Разработка и определение характеристик In Vitro Микрососудов Сеть и количественные измерения эндотелиальной [Са 2+] я И оксид азота Производство

Sulei Xu; Xiang Li; Yuxin Liu; Pingnian He

doi:10.3791/54014

Method Article

Разработка и определение характеристик In Vitro Микрососудов Сеть и количественные измерения эндотелиальной [Са²⁺]_я И оксид азота Производство

DOI:

10.3791/54014

⸱

May 19th, 2016

Sulei Xu*¹ , Xiang Li*¹ , Yuxin Liu² , Pingnian He¹

¹Department of Cellular and Molecular Physiology, College of Medicine, Penn State University, ²Lane Department of Computer Science and Electrical Engineering, West Virginia University

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Первичные эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVECs) были выращены до слияния в микрофлюидном сетевом устройстве. Были проиллюстрированы соединения эндотелиальных клеток и распределения F-актина, а также количественно оценены изменения внутриклеточной концентрации кальция и продукции оксида азота в ответ на аденозинтрифосфат (АТФ) в режиме реального времени на уровне отдельных клеток.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эндотелиальные клетки (ЭКС) , выстилающие стенки кровеносных сосудов в естественных условиях постоянно подвергается воздействию потока, но культивированные КЭ часто выращиваются в статических условиях и проявляют провоспалительного фенотипа. Хотя развитие микрожидкостных устройств было охвачено инженерами в течение двух десятилетий, их биологические приложения остаются ограниченными. Более физиологически актуально в пробирке микрососудов модель подтверждено биологических применений имеет важное значение для продвижения поля и преодоления разрыва между в естественных условиях и в пробирке исследования. Здесь мы приводим подробные процедуры для развития культурной сети микрососудов с использованием микрожидкостных устройств с долгосрочной возможности перфузионной. Мы также продемонстрировать свои приложения для количественных измерений изменений агонист-индуцированного в ЕС _я и оксид азота (NO) производства ^[2+] Ca в режиме реального времени с помощью конфокальной и обычной флуоресцентной микроскопии. Образовавшийся микрососудов нетторабота с непрерывной перфузии показали хорошо развитые перекрестки между КЧС. VE-кадгерина распределение был ближе к тому, что наблюдалось в интактных микрососудов, чем статически культивированных монослоев ЕС. АТФ-индуцированное кратковременное повышение в ЕС [Са ^2+] и NO производства были количественно измерены на отдельных уровнях клеток, которые валидированных функциональность культивируемых микрососудов. Это устройство позволяет Микрожидкостных КЭ расти под хорошо контролируемым, физиологически соответствующего потока, что делает среда для культивирования клеток ближе к в естественных условиях , чем в обычных статичных 2D культур. Конструкция Микроканал сеть очень универсальна, а процесс изготовления прост и повторяемой. Устройство может быть легко интегрирован в конфокальной или обычной микроскопической системы, позволяющей с высоким разрешением изображения. Самое главное, потому что культивируют сеть микрососудов могут быть образованы первичными человеческими КЧС, этот подход будет служить полезным инструментом для исследования, какпатологически измененные компоненты крови из образцов пациентов влияют на человека ЭКС и обеспечить понимание клинических проблем. Она также может быть разработана в качестве платформы для скрининга лекарственных средств.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эндотелиальные клетки (ЭКС) , выстилающие стенки кровеносных сосудов в естественных условиях постоянно подвергается воздействию потока, но культивированные КЭ часто выращиваются в статических условиях и обладают провоспалительных фенотип ^1,2. Технология микрофлюидики позволяет точно контролировать жидкость через геометрически ограниченных микромасштабная (суб-миллиметровом) каналов ^3, что обеспечивает возможность для культивируемых клеток, особенно для сосудов КЧС, чтобы расти в желаемых условиях потока. Эти особенности делают условия культивирования клеток ближе к в естественных условиях , чем обычные статические 2D культур кл....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Микрожидкостных Изготовление устройств

Стандартный фотолитографии фабрикации SU-8 50 Master Mold
1. Очистите кремниевой пластины перед спин-покрытием. Промыть голую 2 дюйма кремниевой пластины с ацетоном в течение 15 мин, после чего изопропилового спирта (IPA) в течение 15 мин. Обезвоживают пластины, поместив ее на плитке при 150 ° С в течение 1 часа. После обезвоживания, охлаждения пластины при комнатной температуре.
2. Спин-пальто кремниевой пластины с СУ-8 фоторезиста. Добавить 2 мл SU-8 фоторезиста на пластину. Рампа пластины до 500 оборотов в минуту при 100 оборотов в минуту / с ускорением в течение 10 сек, с последующим 1000 оборотов ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом разделе представлены некоторые результаты, полученные с культивированной сети микрососудов, разработанной с этим протоколом. Шаблон Микроканал представляет собой разветвленную сеть три уровня (Рис . 1А) В этой конструкции, а 159 мкм в ширину ветви мать канала на два 126 мкм шириной каналов и ветвей снова в четыре 100 мкм шириной дочерних каналов. 3D - численное моделирование было выполнено для оценки распределения сдвиговых напряжений при скорости.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой статье мы приводим подробные протоколы для развития культурной сети микрососудов, характеристика переходов ЕС и цитоскелета F-актин распределения, а также количественные измерения EC [Ca ^2+] и NO производства с использованием микрожидкостных устройств. Перфузировались Микрожидкостных устройство обеспечивает модель в пробирке , которая позволяет близкое моделирование в естественных условиях микрососудистых геометрии и условий потока сдвига. Поскольку культивируют сеть микрососудо.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют конкурирующие интересы или противоречащие друг другу интересы раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Национальным сердца, легких и крови институт предоставляет HL56237, Национального института диабета, желудочно-кишечных и почечных заболеваний Институт DK97391-03, Национальный научный фонд (NSF-1227359 и EPS-1003907).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
ATP	Sigma-Aldrich	A2383
Ацетон	Fisher Scientific	A929
Biopsy	Punch	Miltex 33-31 AA
Бычий альбумин	MP Biomedicals	810014
экстракт бычьего мозга (BBE)	Lonza	CC-4098
Cover-slip	Fisher Scientific	12-542C
DAF-2 DA	Calbiochem	251505
Dextran	Sigma-Aldrich	31390
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Вторичные антитела	Life technologies	A-11055
DPBS, без кальция, без магния	Gibco	14190-250
DRAQ5 (окрашивание ядер)	Технология клеточной сигнализации	4084
Добавка для роста эндотелиальных клеток (ECGS)	Sigma-Aldrich	E2759-15MG
Фетальная бычья сыворотка	Gibco	16000-044
Фибронектин	Gibco	PHE0023
Fluo-4 AM	Life technologies	F-14201
Желатин из свиной кожи	Sigma-Aldrich	G1890-100G Гентамицин
(50 мг/мл)	Gibco	15750-078
Стеклянный покровный лист	Fisher Scientific	12-548B
Стекло Пастер пипетт	VWR	14672
Гепарин натриевая соль из слизистой оболочки кишечника свиньи	Sigma-Aldrich	H3393-10KU
HEPES Буферизованный солевой раствор	Lonza	CC-5024
Эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVECs)	Lonza	CC-2517
Изопропиловый спирт (IPA)	VWR	89125
L-глютамин (200 мМ)	Gibco	25030-081
Ингредиент
NaCl (132 мМ)	Fisher Scientific	S671-3
KCl (4,6 мМ)	Fisher Scientific	P217-500
CaCl₂ · 2H₂O (2,0 mM)	Fisher Scientific	C79-500
MgSO₄ · 7H₂O (1,2 мМ)	Fisher Scientific	M63-500
Глюкоза (5,5 мМ)	Fisher Scientific	BP350-1
NaHCO₃ (5,0 мМ)	Fisher Scientific	S233-500
Соль Hepes (9,1 мМ)	Research Organics	6007H
Кислота Hepes (10,9 мМ)	Research Organics	6003H
MCDB 131 Культура Среда	Технологии	10372-019
Параформальдегидная	электронная микроскопия Науки	15710
Фаллоидин (окрашивание F-актином)	Sigma-Aldrich	P1951
Фосфат буферизованный физиологический раствор	Life technologies	14040-133
Полидиметилсилоксан (PDMS)	Dow Corning Corporation	Sylgard 184
Скальпель	Exel Int	29552
Скотч	3M	34-8711-3070-3
Кремниевая пластина	VWR	14672
SU-8 фоторезист	MicroChem	SU-8 2050 Y111072
SU-8 проявитель	MicroChem	Y020100
колбы для культуры тканей	Sigma-Aldrich	Z707503-100EA
Triton X-100	Chemical Book	T6878
Раствор нейтрализатора трипсина	Gibco	R-002-100
Раствор трипсина/ЭДТА (TE)	Gibco	R-001-100
Трубка	Cole-Parmer	трубка из микроотверстия из ПТФЭ, 0,012" ID x 0,030" OD
VE-cadherin	Santa Cruz Biotechnology	SC-6458
Наименование оборудования	Company<	strong>Номер в каталоге	Комментарии/ОписаниеBiosafety
Laminar Hood	NuAire	NU-425 Класс II, тип A2
ПЗС-камера	Hamamatsu	ORCA
Конфокальный микроскоп	Leica	TCS SL
Desiccator	Bel-Art	F42022
Горячая плита	Wenesco	HP-1212
Инкубатор	Forma Scientific	3110
Isotemp печь	Barnstead	3608-5
Литография настольный	Карл Сасс	MA6 Контактная литография
Оптический микроскоп	Nikon	L200 ND & Diaphod 300
Затвор для ПЗС-камеры	Sutter Instrument	Lambda 10-2
Плазменный очиститель	PVA TePla/Harrick Plasma	M4L/PDC-32G
Spin coater	Brewer Science	Cee 200X
Шприцевая насосная система	Harvard Apparatus	703005
Название программного обеспечения	Company	>Номер в каталоге<	strong>Комментарии/Описание
CAD программное обеспечение	Autodesk	AutoCAD 2015
Программное обеспечение для моделирования CFD	COMSOL COMSOL	Multiphysics 4.0.0.982
Получение и анализ изображений для производства NO	Универсальная визуализация	Metafluor

раствора Ringer млекопитающих

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Curry, F. R. E., Adamson, R. H. Vascular permeability modulation at the cell, microvessel, or whole organ level: towards closing gaps in our knowledge. Cardiovasc Res. 87, 218-229 (2010).
Michel, C. C., Curry, F. E. Microvascular permeability. Physiol Rev

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Разработка и определение характеристик In Vitro Микрососудов Сеть и количественные измерения эндотелиальной [Са²⁺]_я И оксид азота Производство

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles