Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Биолюминесценции визуализации для обнаружения поздней стадии инфекции африканского трипаносомоза

7.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54032

⸱

18 мая 2016 г.

 , 
1Department of Infection and Immunity, London School of Hygiene & Tropical Diseases

В этой статье

Краткое содержание

В этой рукописи описывается использование биолюминесцентного штамма африканских трипаносом для отслеживания инфекции на поздней стадии и демонстрируется, как визуализация in vivo в реальном времени может быть использована для визуализации инфекций в центральной нервной системе в режиме реального времени.

Аннотация

Африканский трипаносомоз человека (АТЧ) — это многостадийное заболевание, которое проявляется в две стадии: ранняя стадия крови и поздняя стадия, когда паразит проникает в центральную нервную систему (ЦНС). Исследования in vivo на поздней стадии были ограничены, поскольку традиционные методологии требуют удаления мозга для определения присутствия паразитов.

Биолюминесцентная визуализация — это неинвазивная, высокочувствительная форма оптической визуализации, которая позволяет визуализировать патоген, трансфицированный люциферазой, в режиме реального времени. Используя трансфицированный штамм трипаносомы, который обладает способностью вызывать заболевание на поздней стадии у мышей, мы можем изучать кинетику инфекции ЦНС у одного животного на протяжении всей инфекции, а также наблюдать за перемещением и распространением системной инфекции.

Здесь мы описываем надежный протокол для изучения инфекций ЦНС с использованием биолюминесцентной модели африканского трипаносомоза, обеспечивая неинвазивные наблюдения в реальном времени, которые могут быть дополнительно проанализированы с помощью дополнительных подходов.

Введение

Африканский трипаносомоз человека (HAT), или сонная болезнь, вызывается трансмиссивными простейшими паразитами Trypanosoma brucei spp1. По оценкам, в настоящее время число случаев заболевания составляет менее 7 тысяч в год, при этом почти 70 миллионов человек подвергаются риску заражения паразитами на африканском континенте. Заболевание, которое чаще всего приводит к летальному исходу при отсутствии лечения, включает в себя раннюю гемолимфатическую стадию, когда паразиты присутствуют в крови, прогрессирующую до поздней стадии, когда паразиты проникают в центральную нервную систему (ЦНС) и больше не поддаются лечению трипаносомальными препаратами на ранней стадии2. Современные методы медикаментозной терапии поздней стадии АТЧ имеют как сложные, длительные схемы лечения, так и серьезные побочные эффекты, а также зарегистрированную резистентность, поэтому исследование новых лекарственных методов лечения является обязательным3,4.

Изучение африканской трипаносомоза человека (АТЧ) на поздней стадии в рамках традиционных мышиных моделей является длительным и сложным, при этом для мониторинга паразитарной нагрузки требуется удаление мозговой ткани5. В качестве исследуемой модели трипаносомоза используется инфицирующий штамм животных T. b. brucei с поздней стадией, появляющейся через 21 день после заражения (dpi). Для мониторинга небиолюминесцентной паразитарной инфекции дикого типа на мышиной модели единственным методом определения паразитарной нагрузки являются снимки периферической крови или количественная ПЦР. Для выбраковки паразитов в мозге мышь необходимо выбраковать, вырезать мозг и провести количественно-ПЦР на тканях, что делает невозможным отслеживание паразитов через несколько временных точек на поздней стадии инфекции. Это приводит к невозможности отслеживать инфекции в центральной нервной системе (ЦНС) в режиме реального времени.

Биолюминесцентная визуализация (BLI) in vivo может обеспечить высокочувствительное, неинвазивное обнаружение распространения паразитов и прогрессирования заболевания в мышиной модели, которое можно отслеживать на одном животном в течение всего эксперимента6. BLI основан на излучении света в видимом спектре, полученном в результате реакции, катализируемой люциферазой. Затем испускаемые фотоны детектируютсякамерой 7 устройства с зарядовой связью (ПЗС). С этой целью патоген генетически модифицируют для экспрессии белка люциферазы, а субстрат, люциферин, вводят в интересующие моменты моменты путем инъекции. Основным преимуществом данного метода является возможность проведения продольных исследований, при которых одно и то же животное может быть визуализировано несколько раз с минимальными неблагоприятными эффектами. Полученный сигнал биолюминесценции может быть количественно определен, что указывает на патогенную нагрузку.

