Методическая статья

Выделение и профилирование микроРНК содержащих экзосомы от человека Bile

DOI:

10.3791/54036

⸱

13 июня 2016 г.

 ,  ,  ,  , 
1Division of Gastroenterology and Hepatology, Department of Medicine, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Surgery, Tohoku University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Желчная жидкость является ценным источником внеклеточных везикул/экзосом, которые содержат потенциально важные биомаркеры. Этот протокол представляет собой надежный метод выделения экзосом из человеческой желчи для дальнейшего анализа, включая профилирование микроРНК.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Исследование экзосома в течение последних трех лет значительно расширили сферу в сторону идентификации и характеристики биомаркеров и их терапевтического применения.

Экзосомы недавно было показано, содержат микроРНК (Мирс). Миры сами по себе возникли как ценные биомаркеров для диагностических целей. Как сбор проб в клиниках и больницах довольно изменчиво, микроРНК изоляция от всей желчи существенно различается. Для достижения надежных, точных и воспроизводимых профилей микроРНК из собранных образцов желчи простым способом потребовало разработки протокола высокого качества, чтобы выделить и охарактеризовать экзосомы от желчи. Метод требует несколько центрифугировани и стадию фильтрации с конечной стадией ультрацентрифугирования, чтобы осадить обособленные экзосомы. Электронная микроскопия, Вестерн-блоты, проточной цитометрии и многопараметрического наночастицами оптический анализ, если таковые имеются, являются важнейшими этапами определения характеристик для проверки качества еxosomes. Для выделения микроРНК из этих экзосомы, спайковой лизата с неспецифическим, синтетический микроРНК из вида , как Caenorhabditis Элеганс, т.е. Cel-микроРНК-39, имеет важное значение для нормализации эффективности экстракции РНК. Выделение экзосома из желчной жидкости следуя этому методу позволяет успешно микроРНК профилирование из образцов желчи, хранившихся в течение нескольких лет при температуре -80 ° С.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Как и в других биологических жидкостях, то есть грудное молоко, плазме крови или моче, желчи содержит экзосомы, богатой липидами везикулы 1-4. Экзосомы могут вызывать или изменять биологические функции в клетки - реципиенты 5, 6, форма межклеточной связи , которая может быть частью их нормальной функции 4, 7-9. Экзосомы может содержать видов микроРНК , которые могут обеспечить ценный источник биомаркеров для диагностики 10. профили микроРНК получили значительное внимание в последние годы в качестве диагностических и прогностических маркеров различных заболеваний 11-14 лет.

Сам микроРНК можно найти в биологических жидкостях, возможно, высвобождаемых мертвых клеток и количество пролитой клеток может в значительной мере зависеть от основного заболевания. Профиль микроРНК экзосом не обязательно отражает профиль микроРНК от инициирующего элемента 6, 10, 15-17, но экзосомы может нести подписи микроРНК , которые могут быть характерны для родителей CEбудете как клетка опухоли. Опухолевые полученных экзосомы были идентифицированы в плазме пациентов с аденокарциномой легкого, рака предстательной железы и других опухолей 8, 16, 18.

Целью данного метода является надежным и надежная изоляция экзосомы из образцов желчи человека, в значительной степени зависит от их предыдущих процедур обработки. Она была разработана , чтобы использовать желчь в качестве надежного источника микроРНК для потенциальной диагностики заболеваний желчных протоков , таких как холангиокарциномой 19. Она состоит из нескольких этапов центрифугирования при увеличении скорости, чтобы изолировать экзосомы и могут быть применимы и к другим биологическим жидкостям.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Получение желчи от больных к эндоскопической ретроградной холангиопанкреатография (ЭРХПГ) требует утверждения человеческого протокола Испытуемых Советом по рассмотрению Institutional. Все работы, представленные здесь было одобрено Институциональным наблюдательным советом Университета Джона Хопкинса.

