Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Один шаг Отрицательный хроматографической очистки

9.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54043

⸱

18 июня 2016 г.

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Molecular and Cellular Biology, National Tsing Hua University, 2Department of Life Science, National Tsing Hua University

В этой статье

Краткое содержание

Высокий метод доходности для одностадийного отрицательной очистки рекомбинантного Helicobacter Pylori активирующий нейтрофилы белок (HP-NAP) суперэкспрессированный в кишечной палочки с помощью диэтиламиноэтиловыми смол в пакетном режиме описана. HP-NAP очищают с помощью этого метода является полезным для разработки вакцин, лекарств, или для диагностики H. пилори -associated заболеваний.

Аннотация

Helicobacter Pylori активирующий нейтрофилы белок (НР-NAP) является одним из основных факторов вирулентности Helicobacter Pylori (H.). Он играет важную роль в H. пилори индуцированный воспаление желудка путем активации нескольких врожденных лейкоциты , включая нейтрофилы, моноциты, и тучных клеток. Иммуногенные и иммуномодулирующие свойства HP-NAP делают его потенциальной диагностики и вакцины кандидат на H. пилори и новый кандидат препарат для лечения рака. Для того чтобы получить значительные количества очищенного HP-NAP, используемой для его клинического применения, является эффективным способом, чтобы очистить этот белок с высоким выходом и чистотой должна быть установлена.

В этом протоколе, мы описали метод одностадийного отрицательной хроматографической очистки рекомбинантного HP-NAP избыточная экспрессия Escherichia coli (E.coli) с помощью диэтиламиноэтил (DEAE) ионообменной смолы (например., Колонки Sephadex) Iп пакетном режиме. Рекомбинантный НР-NAP составляет почти 70% от общего количества белка в E. палочка и почти полностью восстановилась в растворимой фракции после лизиса клеток при рН 9,0. При оптимальном состоянии при рН 8,0, большинство HP-NAP восстанавливается в несвязанной фракции в то время как эндогенные белки из E. палочка эффективно удаляются с помощью смолы.

Этот метод очистки с использованием отрицательной пакетном режиме хроматографии с DEAE ионообменных смол дает функциональную HP ворсом из E. палочки в своей нативной форме с высоким выходом и чистотой. Очищенный HP-NAP может быть дополнительно использован для профилактики, лечения, и прогноз H. пилори -associated заболеваний, а также терапии рака.

Введение

Helicobacter Pylori (H.) является основной причиной гастрита и язвенной болезни. Эта бактерия также классифицируется как канцероген в организме человека Международным агентством по изучению рака, часть Всемирной организации здравоохранения, в 1994 году было подсчитано , что распространенность H. инфекции пилори составляет 70% в развивающихся странах и на 30-40% в промышленно развитых странах 1. Даже при том , что уровень инфицированности H. пилори снижается в промышленно развитых странах, уровень инфицированности H. пилори в развивающихся странах по - прежнему высок 2. Стандартное лечение искоренить H. Инфекция пилори состоит из введения ингибитора протонной помпы, ИПП и двух антибиотиков, кларитромицин плюс амоксициллин или метронидазол 3. Тем не менее, повышение резистентности к антибиотикам у H. пилори терапия язвенной болезни о связанных настоятельно призывает к разработке новых стратегий по предотвращению Oг вылечить инфекцию. Разработка профилактических и / или терапевтической вакцинации против H. пилори может обеспечить альтернативный подход к контролю H. пилори инфекции.

Хеликобактерной активирующий нейтрофилы белок (HP-NAP), одним из основных факторов вирулентности пилори H, был впервые выявлен в водных экстрактов H. пилори с возможностью активировать нейтрофилы придерживаться эндотелиальных клеток и производят активные формы кислорода (ROS) 4. Нейтрофильной инфильтрации слизистой оболочки желудка обнаружено в H. pylori- инфицированных пациентов с активным гастритом может привести к воспалению и повреждению тканей желудка. Таким образом, НР-NAP может играть патологическую роль при активации нейтрофилов , чтобы вызвать воспаление желудка, которое вызывает дальнейшее язву или Н. пилори -associated заболеваний желудка. Тем не менее, НР-NAP является потенциальным кандидатом для клинического применения 5,6. В связи с иммуногенной и иммуномодулирующим проperties НР-NAP, этот белок может быть использован для разработки вакцин, терапевтических средств и диагностических инструментов. Клиническое исследование было проведено с использованием рекомбинантного для HP-NAP в качестве одного из компонентов белковой вакцины против H. пилори. Эта вакцина состоит из рекомбинантного HP-NAP, цитотоксин-ассоциированный ген (CagA) и вакуолизирующий цитотоксин А (VacA) белков , сформулированного с гидроксидом алюминия и далее было показано , что безопасность и иммуногенность у человека 7. Кроме того , НР-NAP действует как мощный иммуномодулятор , чтобы вызвать Т - хелперов типа 1 (Th1) -поляризованым иммунные ответы для лечения рака 8 и вниз регулировать Th2-опосредованные иммунные реакции , индуцируемые аллергических реакций и паразитарных инфекций 9,10. Что касается диагностики, рекомбинантный НР-NAP на основе ELISA , был применен для выявления антител сыворотки против HP-NAP в H. пилори -infected пациентов 11. Одно исследование показало , что уровень HP-NAP-специфических антител в сыворотке крови от H. PYLori -infected пациентов с раком желудка была достоверно выше , чем у пациентов с хроническим гастритом 12. Другое исследование также показало , что сывороточные антитела против HP-NAP связаны с наличием не-кардии аденокарциномы желудка 13. Таким образом, рекомбинантный НР-NAP на основе ELISA , может быть применен для определения сывороточных антител против HP-NAP для прогноза рака желудка в H. пилори -infected пациентов. Взятые вместе, очищенный HP-NAP может быть дополнительно использован для профилактики, лечения, и прогноз H. пилори -associated заболеваний, а также терапии рака.

Среди нескольких методов , используемых для очистки рекомбинантного HP-NAP выражается в Escherichia coli (E.coli) в своей нативной форме сообщалось до сих пор, необходим второй этап очистки с участием гель-фильтрационной хроматографии с получением высокочистого НР-NAP 14-16 , При этом способ с использованием негативного режима пакетной хроматографии сдиэтиламиноэтил (DEAE) ионообменные смолы описана для очистки HP-NAP сверхэкспрессируется в E. палочка с высоким выходом и высокой степенью чистоты. Этот метод очистки был основан на связывании белков клетки-хозяина и / или других, чем HP-NAP к смоле примесей. При рН 8,0, почти нет других белков, кроме HP-NAP извлекают из несвязанной фракции. Такая очистка подход с использованием DEAE ионообменной хроматографии в отрицательном режиме проста и экономии, позволяя очистку рекомбинантного HP-NAP с помощью одностадийной хроматографии путем сбора несвязанной фракции времени. В дополнение к HP-NAP, несколько других биомолекул, таких как вирусы 17, иммуноглобулин G (IgG) , 18, ​​гемоглобин 19, протеинфосфатазы 20, и фактор вирулентности флагеллином 21, также , как сообщалось, очищают с помощью ионообменной хроматографии в негативном Режим. Отрицательный режим является предпочтительным для ионообменной хроматографии, если примеси являются незначительнымикомпоненты , присутствующие в образце , подвергнутого быть очищено 22. Применение отрицательной хроматографии в очистки природных или рекомбинантных биомолекул был недавно рассмотрен 23.

В настоящем докладе дается шаг за шагом протокола для экспрессии рекомбинантного HP-NAP в E. палочка, лизис клеток и очистки HP-NAP с использованием негативного режима пакетной хроматографии с DEAE ионообменных смол. Если белок желательно для очистки пригоден для ионообменной хроматографии в отрицательном режиме, описанный протокол также может быть адаптирована в качестве отправной точки для разработки способа очистки.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Человеческая кровь собирали у здоровых добровольцев с предварительного письменного информированного согласия и одобрения Совета по институциональному обзору Национального университета Цинхуа, Синьчжу, Тайвань.

