Method Article

Оптический Клиринговый нервной системы мыши Центральной использованием пассивных ЯСНОСТИ

DOI:

10.3791/54025

⸱

June 30th, 2016

 ,  ,  , 
1Department of Neurology, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles, 2W.M. Keck Science Department, Claremont McKenna, Pitzer & Scripps Colleges

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Методы оптического очищения революционизируют способ визуализации тканей. В этом отчете мы описываем модификации оригинального протокола Clear Lipid-exchange Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY), который дает более стабильные и менее дорогостоящие результаты.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Традиционно, визуализация тканей требовала, чтобы интересующая ткань была последовательно срезана и визуализирована, подвергая каждый участок ткани уникальным нелинейным деформациям, что значительно затрудняло способность оценивать клеточную морфологию, распределение и связь в центральной нервной системе (ЦНС). Тем не менее, методы оптического очищения меняют способ визуализации тканей. Эти подходы позволяют глубоко проникнуть в препарированные интактные органы, обеспечивая потрясающее понимание структурной организации тканей в здоровом и больном состоянии. Такие методы, как прозрачный липид-обменный акриламид-гибридизированный жесткий визуализационный тканевый гидрогель (CLARITY), достигают этой цели за счет создания матрицы, которая связывает важные биомолекулы, позволяя светорассеивающим липидам свободно диффундировать. Удаление липидов с последующим сопоставлением показателя преломления делает ткань прозрачной и легко визуализируемой в трех измерениях (3D). Тем не менее, электрофоретическое очищение тканей (ETC), используемое в оригинальном протоколе CLARITY, может быть сложно успешно реализовать, а использование запатентованного решения для согласования показателя преломления делает рутинное использование метода дорогостоящим. В этом отчете демонстрируется реализация простого и недорогого протокола оптического очищения, который сочетает в себе пассивную прозрачность для улучшения целостности тканей и 2,2'-тиодиетанол (TDE), ранее описанное решение для согласования показателей преломления.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Возможность визуализации полных нейроанатомических структур чрезвычайно ценна для понимания мозга в здоровом и болезненном состоянии. Традиционно, 3D-визуализация требовала разреза тканей для обеспечения осевого разрешения и визуализации глубоких анатомических структур. Этот подход позволяет получать наборы данных с высоким разрешением, но требует сложных методов реконструкции изображений и является очень трудоемким. В результате она была ограничена визуализацией небольших объемов ткани1-3. Оптический срез, с другой стороны, хорошо подходит для создания 3D-изображений тканей с флуоресцентной меткой с высоким разрешением. Поскольку оптическое сечение по своей сути является трехмерным, оно не требует обширных вычислений для создания объема 3D-изображения. Однако рассеяние света и помутнение тканей ограничивают глубину, на которой ткани могут быть оптически разрезаны. Глубина визуализации ограничена примерно 150 мкм при лазерной сканирующей конфокальной микроскопии и менее 800 мкм при использовании двухфотонной возбуждающей микроскопии4-8.

Чтобы преодолеть эти ограничения, недавно было разработано несколько методов оптического очищения, которые затем были усовершенствованы, чтобы обеспечить глубокую микроскопическую визуализацию интактных тканей. Использование бензилового спирта и бензилбензоата (BABB) для придания несъемным тканям прозрачности было одним из самых ранних подходов9. Однако этот подход был ограничен гашением флуоресценции в образцах и неполной очисткой сильно миелинизированных структур10. Усовершенствования этого метода, такие как 3D-визуализация органов, очищенных растворителем (3DISCO), привели к очень быстрому и полному очищению тканей, но все еще страдают от быстрой потери флуоресцентных сигналов, особенно желтого флуоресцентного белка (YFP)10. Решения для очистки на водной основе, такие как Sca/e11 и SeeDB12, сохраняют флуоресцентные сигналы, но не полностью очищают сильно миелинизированные ткани. Четкая, беспрепятственная визуализация мозга и вычислительный анализ (CUBIC) — это новая многообещающая технология оптического очищения, которая, по-видимому, преодолевает ограничения ранее разработанныхрешений для очистки на водной основе. В отличие от других методов оптического очиста, прозрачный липид-обменный акриламид-гибридизованный жесткий визуализационный hYdrogel (CLARITY)14 встраивает мозг в пористую матрицу, которая обеспечивает структурную целостность белков, нуклеиновых кислот и малых молекул, оставляя липиды несвязанными. Затем липиды удаляются электрофоретическим путем, в результате чего мозг становится оптически очищенным, который можно легко визуализировать и так же легко зондировать с помощью общедоступных методов.