1. экзосома Изоляция от Bile

  1. Выполните эндоскопической ретроградной холангиопанкреатография (ERCP). Поместите пациента в положении лежа на спине и интубации.
    1. Передаёт duodenoscope через рот пациента и вставить его во второй части двенадцатиперстной кишки и выявить основные сосочек.
    2. Избирательно иглу общего желчного протока, вставив тройные Просвет sphincterotome предварительно загруженным с 0,035 дюйма (0,9 мм) гидрофильного проводнику.
    3. Продвигайте проволочный под флуороскопа к левому желчный проток, так как в некоторых случаях это может быть трудно дифференцировать пузырный проток от правого печеночного протока, а затем Продвиньтеsphincterotome 5 см в желчный проток, чтобы приобрести устойчивое положение.
    4. Удалите проволочный направитель, прикрепить 10 мл шприц к проволочный направитель порту через замок Люэра и отсасывает желчи, используя 10 мл отрицательного давления.
    5. Удалите шприц, содержащий желчь, чтобы приступить к ЭРХПГ вставив на проволочный и введение контрастного вещества через порт впрыска для контрастирования билиарного дерева.
    6. Передача собранной желчи в 15 мл пробирку на льду и держать на льду до готовности приступить к стадии центрифугирования.
      Внимание: Надевайте перчатки, чтобы защитить себя и образцы! Лечить желчи как потенциальный источник инфекции, как он может содержать гепатит А вирусные частицы!
    7. Держите образец (ы) на льду. Либо перейдите к шагу 1.2 или центрифуге при 500g при температуре 4 ° С в течение 10 мин, а затем заморозить при температуре -80 ° С до дальнейшего использования.
      Примечание: Образцы , хранящиеся таким образом в течение нескольких лет, обычно использовались с хорошими результатами 19.
  2. Передача 400 мкл желчи в микроцентрифужную пробирку и собирают клетки и клеточные остатки центрифугированием при 300 х г в течение 10 мин при температуре 4 ° С.
  3. Удалить супернатант с помощью пипетки, переносят в свежую пробирку микроцентрифужных и центрифугирование образца (ов) при 16500 х г в течение еще 20 мин при 4 ° C, чтобы очистить супернатант дальнейшего мусора. Откажитесь трубы в биологически опасных отходов. В качестве альтернативы, спина образцов в ультрацентрифуге вместо этого.
  4. Собирают супернатант и фильтровать ее в шкафу биологической безопасности с помощью шприца через мембранный фильтр с диаметром 0,2 мкм из полиэфирсульфона (ПЭС), который имеет хорошие скорости потока и низкое св зывание белка для удаления частиц размером более 200 нм налево.
  5. Пипетируйте отфильтрованный супернатант в ультрацентрифуге трубки и добавляют PBS так, что трубы более чем на 2/3. Если трубки содержат меньше жидкости, чем, трубы будут разрушаться во время центрифугирования! Трубы могут быть вымыты, автоклавированы и повторно использовать несколько раз.
  6. Пеллэт экзосомы через ультрацентрифугирования при 120000 мкг в течение 70 мин при 4 ° С. После центрифугирования взгляд на нижней части ультрацентрифуге трубки иногда увидеть маленькие желтые шарики; эти экзосомы.
  7. Жидкость над осадком сливают, осторожно декантируют его и дезинфекцию отходов путем добавления отбеливателя до конечной концентрации 10% об / об, и оставьте на 20 мин.
  8. Для последующих экспериментов, либо обрабатывать гранул (ы) в небольшом объеме соответствующего раствора (т.е. радиоиммуноосажден анализ (РИПА) буфер для выделения белка, РНК буфера для лизиса для СИК изоляции) или суспендирование его в 50-150 мкл фосфатно - буферного физиологический раствор (PBS) , который может быть либо хранить при -80 ° с для последующего использования (количественное в режиме реального времени полимеразной цепной реакции (QRT-PCR) или экстракции белка и т.д.) или применяемого для определения характеристик препарата экзосома методом просвечивающей электронной микроскопии или оптического анализа наночастицами ,

2. экзосома ИдентификацииПросвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) или CryoEM

  1. Ресуспендируют внеклеточные везикул в 100 мкл PBS с помощью пипетки. В идеале, использовать экзосомы, которые не хранили при -20 ° С или -80 ° С, особенно при выполнении изоляции в первый раз.
  2. Адсорбирует 20 мкл аликвоты (около 2 мкг) до 400 меш углерода покрытием Parlodion медных сеток в течение 2 мин и дайте высохнуть при комнатной температуре.
  3. Закрепить экзосома в 1% (об / об) глутаровый альдегид (ЕМ-класс) в течение 5 мин при комнатной температуре осторожно помещая капли на высушенного препарата.
  4. Промыть решетки дважды водой в течение 5 мин, а затем контрастировать пятно EVs с 1% фосфорно-вольфрамовой кислоты (PTA) в течение 30 сек.
  5. Получение изображений с помощью электронного микроскопа с ускоряющим напряжением 80 киловольт, начиная с увеличениях 20,000X и возрастает до 100000 при определении размера частиц.
    Примечание: Другие, как наслоение подготавливает на формвар углерода покрытием 200 меш медь или никель сеток и контраст окрашивания LiKE 1% или 2% ацетата уранила в течение 10-15 мин, также возможно.
  6. Для CryoEM, смешайте 20 мкл аликвоты (около 2 мкг) с 60 мкл белка G золота 10 нм (соотношение 1: 3). Это поможет определить диаметр экзосома.
  7. Передача образцов на тлеющих разряжен C-плоские дырявые углерода сетки и удаления избытка жидкости путем промокания. Замораживание сетки путем погружения их немедленно в жидкий этан.
  8. Установите сетки в cryoholder в жидком азоте.
  9. Приобретать изображения на 200 кВ с увеличениях 20,000X и 100000.

3. экзосома Идентификация с помощью нескольких параметров оптического анализа наночастиц

  1. Ресуспендируют изолированных экзосомы в 100 мкл PBS с помощью пипетки.
  2. Развести экзосомы в 600 мкл PBS при нескольких различных соотношениях (например, 1:50, 1: 100, 1: 300, 1: 600 и 1: 1200).
  3. Визуализируйте экзосомы рассеяния лазерного света с помощью соответствующего инструмента и программного обеспечения в режиме реального времени в соответствии с производства фирмыПротокол RER в 20.
  4. Повышение уровня камеры в режиме съемки, пока частицы не становятся видимыми, а затем настроить фокус, чтобы сделать частицы выглядят гладкими.
  5. В то время как в стандартном режиме, уменьшить камеру до самого низкого уровня, что частицы все еще можно увидеть, при необходимости отрегулировать затвор камеры и усиления для достижения этой цели.
  6. Визуально проверьте, чтобы обеспечить 20-100 частицы видны на экране, если не промывать устройство и регулировки разбавления в PBS.
  7. Затем отрегулируйте длительность съемки до между 30-60 сек. После того, как видео захватывается, настроить параметры обработки до тех пор, пока все частицы идентифицируются на экране и обрабатывать видео файл.

4. экзосома характеристика Вестерн-блоттингом

  1. Lyse экзосома гранул из 2-5 мл желчи в 100 мкл охлажденного льдом радиоиммуноосажден анализа (РИПО) буфера с ингибитором протеазы пипетированием вверх и вниз и тщательно перемешать лизатов энергично в течение 30 секундна вихрь, чтобы эффективно растворять белки.
  2. В то время как большую часть времени нет необходимости, использовать импульсно-ультразвуковую обработку образцов на льду с 2 импульсами в течение 10 сек каждый для обеспечения полного лизиса.
  3. Гранул нерастворимый материал центрифугированием при 15000 х г при температуре 4 ° С в течение 5 мин и переносят надосадочную жидкость в чистую пробирку.
  4. Определить концентрацию белка с методом выбора (т.е. бицинхониновой кислоты (ВСА), Кумасси, модифицированный Лоури, 660 нм Protein Assay и т.д.) в соответствии с протоколом производителя. Метод не столь важен, пока тот же метод используется последовательно для достижения результатов, которые могут быть сопоставлены между экспериментами.
  5. Нагрузка на 50 мкг белка на пробу в буфере Лэммли после нагревания образца при 95 ° С в течение 5 мин в лунку полиакриламидного геля для электрофореза (PAGE).
  6. Electrophorese образцов на ДСН в течение 1,5 ч и передать выделенные белки на нейлоновую мембрану.
  7. Взафиксировать мембрану (ы) с 5% обезжиренным молоком в Трис-буферном солевом растворе с 0,1% Tween 20 (ТБС-Т) в течение 1 ч, а затем инкубируют с экзосом-специфических антител, таких как анти-CD63 и анти-TSG-101 при разведении 1: 500, предпочтительно O / N при температуре 4 ° С.
  8. Промыть мембраны с TBS-T 3 х 10 мин, а затем инкубируют с подходящим, соответствующие конъюгированным с пероксидазой хрена вторичного антитела в 5% обезжиренным молоком в TBS-T в течение 1-2 ч при комнатной температуре.
  9. Промойте мембрану (ы) 3 х 5 мин с TBS-T и обнаружить специфические белки с ХЛ реагентами в соответствии с протоколом производителя.
  10. Изображение мембраны с пленкой или системой цифровой обработки изображений в соответствии с протоколом производителя.

