Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Разработка и определение характеристик

8.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54014

⸱

19 мая 2016 г.

 ,  ,  , 
1Department of Cellular and Molecular Physiology, College of Medicine, Penn State University, 2Lane Department of Computer Science and Electrical Engineering, West Virginia University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Первичные эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVECs) были выращены до слияния в микрофлюидном сетевом устройстве. Были проиллюстрированы соединения эндотелиальных клеток и распределения F-актина, а также количественно оценены изменения внутриклеточной концентрации кальция и продукции оксида азота в ответ на аденозинтрифосфат (АТФ) в режиме реального времени на уровне отдельных клеток.

Аннотация

Эндотелиальные клетки (ЭКС) , выстилающие стенки кровеносных сосудов в естественных условиях постоянно подвергается воздействию потока, но культивированные КЭ часто выращиваются в статических условиях и проявляют провоспалительного фенотипа. Хотя развитие микрожидкостных устройств было охвачено инженерами в течение двух десятилетий, их биологические приложения остаются ограниченными. Более физиологически актуально в пробирке микрососудов модель подтверждено биологических применений имеет важное значение для продвижения поля и преодоления разрыва между в естественных условиях и в пробирке исследования. Здесь мы приводим подробные процедуры для развития культурной сети микрососудов с использованием микрожидкостных устройств с долгосрочной возможности перфузионной. Мы также продемонстрировать свои приложения для количественных измерений изменений агонист-индуцированного в ЕС я и оксид азота (NO) производства [2+] Ca в режиме реального времени с помощью конфокальной и обычной флуоресцентной микроскопии. Образовавшийся микрососудов нетторабота с непрерывной перфузии показали хорошо развитые перекрестки между КЧС. VE-кадгерина распределение был ближе к тому, что наблюдалось в интактных микрососудов, чем статически культивированных монослоев ЕС. АТФ-индуцированное кратковременное повышение в ЕС [Са 2+] и NO производства были количественно измерены на отдельных уровнях клеток, которые валидированных функциональность культивируемых микрососудов. Это устройство позволяет Микрожидкостных КЭ расти под хорошо контролируемым, физиологически соответствующего потока, что делает среда для культивирования клеток ближе к в естественных условиях , чем в обычных статичных 2D культур. Конструкция Микроканал сеть очень универсальна, а процесс изготовления прост и повторяемой. Устройство может быть легко интегрирован в конфокальной или обычной микроскопической системы, позволяющей с высоким разрешением изображения. Самое главное, потому что культивируют сеть микрососудов могут быть образованы первичными человеческими КЧС, этот подход будет служить полезным инструментом для исследования, какпатологически измененные компоненты крови из образцов пациентов влияют на человека ЭКС и обеспечить понимание клинических проблем. Она также может быть разработана в качестве платформы для скрининга лекарственных средств.

Введение

Эндотелиальные клетки (ЭКС) , выстилающие стенки кровеносных сосудов в естественных условиях постоянно подвергается воздействию потока, но культивированные КЭ часто выращиваются в статических условиях и обладают провоспалительных фенотип 1,2. Технология микрофлюидики позволяет точно контролировать жидкость через геометрически ограниченных микромасштабная (суб-миллиметровом) каналов 3, что обеспечивает возможность для культивируемых клеток, особенно для сосудов КЧС, чтобы расти в желаемых условиях потока. Эти особенности делают условия культивирования клеток ближе к в естественных условиях , чем обычные статические 2D культур клеток. Они чрезвычайно важны, когда микрофлюидальные устройства используются для моделирования различных типов vasculatures и изучения реакции ЕС на механических и / или химических раздражений.

Несмотря на преимущества, которые показала сеть микроканалов над статической клеточной культуре, адаптации и применения микрофлюидики в биомедицинской FIELD остаются ограниченными. Об этом сообщает в недавнем обзоре, большинство публикаций этой области (85%) все еще ​​находятся в инженерных журналах 4. Производительность микрофлюидальных устройств не было достаточно убедительным для большинства биологи, чтобы перейти от современных методов, таких как анализ Transwell и макромасштабной блюдо культуры / предметное стекло в этом миниатюрном устройстве. Микрофлюидикс представляет собой многопрофильную поля, которое требует междисциплинарного сотрудничества, чтобы переместить это поле вперед. Цель этой технической статьи состоит в том, чтобы уменьшить пробелы в знаниях между дисциплинами и сделать процедуры изготовления понятны биологи, обеспечивая при этом биологические приложения и функциональные проверки микрожидкостных микрососудов. Визуализированных экспериментальные протоколы включают изготовление обоих микрофлюидальных устройств и их биологических коммунальных услуг, что представляет собой тесное сотрудничество между инженерами и биологами.