Электрофоретическая очистка тканей (ETC) используется для удаления липидов из тканей, встроенных в гидрогель, в CLARITY, однако ETC может быть трудно реализовать последовательно, и ткани, подверженные электрофорезу, могут демонстрировать деформацию тканей, потемнение, потерю флуоресценции и реактивности антител. Пассивное очищение липидов позволяет избежать этих ограничений, но требует увеличения времени выведения15-17. Пассивная очистка также позволяет проводить параллельную очистку большого количества образцов, поскольку она не ограничена количеством доступных аппаратов ETC. Снижение концентрации параформальдегида и исключение бис-акриламида из гидрогеля привели к значительному увеличению скорости выведения за счет большего расширения тканей16. Разработаны менее дорогостоящие альтернативы решению для согласования показателей преломления, использовавшемуся в оригинальном методе CLARITY17-19. 2,2'-тиодиэтанол (ТДЭ) является недорогим и быстрым средством для очищения мозга, которое обращает вспять часть расширения тканей, происходящее во время удаления липидов18. Этот отчет включает в себя пассивное очищение ткани, внедренной в гидрогель, и использование TDE в качестве решения для сопоставления показателя преломления с оригинальным методом CLARITY для создания высоковоспроизводимого и недорогого протокола оптического очищения центральной нервной системы мыши.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все эксперименты проводились в соответствии с Уходу за животными и рекомендациями по использованию комитета (IACUC). Thy1-YFP, ПЛП-EGFP и PV-TdTomato мышей использовали для этих экспериментов, но любые мыши, экспрессирующие флуоресцентные белки могут быть успешно очищены и образ.

1. Подготовка ткани

Внимание: параформальдегид (PFA) и акриламид являются токсичными и раздражающими. Выполнение экспериментов с использованием этих реагентов в вытяжном шкафу и с соответствующими средствами индивидуальной защиты (лабораторный халат, перчатки и средства защиты глаз).

  1. Жертвоприношение животное в эвтаназии камере с ~ 1 мл изофлуран, пока дыхание не прекратится (~ 2 - 3 мин).
  2. С помощью перистальтического насоса установлен в ~ 5 мл / мин до внутрисердечно обрызгивать мышь с перфузионной раствором (таблица 1) при 4 ° С до тех пор , пока кровь очищается от тканей (5 - 10 мин).
  3. Изменение перфузата к фиксирующим раствором (таблица 1)при 4 ° С до тех пор, шеи и хвоста не заметно напрягся (5 - 10 мин).
  4. Конец перфузию и обезглавить животное. Осторожно рассекают из мозга из черепа сначала удалением соединительной ткани вокруг черепа , а затем удаление кости с брюшной поверхности черепа и подъема мозг из (рис 1а), как описано в разделе 20.
    Примечание: Дайте особое внимание удалению костей, окружающих flocculonodular мочки мозжечка и обонятельных луковиц.
    1. Рассеките спинной мозг от позвоночного столба, аккуратно вставив кончик тонкой, острой ножничные между спинным мозгом и позвоночником и срезания отдельных позвоночных сегментов столбцов прочь, как описано в разделе 21.
  5. Hemisect мозг, поместив ее в пластиковую матрицу мозга мыши и резки вдоль средней линии с матрицей лезвием.
  6. Добавьте каждое полушарие и спинной мозг, чтобы отделить 50 мл центрифугу ваннаЕ. С. с ~ 40 мл раствора гидрогеля (таблица 1). С этой точки передней крышки трубы с алюминиевой фольгой для защиты флуорофоры во всех последующих шагов.
  7. Инкубируйте пробирку, содержащую образец в гидрогеле при температуре 4 ° С при осторожном встряхивании (~ 30 оборотов в минуту) в течение 7 дней.

