Методическая статья

Оптический Клиринговый нервной системы мыши Центральной использованием пассивных ЯСНОСТИ

13.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54025

⸱

30 июня 2016 г.

 ,  ,  , 
1Department of Neurology, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles, 2W.M. Keck Science Department, Claremont McKenna, Pitzer & Scripps Colleges

В этой статье

Краткое содержание

Методы оптического очищения революционизируют способ визуализации тканей. В этом отчете мы описываем модификации оригинального протокола Clear Lipid-exchange Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY), который дает более стабильные и менее дорогостоящие результаты.

Аннотация

Традиционно, визуализация тканей требовала, чтобы интересующая ткань была последовательно срезана и визуализирована, подвергая каждый участок ткани уникальным нелинейным деформациям, что значительно затрудняло способность оценивать клеточную морфологию, распределение и связь в центральной нервной системе (ЦНС). Тем не менее, методы оптического очищения меняют способ визуализации тканей. Эти подходы позволяют глубоко проникнуть в препарированные интактные органы, обеспечивая потрясающее понимание структурной организации тканей в здоровом и больном состоянии. Такие методы, как прозрачный липид-обменный акриламид-гибридизированный жесткий визуализационный тканевый гидрогель (CLARITY), достигают этой цели за счет создания матрицы, которая связывает важные биомолекулы, позволяя светорассеивающим липидам свободно диффундировать. Удаление липидов с последующим сопоставлением показателя преломления делает ткань прозрачной и легко визуализируемой в трех измерениях (3D). Тем не менее, электрофоретическое очищение тканей (ETC), используемое в оригинальном протоколе CLARITY, может быть сложно успешно реализовать, а использование запатентованного решения для согласования показателя преломления делает рутинное использование метода дорогостоящим. В этом отчете демонстрируется реализация простого и недорогого протокола оптического очищения, который сочетает в себе пассивную прозрачность для улучшения целостности тканей и 2,2'-тиодиетанол (TDE), ранее описанное решение для согласования показателей преломления.

Введение

Возможность визуализации полных нейроанатомических структур чрезвычайно ценна для понимания мозга в здоровом и болезненном состоянии. Традиционно, 3D-визуализация требовала разреза тканей для обеспечения осевого разрешения и визуализации глубоких анатомических структур. Этот подход позволяет получать наборы данных с высоким разрешением, но требует сложных методов реконструкции изображений и является очень трудоемким. В результате она была ограничена визуализацией небольших объемов ткани1-3. Оптический срез, с другой стороны, хорошо подходит для создания 3D-изображений тканей с флуоресцентной меткой с высоким разрешением. Поскольку оптическое сечение по своей сути является трехмерным, оно не требует обширных вычислений для создания объема 3D-изображения. Однако рассеяние света и помутнение тканей ограничивают глубину, на которой ткани могут быть оптически разрезаны. Глубина визуализации ограничена примерно 150 мкм при лазерной сканирующей конфокальной микроскопии и менее 800 мкм при использовании двухфотонной возбуждающей микроскопии4-8.

Чтобы преодолеть эти ограничения, недавно было разработано несколько методов оптического очищения, которые затем были усовершенствованы, чтобы обеспечить глубокую микроскопическую визуализацию интактных тканей. Использование бензилового спирта и бензилбензоата (BABB) для придания несъемным тканям прозрачности было одним из самых ранних подходов9. Однако этот подход был ограничен гашением флуоресценции в образцах и неполной очисткой сильно миелинизированных структур10. Усовершенствования этого метода, такие как 3D-визуализация органов, очищенных растворителем (3DISCO), привели к очень быстрому и полному очищению тканей, но все еще страдают от быстрой потери флуоресцентных сигналов, особенно желтого флуоресцентного белка (YFP)10. Решения для очистки на водной основе, такие как Sca/e11 и SeeDB12, сохраняют флуоресцентные сигналы, но не полностью очищают сильно миелинизированные ткани. Четкая, беспрепятственная визуализация мозга и вычислительный анализ (CUBIC) — это новая многообещающая технология оптического очищения, которая, по-видимому, преодолевает ограничения ранее разработанныхрешений для очистки на водной основе. В отличие от других методов оптического очиста, прозрачный липид-обменный акриламид-гибридизованный жесткий визуализационный hYdrogel (CLARITY)14 встраивает мозг в пористую матрицу, которая обеспечивает структурную целостность белков, нуклеиновых кислот и малых молекул, оставляя липиды несвязанными. Затем липиды удаляются электрофоретическим путем, в результате чего мозг становится оптически очищенным, который можно легко визуализировать и так же легко зондировать с помощью общедоступных методов.