Недавно мы сообщали некоторыебиологические приложения , использующие сети микрососудов в пробирке с микрожидком устройством 5. Для того, чтобы соответствующим образом спроектировать размеры сети микроканалов и вносящее желаемое напряжение сдвига, численная модель была построена с динамического переноса текучей среды программного обеспечения, чтобы внимательно оценить профиль потока. Первичные Эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVECs) , которые были посеяны в микроканалов достижения слияния, т.е. охватывает всю внутреннюю поверхности микроканала, в течение 3-4 дней с непрерывной перфузии. Правильное формирование барьера была продемонстрирована VE-кадгерина окрашивания и по сравнению с теми, образуются в статических условиях культивирования клеток и в интактных микрососудов. Применяя экспериментальные протоколы , разработанные в индивидуальном порядке увлажненную неповрежденных микрососудов 6-8, мы количественно измеряли изменения в EC [Ca 2+] и оксид азота (NO) производства в ответ на аденозинтрифосфата (АТФ) с люминесцентными вdicators и конфокальной и обычные флуоресцентной микроскопии. Агонист-индуцированный рост EC [Ca 2+] и NO производства были представлены как необходимые внутриклеточные сигналы при воспалительных медиаторов , вызванной увеличением проницаемости микрососудов 6-15. Хотя некоторые предыдущие исследования показали изображения DAF-2 DA нагруженных микрофлюидальных устройств 16,17, соответствующее разрешение и анализ данных еще не достиг 18. Насколько нам известно, это исследование демонстрирует первые количественные измерения агонист-индуцированного динамического изменения в эндотелиальной я и NO производства с использованием Микрожидкостных системы на основе [2+ Ca].

Методы микротехнологий гибкость изготовить микроканалы до нескольких микрон и позволяют разрабатывать сложные схемы , чтобы имитировать геометрии микрососудов в естественных условиях. Здесь мы представили типичную сеть микроканальных с тремя уровнями ветвления. ЭтаСеть изготавливается с помощью комбинации фотолитографии, которая выполняется в микроструктур и чистом помещении мягкой литографии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Микрожидкостных Изготовление устройств