Оптимизация и валидация биолюминесцентного T. b. brucei с красным смещением позволила исследовать позднюю стадию инфекции с помощью неинвазивных процедур, обнаруживая паразитов раньше, чем микроскопия в виде снимков крови, и значительно сократив время, стоимость и количество животных, необходимых для изучения инфекции ЦНС и скрининга лекарств при поздней стадии трипаносомоза8,9. В этом протоколе мы демонстрируем заражение мышей биолюминесцентными трипаносомами и то, как затем визуализировать паразитов in vivo для количественной оценки прогрессирования заболевания и проникновения в ЦНС.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Этика
Вся работа проводилась в рамках утверждения внутренних дел Великобритании животных (научные процедуры) Закон 1986 года и Лондонской школы гигиены и тропической медицины защиты животных и Совета по рассмотрению этики. ARRIVE руководство следуют в настоящем докладе.

1. В Vivo Прохождение Биолюминесцентный Trypanosoma brucei brucei

  1. Удалить криоконсервированное запас (называемый stabilate) Т. б. brucei штамм GVR35-VSL-2 (можно получить у профессора Джона Келли на Лондонской школы гигиены и тропической медицины через MTA) 9 из жидкого азота и позволяют уравновешиваться до комнатной температуры. Развести stabilate до 2 х 10 4 трипаносом / мл в стерильном фосфатно - солевого буферного раствора глюкозы (PBS-G) , рН 8,0 (1 л PBS + 15 г глюкозы) 10.
    Примечание: T. б. brucei GVR35-VSL-2 не является заразным для человека и требует SAPO лицензированных объектов для проведения экспериментов.
  2. InjЭСТ 20-25 г женская CD1 мышь с 0,2 мл разбавленных трипаносом через внутрибрюшинно (IP) с иглой 25 G. Это "донор мыши". Поместите зараженную мышь в специфических патогенов (SPF) -cage и корма вволю.
    Примечание: мышей CD1 являются беспородных штамм и T. б. brucei GVR35 инфекции хорошо характеризуются в этом штамме. Тем не менее, этот протокол также применим к инбредных или генетически модифицированных штаммов, но важно отметить , что цвет меха может оказать влияние на чувствительность визуализации 6,9.
  3. Монитор периферической паразитемии путем забора крови. Поместите мышь в пластиковый фиксатор и возьмите 5 мкл крови из хвоста путем венепункции с 21 G иглой или кровопускание и смешивают с 1/10 0,85% хлорида аммония стерильными лизировать эритроциты и позволяют легче считать.
  4. Подсчитайте разведенной крови в Нойбауэра гемоцитометра.
    1. Загрузите разбавленную кровь в обеих палатах. Подсчитайте всю центральную гридентификатор одной камеры , чтобы дать п трипаносом. Концентрация трипаносом в крови = N × 10 4 трипаносом / мл, отрегулировать для любого коэффициента разбавления и вычислить среднее из двух палат.
      Примечание: Примерно через 5-7 дней после заражения, периферическая паразитемия должна подниматься достаточно , чтобы осуществить инфекцию в концентрации 2 × 10 4 трипаносом / мл.
  5. Когда трипаносом уровни достаточно для количества мышей требуется высокая, переходите к шагу 1.6. Уровень паразитемия 6 × 10 4 трипаносом / мл в одной мыши - донора достаточно для заражения 10 мышей.
    Примечание: Для получения статистически значимых размеров группы, п = 6 для каждой группы лечения мышей необходимы 8. Для других моделей инфекции, расчеты мощности должны были бы быть применены для определения соответствующих размеров групп.
  6. Место мышей в коробку тепла (при 28-30 ° С в течение примерно 5-10 мин), чтобы позволить хвостовые вены расширяются.Для индукции анестезии терминала, администрирование 20 мг / кг пентобарбитала внутривенно с иглой 25 G. Подтвердите мышь под наркозом, осторожно нажимая, чтобы обеспечить разбойников нет вывода рефлекс.
  7. Heparinize 21-G иглу на аликвоты по 5 мл гепарин в количестве 5000 USP ед / мл в трубку Bijou и сосать два раза в и из иглы, прикрепленной к 1 мл шприца.
  8. Возьмем гепаринизированной 21 G иглу и шприц емкостью 1 мл, и выполняют пункции сердца на анестезированных прохода мыши путем вставки иглы по центру под грудной клеткой (шарик крови скапливались в основании иглы) и осторожно потянуть назад на поршень чтобы не свернуть камеры сердца. Соберите как минимум 0,7 мл крови.
  9. Развести инфицированной крови для получения инокулята 2 х 10 4 трипаносом / мл в PBS-G рН 8,0 , как шаг 1.1 выше.
    Примечание: В этот момент, оставшаяся кровь может быть криосохранить производить stabilate путем смешивания с 8% глицерина, 20% инактивированной нагреванием фетальной чаЛФ в сыворотке крови (привет-FCS) и 72% инфицированной крови. Медленно замерзать при температуре -80 ° C с использованием медленного замораживание контейнера для достижения скорости охлаждения -1 ° С / мин, до передачи в жидкий азот.