Электрофоретическая очистка тканей (ETC) используется для удаления липидов из тканей, встроенных в гидрогель, в CLARITY, однако ETC может быть трудно реализовать последовательно, и ткани, подверженные электрофорезу, могут демонстрировать деформацию тканей, потемнение, потерю флуоресценции и реактивности антител. Пассивное очищение липидов позволяет избежать этих ограничений, но требует увеличения времени выведения15-17. Пассивная очистка также позволяет проводить параллельную очистку большого количества образцов, поскольку она не ограничена количеством доступных аппаратов ETC. Снижение концентрации параформальдегида и исключение бис-акриламида из гидрогеля привели к значительному увеличению скорости выведения за счет большего расширения тканей16. Разработаны менее дорогостоящие альтернативы решению для согласования показателей преломления, использовавшемуся в оригинальном методе CLARITY17-19. 2,2'-тиодиэтанол (ТДЭ) является недорогим и быстрым средством для очищения мозга, которое обращает вспять часть расширения тканей, происходящее во время удаления липидов18. Этот отчет включает в себя пассивное очищение ткани, внедренной в гидрогель, и использование TDE в качестве решения для сопоставления показателя преломления с оригинальным методом CLARITY для создания высоковоспроизводимого и недорогого протокола оптического очищения центральной нервной системы мыши.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все эксперименты проводились в соответствии с Уходу за животными и рекомендациями по использованию комитета (IACUC). Thy1-YFP, ПЛП-EGFP и PV-TdTomato мышей использовали для этих экспериментов, но любые мыши, экспрессирующие флуоресцентные белки могут быть успешно очищены и образ.

1. Подготовка ткани

Внимание: параформальдегид (PFA) и акриламид являются токсичными и раздражающими. Выполнение экспериментов с использованием этих реагентов в вытяжном шкафу и с соответствующими средствами индивидуальной защиты (лабораторный халат, перчатки и средства защиты глаз).

  1. Жертвоприношение животное в эвтаназии камере с ~ 1 мл изофлуран, пока дыхание не прекратится (~ 2 - 3 мин).
  2. С помощью перистальтического насоса установлен в ~ 5 мл / мин до внутрисердечно обрызгивать мышь с перфузионной раствором (таблица 1) при 4 ° С до тех пор , пока кровь очищается от тканей (5 - 10 мин).
  3. Изменение перфузата к фиксирующим раствором (таблица 1)при 4 ° С до тех пор, шеи и хвоста не заметно напрягся (5 - 10 мин).
  4. Конец перфузию и обезглавить животное. Осторожно рассекают из мозга из черепа сначала удалением соединительной ткани вокруг черепа , а затем удаление кости с брюшной поверхности черепа и подъема мозг из (рис 1а), как описано в разделе 20.
    Примечание: Дайте особое внимание удалению костей, окружающих flocculonodular мочки мозжечка и обонятельных луковиц.
    1. Рассеките спинной мозг от позвоночного столба, аккуратно вставив кончик тонкой, острой ножничные между спинным мозгом и позвоночником и срезания отдельных позвоночных сегментов столбцов прочь, как описано в разделе 21.
  5. Hemisect мозг, поместив ее в пластиковую матрицу мозга мыши и резки вдоль средней линии с матрицей лезвием.
  6. Добавьте каждое полушарие и спинной мозг, чтобы отделить 50 мл центрифугу ваннаЕ. С. с ~ 40 мл раствора гидрогеля (таблица 1). С этой точки передней крышки трубы с алюминиевой фольгой для защиты флуорофоры во всех последующих шагов.
  7. Инкубируйте пробирку, содержащую образец в гидрогеле при температуре 4 ° С при осторожном встряхивании (~ 30 оборотов в минуту) в течение 7 дней.