2. Полимеризация

  1. Откажитесь ~ 25 мл гидрогеля, сохраняя образец и ~ 25 мл гидрогеля в центрифужную пробирку.
  2. Обескислороживание образца путем удаления колпачка и размещения центрифужной пробирки в эксикаторе банку и присоединительные банку в вакууме. Применение вакуума в течение по крайней мере 10 минут, чтобы позволить растворенные газы, чтобы выйти из раствора и образуют пузырьки. Осторожно встряхнуть, чтобы выбить пузыри.
  3. Заменить вакуум в эксикаторе банку со 100% -ным газообразным азотом в течение 2 - 3 мин. После того, как давление уравнивает (как только можно открыть верхнюю часть эксикаторе банку), быстро колпачок трубки, чтобы предотвратить повторное введение кислорода.
  4. полимерИзе гидрогель, помещая трубку с образцом в водяную баню C 37 ° в течение 3 ч до тех пор, полимеризация не будет завершена. Полимеризованных гидрогель будет брать на себя гелеобразной консистенции (рис 1b). Примечание: Небольшое количество неполимеризованных гидрогеля в верхней приемлемо.
  5. С помощью шпателя, чтобы удалить полимеризованного образца из трубки центрифуги, а затем отрезать излишки гидрогель от образца.
  6. Удалите остатки гидрогеля путем помещения образца на безворсовой вытереть и осторожно втирают и крученым ткани на ней, оставляя за собой лишь тонким слоем полимеризованного гидрогеля на образце.

3. липида Удаление

Примечание: липида-очищается ткань хрупкой, обращаться с осторожностью. Используйте клеточный фильтр при сливе трубки, чтобы избежать потери пробы. Кроме того, образец будет набухать в течение всего процесса клиринга, однако, опухоль может быть отменено в течение рефракционной процесса согласования индекса.

Внимание: Содагм додецилсульфат (SDS) и борной кислоты являются раздражителями. Выполнение экспериментов с использованием их в вытяжном шкафу и с соответствующими средствами индивидуальной защиты (лабораторный халат, перчатки и средства защиты глаз).

  1. Передача полимеризованного образца в чистую 50 мл центрифужную пробирку и добавляют 45 мл Очистка буфера (таблица 1). Инкубируют при 45 ° С при осторожном встряхивании (~ 30 оборотов в минуту). Изменение буфера ежедневно в течение первоначального 7 дней, выливая от использованного клиринговую буфера в химических отходов и добавление 45 мл ~ свежего клирингового буфера. Держите центрифужные пробирки, содержащие образцы, покрытые алюминиевой фольгой для защиты флуорофоры.
  2. После первых 7 дней, инкубировать образец при температуре 40 ° C и обмен Очистка буфера через каждые 2 - 3 дней. Продолжайте очистку , пока все липиды не растворяются и ткани достигает прозрачности (рис 1c). Это будет 4 - 6 недель для полушария мозга мыши и 2 - 4 недели для спинного мозга.
  3. После того, как ткань очищается, переводобразец на новую 50 мл центрифужную пробирку и промойте 4 раза в PBST (таблица 1) при 40 ° С при осторожном встряхивании (~ 30 оборотов в минуту) в течение 24 часов для удаления остаточного SDS.

4. Молекулярный Окрашивание

Внимание: 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндол дигидрохлорид (DAPI) является раздражителем и любые эксперименты, использующие ее следует проводить в вытяжном шкафу и с соответствующими средствами индивидуальной защиты (лабораторный халат, перчатки и средства защиты глаз).

  1. Перенести пробу в чистую 15 мл центрифужную пробирку и заправить 1 мкг / мл DAPI в 1X PBST, рН 7,5. Инкубируют при комнатной температуре (КТ) в течение 24 часов. Держите центрифужные пробирки, содержащие образцы, покрытые алюминиевой фольгой для защиты флуорофоры.
  2. Промыть 3 раза в PBST при комнатной температуре в течение по крайней мере 6 ч / промывочного раствора.

