Оптический Клиринговый нервной системы мыши Центральной использованием пассивных ЯСНОСТИ

Summary

Методы оптического очищения революционизируют способ визуализации тканей. В этом отчете мы описываем модификации оригинального протокола Clear Lipid-exchange Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY), который дает более стабильные и менее дорогостоящие результаты.

Abstract

Традиционно, визуализация тканей требовала, чтобы интересующая ткань была последовательно срезана и визуализирована, подвергая каждый участок ткани уникальным нелинейным деформациям, что значительно затрудняло способность оценивать клеточную морфологию, распределение и связь в центральной нервной системе (ЦНС). Тем не менее, методы оптического очищения меняют способ визуализации тканей. Эти подходы позволяют глубоко проникнуть в препарированные интактные органы, обеспечивая потрясающее понимание структурной организации тканей в здоровом и больном состоянии. Такие методы, как прозрачный липид-обменный акриламид-гибридизированный жесткий визуализационный тканевый гидрогель (CLARITY), достигают этой цели за счет создания матрицы, которая связывает важные биомолекулы, позволяя светорассеивающим липидам свободно диффундировать. Удаление липидов с последующим сопоставлением показателя преломления делает ткань прозрачной и легко визуализируемой в трех измерениях (3D). Тем не менее, электрофоретическое очищение тканей (ETC), используемое в оригинальном протоколе CLARITY, может быть сложно успешно реализовать, а использование запатентованного решения для согласования показателя преломления делает рутинное использование метода дорогостоящим. В этом отчете демонстрируется реализация простого и недорогого протокола оптического очищения, который сочетает в себе пассивную прозрачность для улучшения целостности тканей и 2,2'-тиодиетанол (TDE), ранее описанное решение для согласования показателей преломления.

Introduction

Возможность визуализации полных нейроанатомических структур чрезвычайно ценна для понимания мозга в здоровом и болезненном состоянии. Традиционно, 3D-визуализация требовала разреза тканей для обеспечения осевого разрешения и визуализации глубоких анатомических структур. Этот подход позволяет получать наборы данных с высоким разрешением, но требует сложных методов реконструкции изображений и является очень трудоемким. В результате она была ограничена визуализацией небольших объемов ткани^1-3. Оптический срез, с другой стороны, хорошо подходит для создания 3D-изображений тканей с флуоресцентной меткой с высоким разрешением. Поскольку оптическое сечение по сво....

Protocol

Все эксперименты проводились в соответствии с Уходу за животными и рекомендациями по использованию комитета (IACUC). Thy1-YFP, ПЛП-EGFP и PV-TdTomato мышей использовали для этих экспериментов, но любые мыши, экспрессирующие флуоресцентные белки могут быть успешно очищены и образ.

1. Подготовка ткани

Внимание: параформальдегид (PFA) и акриламид являются токсичными и раздражающими. Выполнение экспериментов с использованием этих реагентов в вытяжном шкафу и с соответствующими средствами индивидуальной защиты (лабораторный халат, перчатки и средства защиты глаз).

1. Жертвоприношение животное в эвтаназии ка....

Results

Визуальное структурной организации мозга имеет решающее значение для понимания того, как морфология и соединения влияют на функцию мозга в норме и при патологии. Оптические методы клиринга позволяют популяции изображения клеток в 3D в неповрежденные ткани, что позволяет нам изучать морфологию и связность слаженно.

Мыши, которые экспрессируют флуоресцентные белки движимый промоторов, специфических для субпопуляций клеток позвол.......

Discussion

Пассивная очистка гидрогелевые срезах тканей (пассивный) CLARITY представляет собой простой и недорогой метод для очистки больших кусков ткани. Такой подход не требует специализированного оборудования и могут быть легко выполнены в контролируемой температурой шейкер. На протяжении нескольких недель, даже большие, высоко мякотных ткани, такие как целого головного или спинного мозга, станет прозрачной и пригодной для микроскопии. Хотя этот доклад сосредоточено на очистке тканей ЦНС, пассивный осветление может быть примене.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x фосфатно-солевой буфер (PBS)	Fisher	BP399-1	буферы
32% параформальдегид (PFA)	Электронная микроскопия Sciences	15714-5	перфузия и гидрогель
2,2'-тиодиэтанол (TDE)	Sigma-Aldrich	166782-500G	раствор для согласования показателя преломления
40% акриламид	Bio-Rad	161-0140	гидрогель
2% бис-акриламид	Bio-Rad	161-0142	гидрогель
ВА-044 инициатор	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	VA044	гидрогель
Борная кислота	Sigma-Aldrich	B7901	очищающий буфер
Додецилсульфат натрия (SDS)	Fisher	BP166-5	очищающий буфер
Гидроксид натрия	Fisher	55255-1	буферы
азид натрия	Sigma-Aldrich	52002-100G	консервант
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-500G
буферы гепарин	Сигма-Олдрич	H3393-50KU	перфузия
нитрат натрия	Фишер	BP360-500	перфузия
DAPI	молекулярные зонды	D1306	ядерное окрашивание
99,9% изофлуран	Феникс	57319-559-06	обезболивающее
гидрохолорическая кислота	Фишер	А1445-500	буферы
Тарелка со стеклянным дном	Willco	HBSB-5040	Посуда Willco
Многоразовый клей	Bostick	371351	Blu-Tack
Силиконовый эластомер	World Precision Instruments	KWIK-CAST	Kwik-Cast
Lint-free салфетка	Kimberly-Clark	34120	KimWipe
Mouse матрица мозга	Roboz	SA-2175	секционная ткань
Матричные лезвия	Roboz	RS-9887	разреза ткани
Перистальтический насос	Cole-Parmer	77122-24	для пефузии
Лазерный сканирующий конфокальный микроскоп	Leica	SP5
Программное обеспечение для визуализации	Leica	LAS AF	микроскопия