2. Полимеризация

  1. Откажитесь ~ 25 мл гидрогеля, сохраняя образец и ~ 25 мл гидрогеля в центрифужную пробирку.
  2. Обескислороживание образца путем удаления колпачка и размещения центрифужной пробирки в эксикаторе банку и присоединительные банку в вакууме. Применение вакуума в течение по крайней мере 10 минут, чтобы позволить растворенные газы, чтобы выйти из раствора и образуют пузырьки. Осторожно встряхнуть, чтобы выбить пузыри.
  3. Заменить вакуум в эксикаторе банку со 100% -ным газообразным азотом в течение 2 - 3 мин. После того, как давление уравнивает (как только можно открыть верхнюю часть эксикаторе банку), быстро колпачок трубки, чтобы предотвратить повторное введение кислорода.
  4. полимерИзе гидрогель, помещая трубку с образцом в водяную баню C 37 ° в течение 3 ч до тех пор, полимеризация не будет завершена. Полимеризованных гидрогель будет брать на себя гелеобразной консистенции (рис 1b). Примечание: Небольшое количество неполимеризованных гидрогеля в верхней приемлемо.
  5. С помощью шпателя, чтобы удалить полимеризованного образца из трубки центрифуги, а затем отрезать излишки гидрогель от образца.
  6. Удалите остатки гидрогеля путем помещения образца на безворсовой вытереть и осторожно втирают и крученым ткани на ней, оставляя за собой лишь тонким слоем полимеризованного гидрогеля на образце.

3. липида Удаление

Примечание: липида-очищается ткань хрупкой, обращаться с осторожностью. Используйте клеточный фильтр при сливе трубки, чтобы избежать потери пробы. Кроме того, образец будет набухать в течение всего процесса клиринга, однако, опухоль может быть отменено в течение рефракционной процесса согласования индекса.

Внимание: Содагм додецилсульфат (SDS) и борной кислоты являются раздражителями. Выполнение экспериментов с использованием их в вытяжном шкафу и с соответствующими средствами индивидуальной защиты (лабораторный халат, перчатки и средства защиты глаз).

  1. Передача полимеризованного образца в чистую 50 мл центрифужную пробирку и добавляют 45 мл Очистка буфера (таблица 1). Инкубируют при 45 ° С при осторожном встряхивании (~ 30 оборотов в минуту). Изменение буфера ежедневно в течение первоначального 7 дней, выливая от использованного клиринговую буфера в химических отходов и добавление 45 мл ~ свежего клирингового буфера. Держите центрифужные пробирки, содержащие образцы, покрытые алюминиевой фольгой для защиты флуорофоры.
  2. После первых 7 дней, инкубировать образец при температуре 40 ° C и обмен Очистка буфера через каждые 2 - 3 дней. Продолжайте очистку , пока все липиды не растворяются и ткани достигает прозрачности (рис 1c). Это будет 4 - 6 недель для полушария мозга мыши и 2 - 4 недели для спинного мозга.
  3. После того, как ткань очищается, переводобразец на новую 50 мл центрифужную пробирку и промойте 4 раза в PBST (таблица 1) при 40 ° С при осторожном встряхивании (~ 30 оборотов в минуту) в течение 24 часов для удаления остаточного SDS.

4. Молекулярный Окрашивание

Внимание: 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндол дигидрохлорид (DAPI) является раздражителем и любые эксперименты, использующие ее следует проводить в вытяжном шкафу и с соответствующими средствами индивидуальной защиты (лабораторный халат, перчатки и средства защиты глаз).

  1. Перенести пробу в чистую 15 мл центрифужную пробирку и заправить 1 мкг / мл DAPI в 1X PBST, рН 7,5. Инкубируют при комнатной температуре (КТ) в течение 24 часов. Держите центрифужные пробирки, содержащие образцы, покрытые алюминиевой фольгой для защиты флуорофоры.
  2. Промыть 3 раза в PBST при комнатной температуре в течение по крайней мере 6 ч / промывочного раствора.