5. Индекс рефракционной Matching

Внимание: 2,2'-тиодиэтанол (TDE) является раздражителем и любые эксперименты с использованием его шульд быть выполнены в вытяжном шкафу и с соответствующими средствами индивидуальной защиты (лабораторный халат, перчатки и средства защиты глаз).

  1. Перенести пробу в чистую 15 мл центрифужную пробирку и залить 30% (об / об) TDE в 1X PBS, рН 7,5. Инкубируют при 40 ° С при осторожном встряхивании (~ 30 оборотов в минуту) в течение 24 часов.
  2. Обмен 30% TDE с 63% (об / об) TDE в 1X PBS, рН 7,5. Инкубируют при 40 ° С при осторожном встряхивании в течение 24 часов.
    Примечание: Образец будет сжиматься до приблизительно первоначального размера.
  3. На ровную чистую поверхность рулон кусок многоразового клея в цилиндр с одинаковым диаметром чуть больше, чем толщина образца.
  4. Положите многоразовую клейкую цилиндр в открытый круг (~ 25 мм внутренний диаметр с небольшим отверстием в верхней части) на 40 мм блюдо со стеклянным дном. Если поправки должны быть сделаны, снимите цилиндр из стекла и разрезали лезвием бритвы.
  5. Используйте кончик P1000 пипетки, чтобы создать уплотнение между повторно используемого клея и стекла путемпрокатку вокруг внешнего обода цилиндра.
  6. Место ~ 100 мкл 63% TDE на стеклянную посуду и распространяется вокруг, чтобы покрыть поверхность стекла в круг многоразового клея.
  7. С помощью шпателя, тщательно поместить образец в центре круга, заботясь, чтобы не образовывать пузырьки.
  8. Пипетировать еще 100 мкл 63% TDE непосредственно на образец, а затем сразу же место 40 мм круглое защитное стекло с над многоразовой клеем.
  9. Используя индекс, середину и безымянного пальца обеих рук, осторожно нажмите по периметру круга, пока крышка из стекла не вступил в контакт с образцом.
  10. Медленно довести стеклянным дном блюдо в вертикальное положение упирающейся поверхности, а затем добавить 63% TDE с пипеткой до тех пор, пока раствор не достигнет через небольшое отверстие в верхней части. Используйте безворсовой протирать, чтобы высушить кончик пипетки так, чтобы раствор не капал на стекле. Для того, чтобы избежать пузырей в камере, никогда не опустошить пипетку весь путь.
  11. кнебольшое отверстие, добавить кремния эластомер вложить круг и создать закрытую камеру. Подождите 5 минут для того, чтобы высохнуть, прежде чем визуализации.

6. Микроскопия

Внимание: лазеры, используемые в конфокальной, одной плоскости освещения и световой микроскопии листа являются очень мощным и может привести к слепоте. Любые эксперименты, использующие лазеры должны быть выполнены после длительной подготовки и с большой осторожностью и надлежащей защиты глаз.