2. Заражение подопытных мышей

  1. Поместите CD1 самок мышей (~ 21-25 г) в коробку нагрева мягко теплой, чтобы расширить вены. Поместите прогреваемых мышей в пластиковую сдержанностью и вводят 0,2 мл разбавленного прививочный внутривенно с 25 G иглой в хвостовую вену, что эквивалентно 4000 трипаносом на мышь. Установите давление в месте инъекции после этого, чтобы остановить кровотечение.
    Примечание: Внутрибрюшинный инфекция является допустимым путем заражения и использовалась в предыдущих исследованиях 10, но мы обнаружили , что это менее воспроизводимыми , чем при внутривенном введении.
  2. Перемешайте зараженных мышей и клетки в группах по 3 в SPF-вентилируемых клетках. В качестве контроля, вводят CD1 самок мышей дикого типа не-биолюминесцентном паразита, T. б. brucei GVR35 (п =3).
  3. Монитор инфекции через кровь Фильма микроскопией
    1. Пятно 5 мкл крови из венепункции или кровопускание на предметное стекло и выполнить мазок крови (с использованием второго предметного стекла осторожно толкать каплю крови через слайд, чтобы произвести тонкую пленку). Разрешить слайды высохнуть на воздухе.
    2. Закрепите мазок крови с 100% -ным метанолом и красителем Гимза в течение 10 мин перед полосканием с дН 2 O и дайте высохнуть на воздухе. В соответствии с целью 100X подсчитать количество трипаносом в 10 полях зрения (FOV).
      Примечание: Кровь киносъемки осуществляется параллельно неинвазивной визуализации целого животного, как уже через день после заражения. При обработке ряда животных, этот метод трипаносом количественному предпочтительнее подсчета гемоцитометра, как образцы можно хранить при комнатной температуре, и подсчитывали позже.

3. биолюминесценции визуализации для отслеживания инфекции

Примечание: Для того, чтобы контролировать инфекцию, весь АнимAl неинвазивной визуализации могут быть использованы.

  1. Готовят раствор D-люциферин, светлячка субстрата люциферазы, в Дульбекко фосфатно-солевом буферном (DPBS) в дозе 30 мг / мл. Фильтр стерилизовать и заморозить в аликвотах при -20 ° C.
    Примечание: D-Люциферин чувствителен к свету, поэтому защитить его от света, обернув аликвот в фольгу. Не раз при замораживании-оттаивании люциферин , как это может повлиять на активность 11.
  2. Подогреть аликвоты D-люциферин до комнатной температуры. Удалите каждую мышь из клетки (в том числе и у контрольных мышей, инфицированных штаммом nonbioluminescent паразита дикого типа) и вводят 150 мг / кг разогретой D-люциферин (разведенного в ДЗФР) внутрибрюшинно с иглой 25 G. Поместите мышей в изофлуораном камере в течение примерно 5 минут , чтобы вызвать анестезию 2% изофлуораном / O 2 смеси на уровне 2,5 л / мин.
    Примечание: Мыши становятся неподвижными, когда они находятся под анестезией. Для формирования изображений, используемых здесь, 3 мыши могут быть обработаны одновременно. Если мыши anesthetдартизованных в течение более 30 мин, глазная мазь искусственная слеза может быть применен, чтобы предотвратить глаза мышей от высыхания.
  3. Для формирования изображения, описанного здесь, откройте программное обеспечение и инициализировать машину с помощью программного обеспечения в соответствии с инструкциями изготовителя. Получение изображений один раз камера и нагревают пластины достигли температуры.
    Примечание: Этот прибор обычно не выключается, что позволяет машине выполнять фоновые калибровки в течение ночи. В том случае, если ему необходимо перезапустить, он должен выполнить проверку калибровки в первую очередь.
  4. Поместите наркозом мышей в томографа (см 3.5). Используйте большие черные разделители между мышами, чтобы свести к минимуму протечки любого яркого биолюминесцентного сигнала. Мыши изображений с помощью набора времени воздействия; 1, 3, 10, 30, 60 и 180 секунд со средней степенью биннинга, 1 F / остановки и открытого фильтра, и поле зрения Е (12,5 х 12,5 см 2).
    Примечание: Контрольные мыши, инфицированные диким типом nonbioluminescent GVR35 паразитов обеспечивают backgrЗначение биолюминесценции круглый вырез. Из эксперимента кинетики люциферин (рис 6) с этой моделью, мы обнаружили , что пики биолюминесценции сигнала на 10 минут после введения и обработки изображений занимает около 5 мин для 3 мышей. Возьмите эту временную шкалу во внимание при обезболивающее и визуализации мышей.
  5. Для того, чтобы обеспечить тщательное съемку мышей, вращать, чтобы получить вентральной, спинной и боковой вид. Поддержание последовательности в порядке ориентации для визуализации между последовательными животных.
  6. После обработки изображений, позволяют мышей восстановиться после анестезии под наблюдением перед возвращением в SPF-клетки.
  7. Продолжайте визуализации мышей через каждые 7 дней до 21-й день после заражения. Там должно быть постоянное увеличение сигнала биолюминесценции в течение всего животного.
  8. На D21, изображение и мазке крови у мышей, как описано выше, и дозы мышей с 40 мг / кг Диминазина aceturate внутрибрюшинно. Этот препарат очистит периферической паразитемии, но не будет пересекать крови-BRAIп барьера, и, следовательно, обеспечивает лучшую визуализацию инфекции ЦНС.
    Примечание: Диминазина aceturate является устоявшейся препарат, используемый для лечения на ранней стадии трипаносомоз животных.
  9. Продолжить визуализации и мониторинга на D28 и D35.

4. Подтверждая ЦНС инфекции

  1. На D35, изображения мышей, как описано выше (шаги 3.1-3.4).
  2. После обработки изображений, позволяют мышам, чтобы оправиться от анестезии и обескровить мышей, как описано в стадии 1,6-1,8, сбора крови для дальнейшего анализа.
  3. После пункции сердца, обрызгивать мышей с помощью 20 мл PBS (дополнительно: добавляют 3 мг / мл люциферин к перфузионной раствора) через сердце, чтобы очистить кровь от органов и вновь ввести люциферин метки, которые, возможно, удалены из области мозга, в течение интервала времени начиная с шага 4.1.
  4. Аккуратно удалите мозг, используя изогнутые ножницы, резки от основания по окружности черепа и отрывая верхнюю часть черепа, чтобы мозгчтобы быть аккуратно сняты с изогнутыми щипцами.
  5. Поместите вырезанную мозг на участке из черного пластика и пипеткой 50 мкл 15 мг / мл люциферин через орган до визуализации, чтобы обеспечить адекватное люциферин был добавлен к вырезанной мозга. Изображение с использованием параметров, как описано выше. Это продемонстрирует локализацию инфекции полушарий головного мозга.
    Примечание: Вниз по течению Количественное паразитемии на вырезанной головного мозга может быть осуществлено с помощью кПЦР , как описано ранее 8. Другие приложения альтернативные вниз по течению могут включать в себя гистологию или иммуногистохимии для выявления паразитов в ткани головного мозга после записи.