5. Индекс рефракционной Matching

Внимание: 2,2'-тиодиэтанол (TDE) является раздражителем и любые эксперименты с использованием его шульд быть выполнены в вытяжном шкафу и с соответствующими средствами индивидуальной защиты (лабораторный халат, перчатки и средства защиты глаз).

  1. Перенести пробу в чистую 15 мл центрифужную пробирку и залить 30% (об / об) TDE в 1X PBS, рН 7,5. Инкубируют при 40 ° С при осторожном встряхивании (~ 30 оборотов в минуту) в течение 24 часов.
  2. Обмен 30% TDE с 63% (об / об) TDE в 1X PBS, рН 7,5. Инкубируют при 40 ° С при осторожном встряхивании в течение 24 часов.
    Примечание: Образец будет сжиматься до приблизительно первоначального размера.
  3. На ровную чистую поверхность рулон кусок многоразового клея в цилиндр с одинаковым диаметром чуть больше, чем толщина образца.
  4. Положите многоразовую клейкую цилиндр в открытый круг (~ 25 мм внутренний диаметр с небольшим отверстием в верхней части) на 40 мм блюдо со стеклянным дном. Если поправки должны быть сделаны, снимите цилиндр из стекла и разрезали лезвием бритвы.
  5. Используйте кончик P1000 пипетки, чтобы создать уплотнение между повторно используемого клея и стекла путемпрокатку вокруг внешнего обода цилиндра.
  6. Место ~ 100 мкл 63% TDE на стеклянную посуду и распространяется вокруг, чтобы покрыть поверхность стекла в круг многоразового клея.
  7. С помощью шпателя, тщательно поместить образец в центре круга, заботясь, чтобы не образовывать пузырьки.
  8. Пипетировать еще 100 мкл 63% TDE непосредственно на образец, а затем сразу же место 40 мм круглое защитное стекло с над многоразовой клеем.
  9. Используя индекс, середину и безымянного пальца обеих рук, осторожно нажмите по периметру круга, пока крышка из стекла не вступил в контакт с образцом.
  10. Медленно довести стеклянным дном блюдо в вертикальное положение упирающейся поверхности, а затем добавить 63% TDE с пипеткой до тех пор, пока раствор не достигнет через небольшое отверстие в верхней части. Используйте безворсовой протирать, чтобы высушить кончик пипетки так, чтобы раствор не капал на стекле. Для того, чтобы избежать пузырей в камере, никогда не опустошить пипетку весь путь.
  11. кнебольшое отверстие, добавить кремния эластомер вложить круг и создать закрытую камеру. Подождите 5 минут для того, чтобы высохнуть, прежде чем визуализации.

6. Микроскопия

Внимание: лазеры, используемые в конфокальной, одной плоскости освещения и световой микроскопии листа являются очень мощным и может привести к слепоте. Любые эксперименты, использующие лазеры должны быть выполнены после длительной подготовки и с большой осторожностью и надлежащей защиты глаз.

  1. Поместите камеру формирования изображения с образцом внутри на стадии лазерной сканирующей конфокальной микроскопии.
  2. Откройте программу обработки изображений (см таблицу материалов). Для включения лазера аргона возбуждения, перейдите на вкладку конфигурации в верхней части программы затем значок лазера. Установите флажок рядом с аргоном для питания лазера и переместить шкалу слайд до 30%. Обратите внимание указатель медленно нагреться до выбранной позиции.
    1. Вернитесь на вкладку приобретают в верхней части. В большом окне "Настройки пути луча &# 34; перейти на нагрузку / сохранить настройки окна и выберите из выпадающего меню, чтобы выбрать соответствующий канал длины волны для изображения YFP (527 нм).
  3. Выберите соответствующие задачи для визуализации путем размещения гиперссылки красной надписью "Цель: текущий объект" под окном настройки канала. При нажатии на вкладку открывает все доступные цели и выбор будет автоматически поворачивать башни.
    1. Используйте цели (например., 10x) с большим рабочим расстоянием (больше толщины ткани , чтобы быть отображены, например, 11 мм) и большой числовой апертурой (например., 0,3) , чтобы максимально увеличить плоскостную разрешение изображения и свести к минимуму оптическая толщина секции.
  4. На левой колонке выпадающие меню, откройте "XY: разрешение" окно для установки матрицы сбора данных, называемый "формат", 1,024 х 1,024 или значение соответствующего для бокового предела разрешения объектива. Установить коэффициент масштабирования как можно более низкой (например., 1+0,7).
  5. В том же окне, установите 8 средней линии и 1 кадр средние параметры, сбрасывая вниз по отдельности меченые меню соответствующим образом. Используйте большие значения для высокого отношения сигнал-шум и малых значений для быстрого приобретения.
    Примечание: 8 строк средние и 1 кадр в среднем будет приобретать высококачественные изображения полушария мозга мыши примерно 4 часа.
  6. Найдите образец, используя элементы управления стадии. После того, как представитель поле отображается, установите коэффициент усиления и смещения.
    Примечание: Коэффициент усиления и смещение будет существенно меняться в зависимости от типа ткани, флуорофоров, и / или анатомической особенностью изображаемого. Для YFP, установите значения от 760 до 780 для усиления и от -1,0 до -1,5 для смещения.
  7. Выберите "плитки сканирование" и выберите границы интересующей области. Установить верхний и нижний пределы Z-стека, чтобы быть приобретены. Установите толщину оптической части на основе оптического предела разрешения раздела объективной в.
    Примечание: Цель-хоптический предел разрешения секции определяется прежде всего его числовой апертуры. Большая часть программного обеспечения управления микроскоп автоматически вычисляет значение, соответствующее для целей используется. Для объектива 10X с числовой апертурой 0,3, который будет составлять приблизительно 11 мкм.
  8. Начать сбор данных.
    Примечание: Это может занять несколько часов.
  9. Собирать изображения с более высоким разрешением, используя более высокие цели увеличения от конкретных регионах, представляющих интерес.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Визуальное структурной организации мозга имеет решающее значение для понимания того, как морфология и соединения влияют на функцию мозга в норме и при патологии. Оптические методы клиринга позволяют популяции изображения клеток в 3D в неповрежденные ткани, что позволяет нам изучать морфологию и связность слаженно.

Мыши, которые экспрессируют флуоресцентные белки движимый промоторов, специфических для субпопуляций клеток позвол...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Пассивная очистка гидрогелевые срезах тканей (пассивный) CLARITY представляет собой простой и недорогой метод для очистки больших кусков ткани. Такой подход не требует специализированного оборудования и могут быть легко выполнены в контролируемой температурой шейкер. На протяжении нескольких недель, даже большие, высоко мякотных ткани, такие как целого головного или спинного мозга, станет прозрачной и пригодной для микроскопии. Хотя этот доклад сосредоточено на очистке тканей ЦНС, пассивный осветление может быть примене...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была щедро при поддержке Национального института здоровья / Национального института неврологических расстройств и инсульта (/ NINDS NIH) грант 1R01NS086981 и Hilton Foundation Conrad N.. Мы благодарим доктора Лорана Bentolila и д-р Мэтью Schibler за их неоценимую помощь с конфокальной микроскопии. Мы благодарим тех, которые внесли свой вклад в форуме Ясности (http://forum.claritytechniques.org). Мы особенно благодарим д-ра Карла Дейссерот за открытие свою лабораторию, чтобы научить эту увлекательную технику. Авторы выражают благодарность за щедрую поддержку от мозга Mapping медицинских исследований организации, Фонд поддержки Brain Mapping, Пирсона-ловеласа, Фонд Амансон фонд, капитал группы компаний благотворительного фонда, Уильям М. и Линда Р. Dietel Филантропического фонд и Фонд Northstar , Исследования сообщили в этой публикации, также при частичной поддержке Национального центра исследовательских ресурсов и Управлением Директора нацииаль институты здоровья под номерами премии C06RR012169, C06RR015431 и S10OD011939. Содержание исключительно ответственности авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национального института здоровья.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
10x фосфатно-солевой буфер (PBS)FisherBP399-1буферы
32% параформальдегид (PFA)Электронная микроскопия Sciences15714-5перфузия и гидрогель
2,2'-тиодиэтанол (TDE)Sigma-Aldrich166782-500Gраствор для согласования показателя преломления
40% акриламидBio-Rad161-0140гидрогель
2% бис-акриламидBio-Rad161-0142гидрогель
ВА-044 инициаторWako Pure Chemical Industries, Ltd.VA044гидрогель
Борная кислотаSigma-AldrichB7901очищающий буфер
Додецилсульфат натрия (SDS)FisherBP166-5очищающий буфер
Гидроксид натрияFisher55255-1буферы
азид натрияSigma-Aldrich52002-100Gконсервант
Triton X-100Sigma-AldrichX100-500G
буферы гепаринСигма-ОлдричH3393-50KUперфузия
нитрат натрияФишерBP360-500перфузия
DAPIмолекулярные зондыD1306ядерное окрашивание
99,9% изофлуранФеникс57319-559-06обезболивающее
гидрохолорическая кислотаФишерА1445-500буферы
Тарелка со стеклянным дномWillcoHBSB-5040Посуда Willco
Многоразовый клейBostick371351Blu-Tack
Силиконовый эластомерWorld Precision InstrumentsKWIK-CASTKwik-Cast
Lint-free салфеткаKimberly-Clark34120KimWipe
Mouse матрица мозгаRobozSA-2175секционная ткань
Матричные лезвияRobozRS-9887разреза ткани
Перистальтический насосCole-Parmer77122-24для пефузии
Лазерный сканирующий конфокальный микроскопLeicaSP5
Программное обеспечение для визуализацииLeicaLAS AFмикроскопия
для

Ссылки

  1. Micheva, K. D., Smith, S. J. Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55, 25-36 (2007).
  2. Kleinfeld, D., et al. Large-scale automated histology in the pursuit of connectomes. J Neurosci. 31, 16125-16138 (2011).
  3. MacKenzie-Graham, A., et al. A multimodal, multidimensional atlas of the C57BL/6J mouse brain. J Anat. 204, 93-102 (2004).
  4. Denk, W., Svoboda, K. Photon upmanship: why multiphoton imaging is more than a gimmick. Neuron. 18, 351-357 (1997).
  5. Denk, W., et al. Anatomical and functional imaging of neurons using 2-photon laser scanning microscopy. J Neurosci Methods. 54, 151-162 (1994).
  6. Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nat Biotechnol. 21, 1369-1377 (2003).
  7. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2, 932-940 (2005).
  8. Theer, P., Denk, W. On the fundamental imaging-depth limit in two-photon microscopy. J Opt Soc Am A Opt Image Sci. Vis. 23, 3139-3149 (2006).
  9. Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat Methods. 4, 331-336 (2007).
  10. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
  11. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
  12. Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).
  13. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157, 726-739 (2014).
  14. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
  15. Spence, R. D., et al. Bringing CLARITY to gray matter atrophy. Neuroimage. 101, 625-632 (2014).
  16. Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9, 1682-1697 (2014).
  17. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158, 945-958 (2014).
  18. Costantini, I., et al. A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging. Sci Rep. 5, 9808(2015).
  19. Zheng, H., Rinaman, L. Simplified CLARITY for visualizing immunofluorescence labeling in the developing rat brain. Brain Struct Funct. , (2015).
  20. Parra, S. G., et al. Multiphoton microscopy of cleared mouse brain expressing YFP. J Vis Exp. (67), e3848(2012).
  21. Weinger, J. G., et al. Two-photon imaging of cellular dynamics in the mouse spinal cord. J Viz Exp. (96), e52580(2015).
  22. Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nat Neurosci. 18, 1518-1529 (2015).
  23. Treweek, J. B., et al. Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping. Nat Protoc. 10, 1860-1896 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

22

Похожие статьи