  1. Стандартный фотолитографии фабрикации SU-8 50 Master Mold
    1. Очистите кремниевой пластины перед спин-покрытием. Промыть голую 2 дюйма кремниевой пластины с ацетоном в течение 15 мин, после чего изопропилового спирта (IPA) в течение 15 мин. Обезвоживают пластины, поместив ее на плитке при 150 ° С в течение 1 часа. После обезвоживания, охлаждения пластины при комнатной температуре.
    2. Спин-пальто кремниевой пластины с СУ-8 фоторезиста. Добавить 2 мл SU-8 фоторезиста на пластину. Рампа пластины до 500 оборотов в минуту при 100 оборотов в минуту / с ускорением в течение 10 сек, с последующим 1000 оборотов в минуту при 300 оборотов в минуту / с ускорением в течение 30 сек. (См Справочная видео 1)
    3. Предварительно выпекать пластины на горячей плите при температуре 65 ° С в течение 10 мин, затем мягкой выпекать при температуре 95 ° С в течение 30 мин.
    4. Использование УФ-облучения, чтобы преобразовать разработанный образец от маски пленки к фоторезиста спин-покрытием. Печать рисунка на тонкой прозрачной пленки в качестве маски пленки. Поместите маску пленку поверхспин-покрытием фоторезиста и подвергать воздействию УФ - дозой 300 мДж / см 2. (См Дополнительный видео 2)
      Примечание: В этом протоколе, шаблон Микроканал сети (159 мкм широкие маточные каналы разветвления на четыре 100 мкм шириной дочерних каналов) разработан с программным обеспечением CAD. Узор на пленке показан в виде прозрачного поля и остальная часть пленки покрыта черными чернилами. Поскольку СУ-8 является отрицательным фоторезиста, часть фоторезиста, который подвергается воздействию ультрафиолетового излучения будет сшитым и становятся нерастворимыми в растворителе в процессе разработки пресс-формы (этап 1.1.6). После разработки, эта нерастворима часть будет реплицировать разработанный шаблон сети и служит в качестве мастер-форму.
    5. Пост-испечь открытой пластины на горячей плите при температуре 65 ° С в течение 1 мин, затем 95 ° С в течение 10 мин.
    6. Разработка мастер-формы. Использование СУ-8 разработчик в качестве растворителя для удаления неразделанный сшиты фоторезиста. Погрузить вафельные в СУ-8 разработчика в течение 3 мин и смыть IPAв течение 1 мин.
    7. Повторите этот цикл 2-3 развивающихся раза до тех пор, пока нет белого образования полоса (остаток незатвердевший фоторезиста) после того, как полоскании МПА. Осторожно высушить облатку газообразным азотом и исследовать небольшие черты картины под микроскопом. Повторите дополнительные циклы развивающиеся при необходимости.
    8. Жесткий выпекать пластины на горячей плите при температуре 150 ° С в течение 15 мин.
  2. Мягкая литография
    1. Вручную смешать две части (основы и отвердителя) полидиметилсилоксана (PDMS) эластомера на вес. соотношении 10: 1.
    2. Де-газ смесь ПДМС с эксикаторе, связанной с вакуумом в течение 15 мин. В ролях решение PDMS на мастер фоторезиста формы. Толщина PDMS должна быть более 3 мм, чтобы обеспечить стабильное проведение впускные / выпускные трубки. Де-газ в PDMS снова в течение 15 мин, и удалить оставшиеся пузырьки воздуха с газообразным азотом при необходимости. Вылечить PDMS отлиты в печи при температуре 65 ° С в течение 3 ч.
    3. Очистите поверхностьстекло покровное с скотча и очистителя плазмы (30 сек для плазменной обработки). Спин-пальто не-вылечены PDMS (0,5 мл) на покровного стекла по наращивают до 4000 оборотов в минуту при скорости ускорения / сек 500 оборотов в минуту в течение 30 сек. Отверждение PDMS спин покрытием покровное в сушильном шкафу при температуре 65 ° С в течение не менее 30 мин.
    4. Вырежьте и освободить вылеченные PDMS от мастера формы. Затем создают отверстие и выходное отверстие с отверстием диаметром перфоратор 1 мм на дистальном конце маточных каналов.
    5. Бонду устройство к PDMS спин-покрытием покровного стекла. Окислять поверхностей PDMS и покровное с очистителем плазмы в течение 1 мин. После плазменной обработки кислородом, поместите каплю деионизированной воды (ДИ воды) на поверхности склеивания, и поместить эти две части вместе. Выпекать устройство в сушильном шкафу при температуре 65 ° С в течение 30 мин для достижения постоянного соединения.

figure-protocol-1
Справочная Видео 1 (Щелкните правой кнопкой мыши , чтобы скачать).

figure-protocol-2
Справочная Видео 2 (Щелкните правой кнопкой мыши , чтобы скачать).