5. Количественный биолюминесценции изображений

Примечание: биолюминесценции может быть определена количественно с использованием области интереса (ROI) с программным обеспечением обработки изображений и корректируются на фоне биолюминесценции.

  1. С помощью инструмента ROI, создать прямоугольную ROI для целого животного а количественногой позиционировать курсор на изображение мыши, чтобы покрыть кончик носа до основания хвоста мыши. Используйте ту же коробку размера для каждого животного и каждый момент времени. При взгляде на ROI для головного мозга, используют круговую ROI таким же образом, позиционирование ее на области головы мыши на изображении.
  2. При желании можно настроить изображение, чтобы появиться на том же спектре для визуального представления инфекции.
    Примечание: Программное обеспечение, используемое здесь создает цветовую карту для каждого изображения автоматически настраивается для минимального и максимального фотоотсчетов. Чтобы включить визуальное сравнение между серией изображений, цветовая гамма должна быть установлена ​​в одних и тех же значений для всех изображений.
    1. Используя изображение с наивысшим биолюминесценции и на вкладке "Регулировка изображения" на палитре инструментов, выберите логарифмическую шкалу и соответствующую цветовую шкалу минимального и максимального значений (определяется эмпирически). Применить эту шкалу для всех изображений на протяжении всего эксперимента.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Этот протокол показывает , как следовать за прогрессирования заболевания после заражения мышей с T. б. brucei, модель для африканского трипаносомоза человека. На рисунке 1 показана временная шкала экспериментального протокола, демонстрируя график обработки и визуализации этапов. Рисунок 2 демонстрирует типичное поле зрения в фиксированном Гимза окрашенном мазке крови , используемой для количественной оценки периферической паразитемии, с трипанос...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Развитие биолюминесцентного Т. б. brucei GVR35 штамм позволяет визуализацию трипаносом инфекции от начала до поздней стадии. Предыдущие модели инфекции не удалось обнаружить поздней стадии, когда паразиты находятся в головном мозге, в режиме реального времени из пленочной крови микроскопии, и требуется отбраковывать и удаление мозга из инфицированных мышей , чтобы определить , паразит нагрузку 12. Биолюминесценции уменьшает вариабельность между мыши, как одна мышь может быть отслежена на протяжении в...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим Джона Келли и Мартин Тейлор (Лондонская школа гигиены и тропической медицины) для обеспечения T. б. brucei GVR35-VSL-2 и д - р Андреа Zelmer (LSHTM) за консультацией по визуализации в естественных условиях. Эта работа была поддержана Фондом глобальной программы здравоохранения Билла и Мелинды Гейтс (грант номер OPPGH5337).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
PBSSigma, ВеликобританияP4417таблетки pH 7,4
ГлюкозаСигма, ВеликобританияG827099,5% (молекулярный)
хлорид аммонияСигма, ВеликобританияA943499,5% (молекулярный)
гепарин (соль лития)Sigma, ВеликобританияH0878
Hi-FCSGibco, Life Technologies, Великобритания10500-064500 мл
DPBSSigma, UKD4031Стерильный фильтрованный
Mr. FrostyNalgene, UK
GiemsaSigma, UKG5637
D-LuciferinPerkin Elmer, UK
Sigma, UK115144-35-9
Диминазен ацетуратSigma, UKD7770Аналитический класс
IVIS Lumina IIPerkin Elmer, Великобританиядругие биоимиджеры доступны например от Bruker, Kodak
Living Image v. 4.2Perkin Elmer, Великобританиясобственное программное обеспечение для инструментов Perkin Elmer IVIS; другие инструменты могут иметь свои собственные
иглы FisherScientific, Великобритания10142104
20 мл ШприцFisher Scientific, Великобритания10743785
25 г иглыGreiner Bio-oneN2516
21 G ИглыGreiner Bio-oneN2138
Двойное матовое предметное стекло для микроскопаVWR, Великобритания631-0117
1,5 мл Микроцентрифужная пробиркаStarLab, ВеликобританияI1415-1000
мл Бижу ТубаStarLab, ВеликобританияE1412-0710
Удерживатель мышиSigma, ВеликобританияZ756903Наш ограничитель был изготовлен на собственном производстве, это похожая модель
7

Ссылки

  1. Brun, R., Blum, J., Chappuis, F., Burri, C. Human African trypanosomiasis. Lancet. 375 (9709), 148-159 (2010).
  2. Rodgers, J. Trypanosomiasis and the brain. Parasitology. 137 (14), 1995-2006 (2010).
  3. Barrett, M. P., Boykin, D. W., Brun, R., Tidwell, R. R. Human African trypanosomiasis: pharmacological re-engagement with a neglected disease. Br. J. Pharmacol. 152 (8), 1155-1171 (2007).
  4. Barrett, M. P., Vincent, I. M., Burchmore, R. J. S., Kazibwe, A. J. N., Matovu, E. Drug resistance in human African trypanosomiasis. Future Microbiol. 6 (9), 1037-1047 (2011).
  5. Jennings, F. W., Whitelaw, D. D., Urquhart, G. M. The relationship between duration of infection with Trypanosoma brucei in mice and the efficacy of chemotherapy. Parasitology. 75 (2), 143-153 (1977).
  6. Andreu, N., Zelmer, A., Wiles, S. Noninvasive biophotonic imaging for studies of infectious disease. FEMS Microbiol. Rev. 35 (2), 360-394 (2011).
  7. Sadikot, R. T., Blackwell, T. S. Bioluminescence imaging. Proc. Am. Thorac. Soc. 2 (6), 537-540 (2005).
  8. Burrell-Saward, H., Rodgers, J., Bradley, B., Croft, S. L., Ward, T. H. A sensitive and reproducible in vivo imaging mouse model for evaluation of drugs against late-stage human African trypanosomiasis. J. Antimicrob. Chemother. 70 (2), 510-517 (2015).
  9. McLatchie, A. P., et al. Highly sensitive in vivo imaging of Trypanosoma brucei expressing 'red-shifted' luciferase. PLoS Negl. Trop. Dis. 7 (11), e2571(2013).
  10. Jennings, F. W., et al. Human African trypanosomiasis: potential therapeutic benefits of an alternative suramin and melarsoprol regimen. Parasitol. Int. 51 (4), 381-388 (2002).
  11. Wiles, S., Robertson, B. D., Frankel, G., Kerton, A. Bioluminescent monitoring of in vivo colonization and clearance dynamics by light-emitting bacteria. Methods Mol. Biol. 574, 137-153 (2009).
  12. Rodgers, J., Bradley, B., Kennedy, P. G. E. Combination chemotherapy with a substance P receptor antagonist (aprepitant) and melarsoprol in a mouse model of human African trypanosomiasis. Parasitol. Int. 56 (4), 321-324 (2007).
  13. Kamerkar, S., Davis, P. H. Toxoplasma on the brain: understanding host-pathogen interactions in chronic CNS infection. J. Parasitol. Res. 2012, 589295(2012).
  14. Franke-Fayard, B., et al. Murine malaria parasite sequestration: CD36 is the major receptor, but cerebral pathology is unlinked to sequestration. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (32), 11468-11473 (2005).
  15. Hitziger, N., Dellacasa, I., Albiger, B., Barragan, A. Dissemination of Toxoplasma gondii to immunoprivileged organs and role of Toll/interleukin-1 receptor signalling for host resistance assessed by in vivo bioluminescence imaging. Cell. Microbiol. 7 (6), 837-848 (2005).
  16. Lewis, M. D., et al. Bioluminescence imaging of chronic Trypanosoma cruzi infections reveals tissue-specific parasite dynamics and heart disease in the absence of locally persistent infection. Cell. Microbiol. 16 (9), 1285-1300 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Инфекция ЦНСвизуализация in vivoTrypanosoma bruceiмикроскопия мазков кровиинъекция люциферинадиминазин ацетуратобласть интересапаразитарная нагрузка в головном мозге
Биолюминесценции визуализации для обнаружения поздней стадии инфекции африканского трипаносомоза
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.