  1. Поместите камеру формирования изображения с образцом внутри на стадии лазерной сканирующей конфокальной микроскопии.
  2. Откройте программу обработки изображений (см таблицу материалов). Для включения лазера аргона возбуждения, перейдите на вкладку конфигурации в верхней части программы затем значок лазера. Установите флажок рядом с аргоном для питания лазера и переместить шкалу слайд до 30%. Обратите внимание указатель медленно нагреться до выбранной позиции.
    1. Вернитесь на вкладку приобретают в верхней части. В большом окне "Настройки пути луча &# 34; перейти на нагрузку / сохранить настройки окна и выберите из выпадающего меню, чтобы выбрать соответствующий канал длины волны для изображения YFP (527 нм).
  3. Выберите соответствующие задачи для визуализации путем размещения гиперссылки красной надписью "Цель: текущий объект" под окном настройки канала. При нажатии на вкладку открывает все доступные цели и выбор будет автоматически поворачивать башни.
    1. Используйте цели (например., 10x) с большим рабочим расстоянием (больше толщины ткани , чтобы быть отображены, например, 11 мм) и большой числовой апертурой (например., 0,3) , чтобы максимально увеличить плоскостную разрешение изображения и свести к минимуму оптическая толщина секции.
  4. На левой колонке выпадающие меню, откройте "XY: разрешение" окно для установки матрицы сбора данных, называемый "формат", 1,024 х 1,024 или значение соответствующего для бокового предела разрешения объектива. Установить коэффициент масштабирования как можно более низкой (например., 1+0,7).
  5. В том же окне, установите 8 средней линии и 1 кадр средние параметры, сбрасывая вниз по отдельности меченые меню соответствующим образом. Используйте большие значения для высокого отношения сигнал-шум и малых значений для быстрого приобретения.
    Примечание: 8 строк средние и 1 кадр в среднем будет приобретать высококачественные изображения полушария мозга мыши примерно 4 часа.
  6. Найдите образец, используя элементы управления стадии. После того, как представитель поле отображается, установите коэффициент усиления и смещения.
    Примечание: Коэффициент усиления и смещение будет существенно меняться в зависимости от типа ткани, флуорофоров, и / или анатомической особенностью изображаемого. Для YFP, установите значения от 760 до 780 для усиления и от -1,0 до -1,5 для смещения.
  7. Выберите "плитки сканирование" и выберите границы интересующей области. Установить верхний и нижний пределы Z-стека, чтобы быть приобретены. Установите толщину оптической части на основе оптического предела разрешения раздела объективной в.
    Примечание: Цель-хоптический предел разрешения секции определяется прежде всего его числовой апертуры. Большая часть программного обеспечения управления микроскоп автоматически вычисляет значение, соответствующее для целей используется. Для объектива 10X с числовой апертурой 0,3, который будет составлять приблизительно 11 мкм.
  8. Начать сбор данных.
    Примечание: Это может занять несколько часов.
  9. Собирать изображения с более высоким разрешением, используя более высокие цели увеличения от конкретных регионах, представляющих интерес.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Визуальное структурной организации мозга имеет решающее значение для понимания того, как морфология и соединения влияют на функцию мозга в норме и при патологии. Оптические методы клиринга позволяют популяции изображения клеток в 3D в неповрежденные ткани, что позволяет нам изучать морфологию и связность слаженно.

Мыши, которые экспрессируют флуоресцентные белки движимый промоторов, специфических для субпопуляций клеток позвол...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Пассивная очистка гидрогелевые срезах тканей (пассивный) CLARITY представляет собой простой и недорогой метод для очистки больших кусков ткани. Такой подход не требует специализированного оборудования и могут быть легко выполнены в контролируемой температурой шейкер. На протяжении нескольких недель, даже большие, высоко мякотных ткани, такие как целого головного или спинного мозга, станет прозрачной и пригодной для микроскопии. Хотя этот доклад сосредоточено на очистке тканей ЦНС, пассивный осветление может быть примене...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была щедро при поддержке Национального института здоровья / Национального института неврологических расстройств и инсульта (/ NINDS NIH) грант 1R01NS086981 и Hilton Foundation Conrad N.. Мы благодарим доктора Лорана Bentolila и д-р Мэтью Schibler за их неоценимую помощь с конфокальной микроскопии. Мы благодарим тех, которые внесли свой вклад в форуме Ясности (http://forum.claritytechniques.org). Мы особенно благодарим д-ра Карла Дейссерот за открытие свою лабораторию, чтобы научить эту увлекательную технику. Авторы выражают благодарность за щедрую поддержку от мозга Mapping медицинских исследований организации, Фонд поддержки Brain Mapping, Пирсона-ловеласа, Фонд Амансон фонд, капитал группы компаний благотворительного фонда, Уильям М. и Линда Р. Dietel Филантропического фонд и Фонд Northstar , Исследования сообщили в этой публикации, также при частичной поддержке Национального центра исследовательских ресурсов и Управлением Директора нацииаль институты здоровья под номерами премии C06RR012169, C06RR015431 и S10OD011939. Содержание исключительно ответственности авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национального института здоровья.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10x фосфатно-солевой буфер (PBS)FisherBP399-1буферы
32% параформальдегид (PFA)Электронная микроскопия Sciences15714-5перфузия и гидрогель
2,2'-тиодиэтанол (TDE)Sigma-Aldrich166782-500Gраствор для согласования показателя преломления
40% акриламидBio-Rad161-0140гидрогель
2% бис-акриламидBio-Rad161-0142гидрогель
ВА-044 инициаторWako Pure Chemical Industries, Ltd.VA044гидрогель
Борная кислотаSigma-AldrichB7901очищающий буфер
Додецилсульфат натрия (SDS)FisherBP166-5очищающий буфер
Гидроксид натрияFisher55255-1буферы
азид натрияSigma-Aldrich52002-100Gконсервант
Triton X-100Sigma-AldrichX100-500G
буферы гепаринСигма-ОлдричH3393-50KUперфузия
нитрат натрияФишерBP360-500перфузия
DAPIмолекулярные зондыD1306ядерное окрашивание
99,9% изофлуранФеникс57319-559-06обезболивающее
гидрохолорическая кислотаФишерА1445-500буферы
Тарелка со стеклянным дномWillcoHBSB-5040Посуда Willco
Многоразовый клейBostick371351Blu-Tack
Силиконовый эластомерWorld Precision InstrumentsKWIK-CASTKwik-Cast
Lint-free салфеткаKimberly-Clark34120KimWipe
Mouse матрица мозгаRobozSA-2175секционная ткань
Матричные лезвияRobozRS-9887разреза ткани
Перистальтический насосCole-Parmer77122-24для пефузии
Лазерный сканирующий конфокальный микроскопLeicaSP5
Программное обеспечение для визуализацииLeicaLAS AFмикроскопия
для

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Micheva, K. D., Smith, S. J. Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55, 25-36 (2007).
  2. Kleinfeld, D., et al. Large-scale automated histology in the pursuit of connectomes. J Neurosci. 31, 16125-16138 (2011).
  3. MacKenzie-Graham, A., et al. A multimodal, multidimensional atlas of the C57BL/6J mouse brain. J Anat. 204, 93-102 (2004).
  4. Denk, W., Svoboda, K. Photon upmanship: why multiphoton imaging is more than a gimmick. Neuron. 18, 351-357 (1997).
  5. Denk, W., et al. Anatomical and functional imaging of neurons using 2-photon laser scanning microscopy. J Neurosci Methods. 54, 151-162 (1994).
  6. Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nat Biotechnol. 21, 1369-1377 (2003).
  7. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2, 932-940 (2005).
  8. Theer, P., Denk, W. On the fundamental imaging-depth limit in two-photon microscopy. J Opt Soc Am A Opt Image Sci. Vis. 23, 3139-3149 (2006).
  9. Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat Methods. 4, 331-336 (2007).
  10. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
  11. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
  12. Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).
  13. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157, 726-739 (2014).
  14. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497, 332-337 (2013).
  15. Spence, R. D., et al. Bringing CLARITY to gray matter atrophy. Neuroimage. 101, 625-632 (2014).
  16. Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9, 1682-1697 (2014).
  17. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158, 945-958 (2014).
  18. Costantini, I., et al. A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging. Sci Rep. 5, 9808(2015).
  19. Zheng, H., Rinaman, L. Simplified CLARITY for visualizing immunofluorescence labeling in the developing rat brain. Brain Struct Funct. , (2015).
  20. Parra, S. G., et al. Multiphoton microscopy of cleared mouse brain expressing YFP. J Vis Exp. (67), e3848(2012).
  21. Weinger, J. G., et al. Two-photon imaging of cellular dynamics in the mouse spinal cord. J Viz Exp. (96), e52580(2015).
  22. Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nat Neurosci. 18, 1518-1529 (2015).
  23. Treweek, J. B., et al. Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping. Nat Protoc. 10, 1860-1896 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Optical ClearingPassive CLARITYMouse Central Nervous SystemTissue TransparencyRefractive Index MatchingLipid RemovalHydrogel PolymerizationConfocal Microscopy2 2 ThiodiethanolImaging Chamber

Related Articles