2. эндотелиальные клетки Посевная и культуры

  1. Стерилизация устройства и фибронектина покрытие
    1. Сохранение гидрофобные свойства поверхности PDMS вокруг впускного / выпускного от окисления. Покройте поверхность PDMS вокруг входного и выходного с небольшими полосками скотча для предотвращения окисления. Эта процедура может предотвратить ДИ воды распространение по всей верхней поверхности устройства во время стадии наполнения (2.1.3).
    2. Рассматривать устройство PDMS с кислородом плазмы FoR 5 мин, чтобы изменить поверхность, чтобы быть гидрофильной, таким образом, облегчают поток текучей среды через микроканалов и предотвратить пузырь захвата в процессе наполнения (2.1.3).
    3. Используйте или шприц с иглой или пипетку, чтобы заполнить устройство с деионизированной водой из впускного канала. Продолжить заполнение до тех пор, пока не будет капелька дистиллированной воды (30-50 мкл), накопленных на выходе. Осмотрите устройство под микроскопом, чтобы проверить, есть ли пузырьки содержащихся внутри микроканала. Удалите излишнюю капли воды на входе и на выходе с бумажной салфеткой.
    4. Стерилизацию устройства в чашке Петри с УФ в течение минимум 3 часов в ламинарным укрытием биологической безопасности. Для предотвращения испарения, закрывайте входное / выходное отверстие с тонким куском PDMS, положить влажную бумажную салфетку в тарелку, и обернуть блюдо с парафильмом.
    5. Покройте устройство с фибронектина. Ополосните устройство сначала с фосфатным буфером (PBS), а затем покрыть его с 100 мкг / мл фибронектина в течение ночи в холодильнике (4 ° С). Поместите каплю раствора на входе, а затем создать отрицательное давление на выходе с вакуумом, шприц с иглой или пипеткой.
    6. Заполните устройство для культивирования клеток. Ополосните устройство с PBS вручную в течение 3-х раз перед загрузкой среды для культивирования клеток. Прогреть прибор в термостате при 37 ° С.
  2. КЭ Посевная и долгосрочный Перфузия
    Примечание: По сравнению с обычной статической культурой 2D EC, в пробирке микрососудов сетевая модель с непрерывной перфузией из среды клеточной культуры ближе к условиям , в естественных условиях. В пробирке микрососудов сети продемонстрировали в этом протоколе может сохраняться до двух недель. Хорошо контролируется перфузия будет постоянно пополнять питательные вещества, удалять отходы, а также предотвращения чрезмерного слияния монослоя EC. Таким образом, он может быть продлен на более длительный срок исследований, имитируя клеточный и гемодинамического среды при различных physiologicaл и патологические состояния.
    1. Смешайте первичные HUVECs в HUVEC культуральной среде (MCDB 131) с 8% декстран (мол вес 70 000). Декстран, используется для повышения вязкости загрузки носителя и достижения лучшего результата посева клеток. Рекомендуемая плотность клеток составляет около 2-4 × 10 6 клеток / мл.
    2. Семенной клеток в устройство. Поместите 10-20 мкл капельку клеток над входом в. Представьте нежный поток либо наклоняя устройство, или капиллярное действие с помощью стеклянной пипетки Пастера на выходе. Ключ для успешной загрузки ячейки, чтобы контролировать скорость потока менее 1 мм / сек в самых маленьких каналов.
    3. Проверьте высев клеток. После первоначального посева, инкубировать устройство в течение 15-20 мин (увлажненной атмосфере 5% СО 2 при 37 ° С) перед проверкой состояния высева под микроскопом. При необходимости выполнить дополнительные нагрузки сотовой ячейки для достижения желаемой плотности клеток.
    4. Осторожно промыть устройство с клеточной культуральной среды (37° С), чтобы удалить декстран. Культура устройство при отсутствии потока в течение первых 6 ч в инкубаторе (5% СО 2 при 37 ° С).
    5. Настройка соединения труб для долгосрочного перфузией. Лента устройство в чашку Петри, чтобы предотвратить движение. Создание небольших отверстий на крышке чашки Петри для подачи и отвода труб вставок. Подсоедините впускной трубки к шприцу с иглой для культивирования клеток перфузией. Подключите выпускной трубы к коллектору отходов.
      Примечание: Поместите устройство и коллектор отходов в культуре клеток инкубатора, при размещении перфузионного насоса вне инкубатора и соединить его с устройством с помощью длинного впускного трубопровода. Скорость перфузии определяется экспериментальной конструкции. В данном устройстве используется скорость перфузии 0,35 мкл / мин и сдвига диапазона напряжений между 1-2 дин / см 2. В соответствии с этим перфузионной состоянии, HUVECs достигают впадения в 3-4 дней.

3. Яmmunofluorescent Окрашивание

  1. Закрепить КЧС в устройстве путем перфузии 2% параформальдегидом в течение 30 мин при 4 ° С с последующим полосканием 1x PBS при комнатной температуре в течение 15 мин и 1% БСА блокирующего в течение 30 мин. Используйте скорость перфузии, которая является такой же, как используемый для культивирования клеток.
  2. Проницаемыми неподвижную ECs для меченых антител с 0,1% тритона Х-100. Заливать устройство с Triton в течение 5-7 мин до этикетке VE-кадгерина, и 3 мин до этикеточной F-актина.
  3. Загрузка антител в устройство. Заливать устройство с 1x PBS в течение 15 минут, чтобы смыть предыдущие решения. Вручную загрузить первичное антитело против VE-кадгерина (анти-коза) в устройство при концентрации 2 мкг / мл (общий объем составляет 20-50 мкл). Храните прибор в холодильнике при температуре 4 ° С в течение ночи. Заливать вторичное антитело (осел анти-коза) с помощью шприца насоса при концентрации 7 мкг / мл в течение 45-60 мин.
  4. Этикетка EC F-актин с фаллоидином. Заливать устройство с 1x PBS фоR 15 мин до ручной загрузки фаллоидина (10 мкг / мл) в течение 7-10 мин.
  5. Этикетка ядра EC (см список материалов).
  6. Ополосните устройство с 1x PBS, и поддерживать его при температуре 4 ° С до обработки изображений.