5. микроРНК Изоляция от изолированного экзосомы

Примечание: Выделение микроРНК из желчи экзосомы осуществляется с использованием модифицированной изоляции микроРНК, основанную на коммерчески доступного набора, но и любой другой метод выделения РНК могут быть использованы или адаптированы.

  1. Добавить 300 &# 181; л лизиса / здание буфера к экзосома гранул (выделенной из 400 мкл желчи), вихря, пипеткой или пройти через иглы / шприца полностью лизировать экзосомы, чтобы получить однородную лизата.
  2. Добавить 1/10 (30 мкл) объем микроРНК гомогената добавки, и хорошо перемешать встряхиванием или переворачивания пробирки несколько раз.
  3. Выдержите смесь в течение 10 мин на льду.
  4. Добавьте объем кислотно-фенол: хлороформ, равный начальной гомогената (300 мкл).
  5. Добавьте 5 мкл 5 фмоль / мкл Cel-MIR 39 и вихрь в течение 30-60 сек.
  6. Центрифуга в течение 5 мин при 10000 х г при комнатной температуре, чтобы отделить водный (верхний) и органической (нижней) фазы.
  7. Тщательно аспирата верхнюю фазу пипеткой и переноса в свежую пробирку отметив при этом объем передаваемого. Выбросите органическую фазу в соответствующий контейнер органических отходов.
  8. Для обогащения для малых РНК добавляют 1/3 объема 100% этанола к восстановленным водной фазы и перемешать тщательно встряхивая или переворачивания втбыть в несколько раз.
  9. Пипеткой смесь лизата / этанола на фильтрующем элементе, вплоть до 700 мкл за один раз.
  10. Центрифуга картриджи в течение 15 секунд при максимальной температуре 10000 XG или применить вакуум, чтобы передать смесь через фильтр.
  11. Собирают фильтрат и, если смесь лизат / этанол превышает 700 мкл, передавать Проточный в новую пробирку и повторить процедуру, чтобы собрать все фильтратов. Эти фильтр содержит РНК-фракции, лишенные малых РНК и может быть использован для восстановления этих больших РНК.
  12. Добавить 2/3 объема RT 100% этанола к общему фильтрата и тщательно перемешать встряхиванием.
  13. Пипеткой смесь фильтрата / этанол на второй картридж фильтра. Как и прежде, чем максимальный объем, который может быть применен сразу 700 мкл.
  14. Центрифуга в течение 15 сек при 10000 мкг или применять вакуум, как описано в шаге 5.10.
  15. Откажитесь от проточных, и повторять, пока все смеси фильтрат / этанол был отфильтрован.
  16. Применить 70081, л микроРНК промывочного раствора 1 в картридж фильтра, центрифуги в течение 5-10 сек или применять вакуум и отбросить проточные.
  17. Промыть фильтр с 500 мкл промывочного раствора 2/3, как это сделано на этапе 5.16.
  18. Повторите мыть второй раз с 500 мкл промывочного раствора 2/3, как на стадии 5.16, выбросьте проточные и поместите фильтр обратно в пробирку.
  19. Спин картридж фильтра в течение 1 мин при 10000 мкг, чтобы удалить все остатки жидкости из фильтра.
  20. Перенести картридж фильтра в свежую пробирку для сбора и применять 100 мкл горячей (95 ° С) от нуклеазы свободной воды к центру фильтра.
  21. Спин сборки в течение 20-30 сек при максимальной скорости, чтобы восстановить РНК.
  22. Соберите элюат и использовать сразу или хранить при -80 ° С.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Поскольку экзосомы слишком малы, чтобы быть обнаружены с помощью регулярной микроскопии или поточной цитометрии, электронная микроскопия или оптический анализ наночастиц должен быть выполнен. Оптический анализ наночастица имеет преимущество по сравнению с электронной микроскопией, что она также количественный и обеспечивает распределение по размеру и концентрации. Прибор представляет тонко сфокусированного лазерного луча через стеклянную призму в образец. Броуновское движение изолированн...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для того, чтобы надежно использовать экзосомы, выделенные из желчи, важно использовать последовательные методы высокого качества изоляции, чтобы получить высокие образцы качества взамен. Методика определена в данной работе является устоявшейся способ изолировать экзосомы и микроРНК из желчи человека. Это выдвигает на первый план несколько важных шагов в характеристике выделенных экзосомы, которые, как минимум, должен состоять электронной микроскопии или оптического анализа наночастиц и Вестерн-блоттинга.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ни у кого из авторов нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано премией K08 (DK090154-01) от Национальных институтов здравоохранения (NIH; в пользу F.M.S.).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,2 & микро; m Полиэфирсульфоновый (PES) мембранный фильтрCorning431229
тонкостенные полиалломерные ультрацентрифужные трубки Ротор Beckman Coulter331374
SW40TiBeckman Coulter
LM10-HS Программное обеспечение Nanosight
для анализа наночастиц (NTA) Nanosight
mirVANALife TechnologiesAM1560
Полный ингибитор протеазыRoche распространяется Sigma-Aldrich4693116001
Immobilon PSQMillipore, Bedford MAISEQ00010
антитела Anti-CD63Abcamab59479
Anti-Tsg101Abcamab30871

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Admyre, C., et al. Exosomes with immune modulatory features are present in human breast milk. J. Immunol. 179 (3), 1969-1978 (2007).
  2. Aushev, V. N., et al. Comparisons of microRNA patterns in plasma before and after tumor removal reveal new biomarkers of lung squamous cell carcinoma. PLoS One. 8 (10), e78649(2013).
  3. Ben-Dov, I. Z., et al. Urine microRNA as potential biomarkers of autosomal dominant polycystic kidney disease progression: description of miRNA profiles at baseline. PLoS One. 9 (1), e86856(2014).
  4. Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials. Biochim. Biophys. Acta. 1820 (7), 940-948 (2012).
  5. Kosaka, N., Iguchi, H., Yoshioka, Y., Takeshita, F., Matsuki, Y., Ochiya, T. Secretory mechanisms and intercellular transfer of microRNAs in living cells. J. Biol. Chem. 285 (23), 17442-17452 (2010).
  6. Mittelbrunn, M., et al. Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells. Nat. Commun. 2, 282(2011).
  7. Pegtel, D. M., van de Garde, M. D., Middeldorp, J. M. Viral miRNAs exploiting the endosomal-exosomal pathway for intercellular cross-talk and immune evasion. Biochim. Biophys. Acta. 1809 (11-12), 715-721 (2011).
  8. Peinado, H., et al. Melanoma exosomes educate bone marrow progenitor cells toward a pro-metastatic phenotype through MET. Nat. Med. 18 (6), 883-891 (2012).
  9. Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat. Rev. Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).
  10. Valadi, H., Ekstrom, K., Bossios, A., Sjostrand, M., Lee, J. J., Lotvall, J. O. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nat. Cell Biol. 9 (6), 654-659 (2007).
  11. Bessho, K., et al. Integrative genomics identifies candidate microRNAs for pathogenesis of experimental biliary atresia. BMC Syst. Biol. 7, (2013).
  12. Calin, G. A., et al. MicroRNA profiling reveals distinct signatures in B cell chronic lymphocytic leukemias. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (32), 11755-11760 (2004).
  13. Collins, A. L., et al. A differential microRNA profile distinguishes cholangiocarcinoma from pancreatic adenocarcinoma. Ann. Surg. Oncol. 21 (1), 133-138 (2014).
  14. He, L., et al. A microRNA polycistron as a potential human oncogene. Nature. 435 (7043), 828-833 (2005).
  15. Taylor, D. D., Gercel-Taylor, C. MicroRNA signatures of tumor-derived exosomes as diagnostic biomarkers of ovarian cancer. Gynecol. Oncol. 110 (1), 13-21 (2008).
  16. Rabinowits, G., Gercel-Taylor, C., Day, J. M., Taylor, D. D., Kloecker, G. H. Exosomal microRNA: a diagnostic marker for lung cancer. Clin. Lung Cancer. 10 (1), 42-46 (2009).
  17. Skog, J., et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. Nat.Cell Biol. 10 (12), 1470-1476 (2008).
  18. Lance, R. S., Drake, R. R., Troyer, D. A. Multiple recognition assay reveals prostasomes as promising plasma biomarkers for prostate cancer. Expert Rev. Anticancer Ther. 11 (9), 1341-1343 (2011).
  19. Li, L., et al. Human bile contains microRNA-laden extracellular vesicles that can be used for cholangiocarcinoma diagnosis. Hepatology. 60 (3), 896-907 (2014).
  20. Gabriel, D. A., Giordano, K. Microparticle sizing and counting using light scattering methods. Semin. Thromb. Hemost. 36 (8), 824-832 (2010).
  21. Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 30, 255-289 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи