде до конечной концентрации 1,5%. Не добавляйте PTU.
  2. Лечить эмбрионов с 20 мл раствора этанола на чашку Петри с 56 до 80 часов после оплодотворения. Накройте чашки Петри с полиэтиленовой пленкой для предотвращения испарения этанола.
  3. Разобраться [Tg (fabp10a: CFP-NTR) gt1; Tg (Tp1: mCherry) jh11 SUP>; Тд (Hand2: EGFP) , PD24] личинки с аналогичным размером печени, как определено выражением CFP, при 80 часов после оплодотворения. Не используйте Tricaine при сортировке EtOH обработанных личинок, так как это приведет к высокой смертности с последующей обработкой EtOH / MTZ. Хранить отсортированный личинок при плотности 30 эмбрионов на чашку Петри.
  4. Подготовьте свежий 15 мМ MTZ в эмбрион среде в 0,1% ДМСО. Добавьте необходимое количество этанола в раствор MTZ, чтобы сделать конечной концентрации 1,5%. Выдержите личинок в 20 мл раствора этанола / MTZ на чашку Петри в течение 24 ч при 28 ° С. Накройте чашки Петри с полиэтиленовой пленкой, чтобы поддерживать концентрацию этанола и с алюминиевой фольгой для защиты от света.
  5. В конце лечения, удалить раствор этанола / MTZ путем переноса личинок на новые чашки Петри со свежей средой эмбриона. Вымойте личинки 3 раза эмбриона среды и держать их в 20 мл эмбриона среде без PTU.
  6. Чтобы разобраться личинок с почти полной абляции гепатоцитов, наблюдать флуоресценциюпод эпифлуоресцентной микроскопом с фильтром КФП при увеличении 80X. Успешные результаты абляции в минимальной CFP флуоресценции в печени и значительно уменьшенный объем печени.
  7. Чтобы избежать смерти EtOH / MTZ обработанных личинок, не используют Tricaine для сортировки. Закрепить личинок для иммунным окрашиванием (смотрите раздел 5) или держать отсортированный личинок в чашках Петри при 28 ° С для дальнейших анализов.

4. Химические экраны в EtOH / MTZ-обработанных личинок данио рерио

  1. Принесите 96-луночные планшеты, содержащие 10 мМ химические запасы в ДМСО (см Перечень материалов для деталей относительно коммерческих химических библиотек) от -80 ° C морозильнике. Покрытие с алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить фотокаталитический разрушение химических веществ. Растаяйте растворы при комнатной температуре с нежным покачиванием.
  2. Подготовка химических растворов путем разбавления 10 мМ маточных растворов с эмбрионом среде до конечной концентрации 50 мкМ (в 96-луночных планшетах: начальным сCreen; в 1,5 мл пробирки: переаттестации). Личинки управления обрабатывали равными концентрациями ДМСО в среде эмбрионов.
  3. Личинки Перевод с почти полным гепатоцитов абляции, которые обрабатывают 1,5% EtOH / 15 мМ MTZ и сортировали, как указано выше, либо 96-луночного (начальный экран) или 24-луночного (Повторная проверка) пластины предварительно заполненные с эмбрионом среде при плотности 5 личинок на лунку. Использование дублирующих скважин для каждого химического вещества.
  4. Удалить эмбрионов среду и добавляют либо 250 мкл (96-луночные планшеты) или 500 мкл (24-луночные планшеты) химических растворов в каждую лунку. Накладки с алюминиевой фольгой и лечить личинок в течение 50 ч при 28 ° С. Проверить химическую-всасывающие личинок ежедневно и удалите мертвых личинок из отдельных скважин.
  5. В конце химической обработки, с тем количеством и / или интенсивность КФП-экспрессирующих гепатоцитов под микроскопом эпифлуоресцентной с CFP фильтром при увеличении 80X. Фотография живой личинки показ расширения или сокращенияd число и / или интенсивность СФП-экспрессирующих гепатоцитов с цифровой камерой для записи.
  6. Сохранение личинок формальдегидом фиксации для конфокальной микроскопии, как описано в разделе 5.
  7. Для повторного тестирования химических веществ, которые способствуют регенерации гепатоцитов на начальном экране, изучить их эффективность при более высоких и более низких концентрациях, чтобы найти наиболее эффективную концентрацию с процедурами, описанными в 4.1-4.5 ( "переаттестации").

5. Личинки данио рерио Фиксирование, Иммунологическое и конфокальной микроскопии

  1. Обезболить личинок путем добавления Tricaine до конечной концентрации 0,02%. Перенести 10-15 личинок в 1,5 мл трубки и промыть один раз фосфатным буферным раствором (PBS). Удалить PBS и добавьте 1 мл свежеприготовленного 2% формальдегида в буфере PEM для фиксации O / N при 4 ° С.
    ВНИМАНИЕ: Формальдегид вызывает раздражение и, как известно, является канцерогеном для человека. Обращаться в химическом вытяжном шкафу.
  2. Откажитесь фиксируя решение правильно, а затем ваSH 3 раза PBS при комнатной температуре. Фиксированные личинки могут быть сохранены в PBS при 4 ° С в течение нескольких дней. Переходя к следующему шагу быстро дает лучшие результаты иммунным окрашиванием.
  3. Осторожно удалите желток и кожу, покрывающую область печени с помощью # 55 пинцета под стереомикроскопа.
  4. Проницаемыми и блокировать личинок в буфере блоков (4% бычьего сывороточного альбумина и 0,3% Тритон Х-100 в PBS) O / N при температуре 4 ° С.
  5. Инкубируйте с кроликом анти-Коллаген I антитела в разведении 1: 100 в буфере блоков O / N при 4 ° С. Промыть 5 раз в течение 15 мин каждый с промывочным буфером (0,3% Тритон Х-100 в PBS).
  6. Выдержите с AlexaFluor 647 конъюгированного ослиного антитела против кролика в разведении 1: 200 в буфере блоков O / N при 4 ° С. Промыть 5 раз в течение 15 мин каждый раз буфером для промывки. Затем промыть один раз PBS.
  7. Аккуратно перенести личинок в стеклах с использованием стеклянной пипетки, а также ориентировать фиксированные личинки с левый боковой стороной вверх. Удалите излишки PBS, используя Kimwipes. Добавить каплю монтажных средств массовойИ уплотнение крышки стекла с лаком для ногтей. Проведение визуализации конфокальной сразу сильно рекомендуется.
  8. Используйте конфокальной систему, оснащенную 40X / 1.3 масла объективом захвата изображения. С помощью лазерной прочности на 20-50%. Захват изображений Z стека с интервалом в 1 мкм.

6. Подготовка взрослых данио

  1. Настройка спаривание [Tg (fabp10a: CFP-NTR) gt1; Tg (Tp1: mCherry) jh11] 15,17 взрослых данио в спаривании танках. Урожай эмбрионов на следующее утро напрягает воды в системе и перенос эмбрионов в 100 мм чашки Петри с эмбрионом среды.
  2. Хранить не более 100 эмбрионов на чашку Петри. Под стереомикроскопа, удалить неоплодотворенные яйца с помощью стеклянной пипетки. Grow эмбрионов при 28 ° С и добавляют PTU до конечной концентрации 0,003% после 10 часов после оплодотворения, чтобы ингибировать развитие пигмента.
  3. В 4 денье, использовать Tricaine обезболить личинок и разобравшись [Tg (fabp10a: CFP-NTR)GT1; Tg (Tp1: mCherry) jh11] личинки. Промойте Tricaine путем изменения в свежих эмбрионов в несколько раз среда. Разрешить личинки восстанавливаться при 28 ° С , пока они не достигнуть нормального сердечного ритма 120-180 ударов в минуту 18.
  4. Приподнять отсортированный личинок 6-12 месяцев на основе стандартной процедуры 19.

7. Этанол, метронидазол Лечение и регенерации печени в взрослых данио

  1. Передача 6-12 месяцев старый [Tg (fabp10a: CFP-NTR) GT1; Tg (Tp1: mCherry) jh11] взрослых данио к спариванию танков с использованием сети. Хранить рыбу при плотности не более 10 особей на танк.
  2. Готовят свежий раствор этанола путем добавления в EtOH системы воде до конечной концентрации 1%. Лечить взрослую рыбу с 500 мл раствора этанола в каждом баке и поддерживать их в 28 ° C инкубатора.
  3. Передача взрослой рыбы на свежий раствор этанола ежедневно, отбрасывания мертвой рыбы пропкак безупречной Biohazard. Постоянно относиться к животным в течение 72 ч перед обработкой MTZ.
  4. Готовят свежий раствор 10 мМ MTZ в воде системы в 0,1% ДМСО. Предварительно нагрейте раствор MTZ в C инкубаторе 28 °. Рассматривать рыбу с 500 мл раствора MTZ в 1 л бак пересечения в течение 8 ч при 28 ° С, защищенном от света месте при помощи алюминиевой фольги.
  5. Соблюдайте каждый час в течение лечения и немедленно удалить мертвую рыбу. Откажитесь мертвой рыбы должным образом как Biohazard. В конце лечения MTZ, промыть MTZ путем перевода животных в свежей воде системы в два раза.
  6. Разрешить животных для восстановления и поддержания их в инкубаторе при температуре 28 ° C. Корма и перечисляют рыбу свежей воды в системе ежедневно до момента времени для анализа.

8. Печень взрослых данио Фиксирование, Иммунологическое и конфокальной микроскопии

  1. Обезболить взрослую рыбу с 0,02% Tricaine и эвтаназии в ледяной воде в течение 15 мин. Пэт рыба сухая на бумажное полотенце и поместить его на секционном мат.
  2. Защиту органов желудочно - кишечного тракта путем удаления кожи и мышц как описано выше 20. Используйте ножницы, чтобы отрезать кожи и основные мышцы вдоль брюха от анального плавника до жаберной крышкой, а затем кзади вдоль боковой стороны рыбы обратно к анального плавника.
  3. Положите рыбу в коническую пробирку 15 мл и мыть один раз PBS. Удалить PBS и добавляют 4 мл свежеприготовленного 2% формальдегида в буфере PEM для фиксации O / N при температуре 4 ° С.
  4. Откажитесь фиксируя решение правильно, и промыть 3 раза PBS при комнатной температуре. Фиксированные образцы можно хранить в PBS при 4 ° С в течение нескольких дней. Переходя к следующему шагу немедленно дает лучшие результаты, иммунное окрашивание.
  5. Dissect весь кишечник печень из полости тела рыбы путем разрезания пищевод. Вставить желудочно-кишечные органы с 4% легкоплавкой агарозы в секционирования плесени.
  6. Используйте vibratome вырезать образцы в поперечном сечении с интервалами 50 мкм в охлажденный льдом PBS, начиная от переднего конца. Передача секции на 6-луночный планшет с PBS, используя # 1 кисть.
  7. Проницаемыми и блок-секций в блоке буфера O / N при 4 ° С.
  8. Инкубируйте с кроликом анти-Коллаген I антитела в разведении 1: 100 в буфере блоков O / N при 4 ° С. Промыть 5 раз, через 15 мин каждый с буфером для промывки.
  9. Выдержите с AlexaFluor 647 конъюгированного ослиного антитела против кролика в разведении 1: 200 в буфере блоков O / N при 4 ° С. Промыть 5 раз, 15 мин каждый раз буфером для промывки и один раз PBS.
  10. Аккуратно перенести разделы на стеклянные слайды, используя # 1 кисточка. Удалите излишки PBS с помощью Kimwipes, добавить каплю крепежных средств массовой информации, а также уплотнение крышки стекла с лаком для ногтей. Проведение конфокальной микроскопии немедленно настоятельно рекомендуется.
  11. Используйте конфокальной систему, оснащенную 40X / 1.3 масла объективом захвата изображения. С помощью лазерной прочности на 20-50%. Захват изображений Z стека с интервалом в 1 мкм.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

На рисунке 1 показано развитие в смеси этанол-индуцированной фиброзной модели печени в личиночной данио. Чтобы оптимизировать протокол для воздействия данио личинок этанола, мы сначала оценивали токсичность этанола. 2,5 дня, после оплодотворения (DPF) личинки подвергались воздействию концентрации этанола 1%, 1,5%, или на 2% в течение 24 ч с последующим одновременным 24 ч этанола обработки / MTZ. Воздействие 2% этанола вызвали высокую смертность, в то время как почти все ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Мы наблюдали ГПЦ-опосредованной гепатоцитов регенерации в EtOH / MTZ обработанных выздоравливающих печенью, предполагая, что даже при наличии значительного количества белков ЕСМ в том числе типа фибриллярный коллаген I, то HPCS сохраняют свою правомочность регенерировать в гепатоцитах. MTZ только обработка не увеличивали осаждение белков ЕСМ значительно, в то время как этанол только обработка не вызывает активацию ГПЦ 15. Используя комбинированное лечение EtOH / MTZ, мы смогли исследовать регенерацию ГПЦ-возб...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Эта работа была частично поддержана грантами от GTEC (2731336 и 1411318), НИЗ (K01DK081351) и НФС (1354837) в CHS Мы благодарим Alem Гиоргис за критическое прочтение рукописи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Гемигидрат сульфата кальция (CaSO4)AcrosAC385355000
Сульфат магния (MgSO4)EMDMX0075
1,4-пиперазиндитансульфоновая кислота (PIPES)Sigma-AldrichP6757
Этиленгликоль-бис(2-аминоэтилевый эфир)-
N,N,N′,N′ -тетрауксусная кислота (EGTA)		Sigma-AldrichE3889
ЭтанолSigma-AldrichE7023200 proof
ФормальдегидFisher ScientificF79-500
Метронидазол (MTZ)Sigma-AldrichM3761
1-фенил-2-тиомочевина (PTU)Sigma-AldrichP7629
3-аминобензойная кислота этиловый эфир (Трикаин)Sigma-AldrichA5040
Фосфатно-солевой буфер (PBS) таблеткиAmrescoE404Растворите одну таблетку со 100 мл дистиллированной воды
Диметилсульфоксид (ДМСО)Sigma-AldrichD2438
Бычий сывороточный альбуминFisherScientific BP1600
Triton X-100Fisher ScientificBP151
Low-Tasable Агароза AmrescoBP165
Библиотека сигнальных соединений стволовых клетокSelleck ChemicalsL210010  Запас mM в библиотеке DMSO
ActiProbe-1K TimtecActiProbe-1K10  Запасы mM в DMSO
SB 415286Selleck ChemicalsS2729Растворите с помощью ДМСО до 10  mM
CHIR-99021Selleck ChemicalsS2924Растворить с ДМСО до 10  mM
Anti-Collagen I антителоAbcamab23730Применение при 1:100 для иммуноокрашивания, реагирует с рыбой
AlexaFluor 647 Donkey anti-rabbit IgG (H+L)Молекулярные зондыA31573Использование при 1:200 для иммуноокрашивания
Монтажная среда (Vectorshield)Vector LaboratoriesH-1400
100 мм Чашка ПетриVWR25384-088
24-лунка пластинаVWR10062-896
ЩипцыFine Science Tools11255-20Dumont #55
Предметное стеклоVWR48312-00375x25 мм
Покровное стеклоVWR48366-04518 мм
Полиэтиленовая пленкаFisher Scientific22305654
Алюминиевая фольгаFisherScientific 1213100
KimwipesKimberly-Clark34155
ВибротомLeicaVT1000 S
СтереомикроскопLeicaM80
Эпифлуоресцентный микроскопLeicaM205 FA
Конфокол МикроскопZeissLSM700

Ссылки

  1. Michalopoulos, G. K. Liver regeneration. J Cell Physiol. 213 (2), 286-300 (2007).
  2. Duncan, A. W., Dorrell, C., Grompe, M. Stem cells and liver regeneration. Gastroenterology. 137 (2), 466-481 (2009).
  3. Shepard, C. W., Finelli, L., Alter, M. J. Global epidemiology of hepatitis C virus infection. Lancet Infect Dis. 5 (9), 558-567 (2005).
  4. Hernandez-Gea, V., Friedman, S. L. Pathogenesis of liver fibrosis. Annu Rev Pathol. 6, 425-456 (2011).
  5. Bataller, R., Brenner, D. A. Liver fibrosis. J Clin Invest. 115 (2), 209-218 (2005).
  6. Kisseleva, T., Brenner, D. A. Anti-fibrogenic strategies and the regression of fibrosis. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 25 (2), 305-317 (2011).
  7. Constandinou, C., Henderson, N., Iredale, J. P. Modeling liver fibrosis in rodents. Methods Mol Med. 117, 237-250 (2005).
  8. Gabele, E., et al. A new model of interactive effects of alcohol and high-fat diet on hepatic fibrosis. Alcohol Clin Exp Res. 35 (7), 1361-1367 (2011).
  9. Lieber, C. S. Alcoholic fatty liver: its pathogenesis and mechanism of progression to inflammation and fibrosis. Alcohol. 34 (1), 9-19 (2004).
  10. Poss, K. D. Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals. Nat Rev Genet. 11 (10), 710-722 (2010).
  11. Jang, Z. H., et al. Metabolic profiling of an alcoholic fatty liver in zebrafish (Danio rerio). Mol Biosyst. 8 (7), 2001-2009 (2012).
  12. Passeri, M. J., Cinaroglu, A., Gao, C., Sadler, K. C. Hepatic steatosis in response to acute alcohol exposure in zebrafish requires sterol regulatory element binding protein activation. Hepatology. 49 (2), 443-452 (2009).
  13. Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. The basic helix-loop-helix transcription factor, heart and neural crest derivatives expressed transcript 2, marks hepatic stellate cells in zebrafish: analysis of stellate cell entry into the developing liver. Hepatology. 56 (5), 1958-1970 (2012).
  14. Lin, J. N., et al. Development of an animal model for alcoholic liver disease in zebrafish. Zebrafish. 12 (4), 271-280 (2015).
  15. Huang, M., et al. Antagonistic interaction between Wnt and Notch activity modulates the regenerative capacity of a zebrafish fibrotic liver model. Hepatology. 60 (5), 1753-1766 (2014).
  16. Curado, S., Stainier, D. Y., Anderson, R. M. Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies. Nat Protoc. 3 (6), 948-954 (2008).
  17. Parsons, M. J., et al. Notch-responsive cells initiate the secondary transition in larval zebrafish pancreas. Mech Dev. 126 (10), 898-912 (2009).
  18. Baker, K., Warren, K. S., Yellen, G., Fishman, M. C. Defective 'pacemaker' current (Ih) in a zebrafish mutant with a slow heart rate. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (9), 4554-4559 (1997).
  19. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. J Vis Exp. (69), e4196(2012).
  20. Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. J Vis Exp. (37), (2010).
  21. Paku, S., Schnur, J., Nagy, P., Thorgeirsson, S. S. Origin and structural evolution of the early proliferating oval cells in rat liver. Am J Pathol. 158 (4), 1313-1323 (2001).
  22. Turner, R., et al. Human hepatic stem cell and maturational liver lineage biology. Hepatology. 53 (3), 1035-1045 (2011).
  23. Kodama, Y., Hijikata, M., Kageyama, R., Shimotohno, K., Chiba, T. The role of notch signaling in the development of intrahepatic bile ducts. Gastroenterology. 127 (6), 1775-1786 (2004).
  24. Ryback, R., Percarpio, B., Vitale, J. Equilibration and metabolism of ethanol in the goldfish. Nature. 222 (5198), 1068-1070 (1969).
  25. Mathias, J. R., Saxena, M. T., Mumm, J. S. Advances in zebrafish chemical screening technologies. Future Med Chem. 4 (14), 1811-1822 (2012).
  26. Chen, C. H., Durand, E., Wang, J., Zon, L. I., Poss, K. D. zebraflash transgenic lines for in vivo bioluminescence imaging of stem cells and regeneration in adult zebrafish. Development. 140 (24), 4988-4997 (2013).
  27. Westhoff, J. H., et al. Development of an automated imaging pipeline for the analysis of the zebrafish larval kidney. PLoS One. 8 (12), e82137(2013).
  28. Perlman, Z. E., et al. Multidimensional drug profiling by automated microscopy. Science. 306 (5699), 1194-1198 (2004).
  29. Chu, J., Sadler, K. C. New school in liver development: lessons from zebrafish. Hepatology. 50 (5), 1656-1663 (2009).
  30. Choi, T. Y., Ninov, N., Stainier, D. Y., Shin, D. Extensive conversion of hepatic biliary epithelial cells to hepatocytes after near total loss of hepatocytes in zebrafish. Gastroenterology. 146 (3), 776-788 (2014).
  31. He, J., Lu, H., Zou, Q., Luo, L. Regeneration of liver after extreme hepatocyte loss occurs mainly via biliary transdifferentiation in zebrafish. Gastroenterology. 146 (3), 789-800 (2014).
  32. Yao, Y., et al. Fine structure, enzyme histochemistry, and immunohistochemistry of liver in zebrafish. Anat Rec (Hoboken). 295 (4), 567-576 (2012).
  33. Yovchev, M. I., Xue, Y., Shafritz, D. A., Locker, J., Oertel, M. Repopulation of the fibrotic/cirrhotic rat liver by transplanted hepatic stem/progenitor cells and mature hepatocytes. Hepatology. 59 (1), 284-295 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

IMTZ
Разработка Этанол-индуцированной фиброзных модели печени в данио рерио для изучения прогениторных клеток-гепатоцитов опосредуется Регенерация
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.