4. флуоресцентных изображений эндотелиальной [Ca 2+]

  1. Заливать устройство с альбумином (10 мг / мл) раствора -Ringer в течение 15 мин при 37 ° С. Используйте ту же скорость перфузии, которая используется для культивирования клеток. Концентрации всех компонентов раствора альбумина Рингера описаны в список материалов.
  2. Настройка конфокальной системы EC [Ca 2+] визуализации с Fluo-4 утра. С помощью конфокальной микроскопической системы для Ca 2+ визуализации. С помощью аргонового лазера (488 нм) для возбуждения и установить полосу излучения в 510-530 нм. Сбор изображений с целью 25X (погружение в воду, NA: 0,95) на 512 х 512 формат сканирования. С помощью Z-шагом 2 мкм и интервал сканирования для каждого блока Iмаги 20 сек.
  3. Заливать устройство с Fluo-4 AM (5 мкМ) в течение 40 мин при температуре 37 ° С, затем промыть просвете Fluo-4 утра с раствором альбумина Рингера.
  4. Приобретать изображения Fluo-4 загружен микрососудов. Сбор исходных изображений в течение 10 мин. Заливать устройство с АТФ (10 мкМ) и записывать изменения интенсивности флуоресценции (FI) в течение 20 мин.

5. флуоресцентной томографии оксида азота производства

  1. Заливать устройство с раствором альбумина Рингера в течение 15 мин. Используйте скорость перфузии, которая является такой же, как используемый для культивирования клеток.
  2. Настройка системы флуоресцентной томографии для измерения АТФ-индуцированного оксида азота. С помощью микроскопа, оборудованного с 12-битной цифровой ПЗС-камерой и компьютерным управлением затвором для измерения оксида азота в. Используйте 75 Вт ксеноновой лампы в качестве источника света.
    Примечание: Выбор возбуждения и излучения длиной волны для DAF-2 DA интерференционным фильтром (480/40 нм) и дихроичным зеркалом(505 нм) с полосовым барьера (535/50 нм). Используйте 20X объектива (NA: 0,75) для сбора изображений. Чтобы свести к минимуму фотообесцвечивания, установите фильтр нейтральной плотности (0,5 N) перед интерференционным фильтром и ограничить время экспозиции до 0,12 сек.
  3. Нагрузка клеток с ДАФ-2 DA (5 мкМ). Заливать устройство с DAF-2 DA в течение примерно 35-40 мин при температуре 37 ° С. Запишите базовую DAF-2 интенсивности флуоресценции (FI DAF) после первоначальной загрузки.
    Примечание: DAF-2 DA непрерывно присутствует в перфузату в течение всего эксперимента 7.
  4. Собирают DAF-2 изображения. Запишите базовую FI DAF в течение 5 мин. Заливать устройство с АТФ (10 мкМ) и собирают изображения в течение 30 мин с интервалом 1 мин. Соберите все изображения из той же группы клеток в то же фокальной плоскости.

Анализ 6. Данные

  1. Вручную выберите регион интересов (Rois) из собранных изображений на уровне отдельных клеток. каждыйROI занимает площадь одной отдельной клетки, которые могут быть указаны в общих чертах флуоресценции.
  2. Вычтите фоновой флуоресценции и вычислить среднее FI каждого трансформирования.
  3. Мера АТФ-индуцированные изменения в EC [Ca 2+] и NO производства. Количественно АТФ-индуцированные изменения в EC [Ca 2+] путем расчета изменения в Fluo-4 FI (FI / FI 0 * 100, где 0 FI является средним базовым ФП во время альбумин-Ringer перфузии перед добавлением АТФ) минус измеренное задний план. Не Количественно NO скорость производства путем проведения первого дифференциального преобразование FI DAF с течением времени.
    Примечание: Временной ход FI DAF представляет собой кумулятивный производство NO со временем. Таким образом, NO скорость производства не рассчитывается на основе профиля FI DAF под базальную и АТФ стимулируются условия. Детали анализа данных и экспериментальных процедур, были описаны в предыдущей публикации 7.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В этом разделе представлены некоторые результаты, полученные с культивированной сети микрососудов, разработанной с этим протоколом. Шаблон Микроканал представляет собой разветвленную сеть три уровня (Рис . 1А) В этой конструкции, а 159 мкм в ширину ветви мать канала на два 126 мкм шириной каналов и ветвей снова в четыре 100 мкм шириной дочерних каналов. 3D - численное моделирование было выполнено для оценки распределения сдвиговых напряжений при скорости...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этой статье мы приводим подробные протоколы для развития культурной сети микрососудов, характеристика переходов ЕС и цитоскелета F-актин распределения, а также количественные измерения EC [Ca 2+] и NO производства с использованием микрожидкостных устройств. Перфузировались Микрожидкостных устройство обеспечивает модель в пробирке , которая позволяет близкое моделирование в естественных условиях микрососудистых геометрии и условий потока сдвига. Поскольку культивируют сеть микрососудо...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют конкурирующие интересы или противоречащие друг другу интересы раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальным сердца, легких и крови институт предоставляет HL56237, Национального института диабета, желудочно-кишечных и почечных заболеваний Институт DK97391-03, Национальный научный фонд (NSF-1227359 и EPS-1003907).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
ATPSigma-AldrichA2383
АцетонFisher ScientificA929
BiopsyPunchMiltex 33-31 AA
Бычий альбуминMP Biomedicals810014
экстракт бычьего мозга (BBE)LonzaCC-4098
Cover-slipFisher Scientific12-542C
DAF-2 DACalbiochem251505
DextranSigma-Aldrich31390
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Вторичные антителаLife technologiesA-11055
DPBS, без кальция, без магнияGibco14190-250
DRAQ5 (окрашивание ядер) Технология клеточной сигнализации4084
Добавка для роста эндотелиальных клеток (ECGS)Sigma-AldrichE2759-15MG
Фетальная бычья сывороткаGibco16000-044
ФибронектинGibcoPHE0023
Fluo-4 AMLife technologiesF-14201
Желатин из свиной кожиSigma-AldrichG1890-100G Гентамицин
(50 мг/мл)Gibco15750-078
Стеклянный покровный листFisher Scientific12-548B
Стекло Пастер пипеттVWR14672
Гепарин натриевая соль из слизистой оболочки кишечника свиньиSigma-AldrichH3393-10KU
HEPES Буферизованный солевой растворLonzaCC-5024
Эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVECs)LonzaCC-2517
Изопропиловый спирт (IPA)VWR89125
L-глютамин (200 мМ)Gibco25030-081
Ингредиент
NaCl (132 мМ)Fisher ScientificS671-3
KCl (4,6 мМ)Fisher ScientificP217-500
CaCl2 · 2H2O (2,0 mM)Fisher ScientificC79-500
MgSO4 · 7H2O (1,2 мМ)Fisher ScientificM63-500
Глюкоза (5,5 мМ)Fisher ScientificBP350-1
NaHCO3 (5,0 мМ)Fisher ScientificS233-500
Соль Hepes (9,1 мМ)Research Organics6007H
Кислота Hepes (10,9 мМ)Research Organics6003H
MCDB 131 Культура СредаТехнологии10372-019
Параформальдегиднаяэлектронная микроскопия Науки15710
Фаллоидин (окрашивание F-актином)Sigma-AldrichP1951
Фосфат буферизованный физиологический раствор Life technologies14040-133
Полидиметилсилоксан (PDMS)Dow Corning CorporationSylgard 184
СкальпельExel Int29552
Скотч3M34-8711-3070-3
Кремниевая пластинаVWR14672
SU-8 фоторезистMicroChemSU-8 2050 Y111072
SU-8 проявительMicroChemY020100
колбы для культуры тканейSigma-AldrichZ707503-100EA
Triton X-100Chemical BookT6878
Раствор нейтрализатора трипсинаGibcoR-002-100
Раствор трипсина/ЭДТА (TE)GibcoR-001-100
ТрубкаCole-Parmerтрубка из микроотверстия из ПТФЭ, 0,012" ID x 0,030" OD
VE-cadherinSanta Cruz BiotechnologySC-6458
Наименование оборудованияCompany<strong>Номер в каталогеКомментарии/ОписаниеBiosafety
Laminar HoodNuAireNU-425 Класс II, тип A2
ПЗС-камераHamamatsuORCA
Конфокальный микроскопLeicaTCS SL
DesiccatorBel-ArtF42022
Горячая плитаWenescoHP-1212
ИнкубаторForma Scientific3110
Isotemp печьBarnstead3608-5
Литография настольныйКарл СассMA6 Контактная литография
Оптический микроскопNikonL200 ND & Diaphod 300
Затвор для ПЗС-камерыSutter InstrumentLambda 10-2
Плазменный очистительPVA TePla/Harrick PlasmaM4L/PDC-32G
Spin coaterBrewer ScienceCee 200X
Шприцевая насосная системаHarvard Apparatus703005
Название программного обеспечения Company>Номер в каталоге<strong>Комментарии/Описание
CAD программное обеспечениеAutodeskAutoCAD 2015
Программное обеспечение для моделирования CFDCOMSOL COMSOLMultiphysics 4.0.0.982
Получение и анализ изображений для производства NO Универсальная визуализацияMetafluor
раствора Ringer млекопитающих

Ссылки

  1. Curry, F. R. E., Adamson, R. H. Vascular permeability modulation at the cell, microvessel, or whole organ level: towards closing gaps in our knowledge. Cardiovasc Res. 87, 218-229 (2010).
  2. Michel, C. C., Curry, F. E. Microvascular permeability. Physiol Rev. 79, 703-761 (1999).
  3. Rogers, J. A., Nuzzo, R. G. Recent progress in soft lithography. Mater Today. 8, 50-56 (2005).
  4. Sackmann, E. K., Fulton, A. L., Beebe, D. J. The present and future role of microfluidics in biomedical research. Nature. 507, 181-189 (2014).
  5. Li, X., Xu, S., He, P., Liu, Y. In vitro recapitulation of functional microvessels for the study of endothelial shear response, nitric oxide and [Ca2+]I. PLoS One. 10, 0126797(2015).
  6. He, P., Pagakis, S. N., Curry, F. E. Measurement of cytoplasmic calcium in single microvessels with increased permeability. Am J Physiol. 258, 1366-1374 (1990).
  7. Zhou, X., He, P. Improved measurements of intracellular nitric oxide in intact microvessels using 4,5-diaminofluorescein diacetate. Am J Physiol-Heart C. 301, 108-114 (2011).
  8. Yuan, D., He, P. Vascular remodeling alters adhesion protein and cytoskeleton reactions to inflammatory stimuli resulting in enhanced permeability increases in rat venules. Journal of Applied Physiology. 113, 1110-1120 (2012).
  9. He, P., Zhang, X., Curry, F. E. Ca2+ entry through conductive pathway modulates receptor-mediated increase in microvessel permeability. Am J Physiol. 271, 2377-2387 (1996).
  10. Zhou, X., He, P. Endothelial [Ca2+]i and caveolin-1 antagonistically regulate eNOS activity and microvessel permeability in rat venules. Cardiovasc Res. 87, 340-347 (2010).
  11. Zhu, L., He, P. Platelet-activating factor increases endothelial [Ca2+] i and NO production in individually perfused intact microvessels. Am J Physiol-Heart C. 288, 2869-2877 (2005).
  12. He, P., Curry, F. E. Depolarization modulates endothelial cell calcium influx and microvessel permeability. Am J Physiol. 261, 1246-1254 (1991).
  13. He, P., Curry, F. E. Endothelial cell hyperpolarization increases [Ca2+]i and venular microvessel permeability. J Appl Physiol. 76 (1985), 2288-2297 (1994).
  14. Xu, S., Zhou, X., Yuan, D., Xu, Y., He, P. Caveolin-1 scaffolding domain promotes leukocyte adhesion by reduced basal endothelial nitric oxide-mediated ICAM-1 phosphorylation in rat mesenteric venules. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 305, 1484-1493 (2013).
  15. Zadeh, M. H., Glass, C. A., Magnussen, A., Hancox, J. C., Bates, D. O. VEGF-Mediated Elevated Intracellular Calcium and Angiogenesis in Human Microvascular Endothelial Cells In Vitro are Inhibited by Dominant Negative TRPC6. Microcirculation. 15, 605-614 (2008).
  16. Tsai, M., et al. In vitro modeling of the microvascular occlusion and thrombosis that occur in hematologic diseases using microfluidic technology. The Journal of clinical investigation. 122, 408-418 (2012).
  17. Kim, S., Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. Engineering of functional, perfusable 3D microvascular networks on a chip. Lab Chip. 13, 1489-1500 (2013).
  18. D'Amico Oblak, T., Root, P., Spence, D. M. Fluorescence monitoring of ATP-stimulated, endothelium-derived nitric oxide production in channels of a poly(dimethylsiloxane)-based microfluidic device. Analytical chemistry. 78, 3193-3197 (2006).
  19. Zhou, X. P., Yuan, D., Wang, M. X., He, P. N. H2O2-induced endothelial NO production contributes to vascular cell apoptosis and increased permeability in rat venules. Am J Physiol-Heart C. 304, 82-93 (2013).
  20. Lee, P. J., Hung, P. J., Rao, V. M., Lee, L. P. Nanoliter scale microbioreactor array for quantitative cell biology. Biotechnol Bioeng. 94, 5-14 (2006).
  21. Zakrzewicz, A., Secomb, T. W., Pries, A. R. Angioadaptation: Keeping the Vascular System in Shape. Physiology. 17, 197-201 (2002).
  22. Lipowsky, H. H., Kovalcheck, S., Zweifach, B. W. The distribution of blood rheological parameters in the microvasculature of cat mesentery. Circulation Research. 43, 738-749 (1978).
  23. Pisano, M., Triacca, V., Barbee, K. A., Swartz, M. A. An in vitro model of the tumor-lymphatic microenvironment with simultaneous transendothelial and luminal flows reveals mechanisms of flow enhanced invasion. Integr Biol (Camb). 7, 525-533 (2015).
  24. McCann, J. A., Peterson, S. D., Plesniak, M. W., Webster, T. J., Haberstroh, K. M. Non-uniform flow behavior in a parallel plate flow chamber : alters endothelial cell responses. Ann Biomed Eng. 33, 328-336 (2005).
  25. Curry, F. E. Modulation of venular microvessel permeability by calcium influx into endothelial cells. FASEB J. 6, 2456-2466 (1992).
  26. Kojima, H., et al. Detection and imaging of nitric oxide with novel fluorescent indicators: diaminofluoresceins. Anal Chem. 70, 2446-2453 (1998).
  27. Whitesides, G. M. The origins and the future of microfluidics. Nature. 442, 368-373 (2006).
  28. Lamberti, G., et al. Bioinspired microfluidic assay for in vitro modeling of leukocyte-endothelium interactions. Anal Chem. 86, 8344-8351 (2014).
  29. Myers, D. R., et al. Endothelialized microfluidics for studying microvascular interactions in hematologic diseases. J Vis Exp. , (2012).
  30. Smith, A. M., Prabhakarpandian, B., Pant, K. Generation of Shear Adhesion Map Using SynVivo Synthetic Microvascular Networks. Jove-J Vis Exp. , e51025(2014).
  31. Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (iBBB). Lab on a Chip. 12, (vol 12, pg 1784, 2012) 5282-5282 (2012).
  32. Shao, J. B., et al. Integrated microfluidic chip for endothelial cells culture and analysis exposed to a pulsatile and oscillatory shear stress. Lab on a Chip. 9, 3118-3125 (2009).
  33. Yeon, J. H., et al. Reliable permeability assay system in a microfluidic device mimicking cerebral vasculatures. Biomed Microdevices. 14, 1141-1148 (2012).
  34. Golden, A. P., Tien, J. Fabrication of microfluidic hydrogels using molded gelatin as a sacrificial element. Lab Chip. 7, 720-725 (2007).
  35. Zheng, Y., et al. In vitro microvessels for the study of angiogenesis and thrombosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 9342-9347 (2012).
  36. Baker, B. M., Trappmann, B., Stapleton, S. C., Toro, E., Chen, C. S. Microfluidics embedded within extracellular matrix to define vascular architectures and pattern diffusive gradients. Lab Chip. 13, 3246-3252 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Эндотелиальные клеткимикрофлюидное устройствосдвиговый потоккальциевый имиджингконфокальная микроскопияфлуоресцентная микроскопияокрашивание на VE-кадгеринстимуляция АТФ
Разработка и определение характеристик
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.