1. Экспрессия рекомбинантных HP-NAP в E. палочки

  1. Приготовьте плазмиду pET42a-NAP , содержащую последовательность ДНК HP-NAP от H. пилори 26695 штамма , как описано выше 16. Подготовьте плазмиды, содержащие последовательность ДНК HP-NAP с желаемыми точечных мутаций, как описано (см протокол, этап 8).
  2. Преобразование 10 нг вышеуказанных плазмид ДНК в E. палочка BL21 (DE3) компетентные клетки теплового шока в течение 45 секунд при 42 ° С, полоса клетки на лизогении бульона (LB) агаром , содержащих 50 мкг / мл канамицина, и инкубировать пластин при 37 ° С в течение 16 часов.
  3. Инокулируйте единичные колонии в отдельные пробирки, содержащие 5 мл LB бульона из 50 мкг / мл канамицина, и выращивают их в качестве предварительных культивирований в 37 ° С в течение 16 часов при встряхивании со скоростью 170 оборотов в минуту.
  4. Инокулируйте 2 мл вышеназванного клеток предварительной культуры в 200 мл LB бульона, содержащего 50 мкг / мл канамицина, в колбу емкостью 1 л. Выдержите привит культуры колбы при 37 ° С в течение 2 ч при встряхивании при 170 оборотах в минуту, пока поглощение при 600 нм не достигнет приблизительно 0.4-0.5 детектируется УФ / ВИД спектрофотометр.
  5. Добавляют 80 мкл 1 М изопропилового β-D-1-тиогалактопиранозида (IPTG) в указанную выше культуру до конечной концентрации 0,4 мМ, чтобы индуцировать экспрессию HP-NAP. Инкубируйте культуру в течение 3 часов, пока поглощение при 600 нм не достигает приблизительно 1,6-1,7.
  6. Центрифуга клетки при 6000 мкг при 4 ° С в течение 15 мин, чтобы удалить надосадочную жидкость. Хранить осадок клеток при -70 ° С до очистки.

2. Приготовление фракции растворимого белка, содержащего HP-NAP

Примечание: Все следующие шаги выполняются при температуре 4 ° С.

  1. Ресуспендируют в 50 мл клеточной рellet подготовлен в Протоколе стадии 1.6, в 20 мл 20 мМ Трис-HCl, рН 9,0, 50 мМ NaCl, содержащего 0,13 мМ фенилметилсульфонилфторида (ФМСФ), 0,03 мМ N-альфа-тозил-L-лизинильных-chloromethylketone (TLCK) и 0,03 мМ N-тозил-L-phenylalaninyl-chloromethylketone (ТРСК) при температуре 4 ° С , как описано ранее 16.
  2. Разрушени клеток бактерий путем прохождения бактериальной суспензии через гомогенизатор высокого давления, работающие в диапазоне от 15000 до 20000 фунтов на квадратный дюйм в течение 7 раз при 4 ° С.
  3. Центрифуга Клеточный лизат при 30000 х г при температуре 4 ° С в течение 1 часа, чтобы отделить растворимые и нерастворимые фракции белков с помощью ультрацентрифуге. Передача супернатант в качестве фракции растворимого белка в стакан.
  4. Измерение концентрации белка в растворимой фракции белка по методу Бредфорда с использованием коммерческого набора с бычьим сывороточным альбумином (БСА) в качестве стандарта в соответствии с инструкциями изготовителя.
  5. Добавить 177,6 мкл 1 N HCl в 20 мл йе фракцию растворимого белка, полученный из протокола стадии 2.3, чтобы регулировать его значение рН от рН 9,0 до рН 8,0.
  6. Добавить 20 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 50 мМ NaCl, к указанному выше раствору белка с приведением конечной концентрации белка в 0,5 мг / мл.

3. Очистка рекомбинантного HP-NAP из E. палочки отрицательным Пакетный режим хроматографии с DEAE ионообменных смолах

  1. Приготовьте 15 мл ДЭАЭ смол.
    1. Взвешивают 0,6 г сухого порошка ДЭАЭ смол и подвесить его в 30 мл 20 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 50 мМ NaCl, при комнатной температуре в течение по крайней мере 1 день.
    2. Центрифуга смолы при 10000 х г при температуре 4 ° С в течение 1 мин.
    3. Удалите и отбросить супернатант.
    4. Добавьте 15 мл 20 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 50 мМ NaCl.
    5. Повторите шаги 3.1.2 Протокол 3.1.4 четыре раза больше.
    6. Хранить в 15 мл смолы (обосновались 50% суспензии в 30 мл Трис-буфер) при 4 ° С для последующего использования.
      Примечание: Все на следующей стадииs проводят при температуре 4 ° С.
  2. Добавить 45 мл растворимых белков, полученных в стадии протокола от 2,6 до 15 мл смолы и приготовленную суспензию белка / смолы с магнитной мешалкой при температуре 4 ° С в течение 1 часа.
  3. Налить шлам белковый / смолы в колонку с пластиковой или стеклянной, снабженной запорным краном. Дайте смолу селиться под действием силы тяжести.
  4. Откройте запорный кран, чтобы позволить раствору белка бежать через колонку самотеком до тех пор пока уровень жидкости в колонне не только выше смолы. Соберите проточного как несвязанной фракции, которая содержит очищенный HP-NAP.
  5. Добавьте 15 мл охлажденного льдом 20 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 50 мМ NaCl в колонку.
  6. Откройте запорный кран, чтобы позволить промывочный буфер для запуска через колонку самотеком до тех пор пока уровень жидкости в колонне не только выше смолы. Собирают Проточный в качестве промывного фракции.
  7. Повторите шаги Протокол от 3,5 до 3,6 раза четыре больше, чтобы собрать дополнительные фракции мыть.
  8. Добавьте 15 мл охлажденного льдом 20 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 1 М NaCl в колонну.
  9. Откройте запорный кран, чтобы позволить элюирующий буфер для запуска через колонку самотеком до тех пор пока уровень жидкости в колонне не только выше смолы. Соберите проточного как элюирования фракции.
  10. Повторите шаги Протокол от 3,8 до 3,9 раза четыре больше, чтобы собрать дополнительные фракции элюирования.

4. Буфер обмена и эндотоксина Удаление HP-NAP Очищают Negative Пакетный режим хроматографии с DEAE Смолы

Примечание: Очищенный НР-NAP экспрессируется в E. палочка должна быть подвергнута буфер обмена и удаление эндотоксина до начала стимуляции нейтрофилов.

  1. Выполните диализ , чтобы изменить буфер очищенного HP-NAP в фосфатно-буферном солевом растворе Дульбекко (D-PBS), рН 7,2, при 4 ° С с использованием диализных трубок с пропускания по молекулярному весу 14 кДа , как описано ранее 24.
  2. Фильтр диализуют HP-NAP через syringе фильтр с положительно заряженной гидрофильной мембраны, прикрепленной к 20 мл одноразового шприца при скорости потока в пределах от 2,5 до 4 мл / мин при 4 ° С для удаления эндотоксина.

5. Определение характеристик молекулярных свойств очищенным рекомбинантным HP-NAP с помощью додецилсульфата натрия-электрофорезом на геле полиакриламида (SDS-PAGE), вестерн-блоттинга, Native-PAGE, гель-фильтрационная хроматография, кругового дихроизма спектроскопии

  1. Анализ очищенного рекомбинантного HP-NAP с помощью SDS-PAGE и вестерн - блоттинга с гибридомной культуры надосадочную жидкость , содержащую моноклональное антитело мыши MAb 16F4 25 , как описано выше 24.
  2. Анализ очищенного HP-NAP нативным-PAGE и гель - фильтрационной хроматографии с целью изучения его олигомерного состояния , как описано выше 26.
  3. Анализ очищенного рекомбинантного HP-NAP с помощью спектроскопии кругового дихроизма для изучения его вторичную структуру , как описано выше 26.

6. Оценка чистоты HP-NAP серебром окрашиванием геля SDS-PAGE

  1. Подготовить Фиксирующий раствор, сенсибилизации раствор, раствор серебра, разработка решения, стоп-раствор и промывочный раствор в соответствии с инструкцией изготовителя набора для окрашивания серебром.
  2. Выполните серебряное окрашивание геля SDS-PAGE в соответствии с инструкцией изготовителя набора для окрашивания серебром.
  3. Приобретать изображение геля с системой визуализации.

7. Измерение РОС производства нейтрофилами, индуцированный HP-NAP

  1. Изолировать нейтрофилов человека из гепаринизированной крови человека путем осаждени с применением декстрана с последующим центрифугированием в градиенте плотности , как описано выше 24.
  2. Измерение производства ROS из нейтрофилов, стимулированных HP-NAP с помощью люминолзависимой хемилюминесценции анализа.
    1. Включите планшет-ридере и установить температуру при 37 ° С. Разместитьпустой плоское дно 96-луночного белая пластина внутри пластины считывания камеры, позволяя ей нагреваться до 37 ° С.
    2. Готовят Стимул смеси в D-PBS, рН 7,2, содержащего 0,9 мМ CaCl 2, 0,5 мМ MgCl 2, и 13,3 мкМ 5-амино-2,3-дигидро-1,4-фталазиндион (люминол) с наличием и отсутствием 0,67 мкМ эндотоксинов удаляют HP-NAP, полученного из протокола шага 4.2.
    3. Регулировка концентрации нейтрофилах человека , приготовленных из протокола шага от 7,1 до 2 × 10 6 клеток / мл в D-PBS, рН 7,2, содержащем 5 мМ глюкозы.
    4. Добавляют 50 мкл суспензии нейтрофилов в каждую лунку 96-луночного в то время как пластины.
    5. Добавьте 150 мкл стимулирующих смесей, приготовленных из протокола этапа 7.2.2 в лунку, содержащую нейтрофилы в интервале времени 5 секунд на каждую лунку.
    6. Измерьте излучение хемилюминесценции в течение 5 сек на лунку в течение в течение трех часов с использованием планшет-ридера.

8.Конструирование ДНК плазмид укрывательство HP-NAP Мутанты с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) основе сайта-прямой мутагенеза

Примечание: ПЦР-сайт-прямой мутагенез был создан в основном , как описано ранее 27 за исключением того, что "молчащие" сайты рестрикции были введены мутагенеза праймеров с помощью сайт-направленного мутагенеза (SDM) -assist программного обеспечения 28.

  1. Выполнение реакции ПЦР.
    1. Добавляют 10 нг плазмиды pET42a-NAP, 1 мкМ пар праймеров мутагенеза , перечисленных в Таблице 1, 200 мкМ дезоксинуклеозидтрифосфатами (дНТФ), и 3 единицы с высокой точностью воспроизведения смеси ферментов ПЦР в ПЦР - пробирку , содержащие деионизированную воду, давая окончательное объем 25 мкл.
    2. Инициировать циклов ПЦР при 95 Не ° С в течение 10 мин дл денатурации ДНК - матрицы, и следуют с 12 циклов амплификации при 95 ° С в течение 1 минуты, Тпл нет -5 ° С в течение 1 минуты и 72 ° С в течение 6 мин.
    3. Завершите циклы ПЦР сстадию отжига при Т м п.п. -5 ° С в течение 1 мин и стадию удлинения при 72 ° С в течение 30 мин.
  2. Treat 15 мкл ПЦР-продукта с 0,4 мкл ДПН I рестриктазы при 37 ° С в течение 2 ч, а затем анализируют по 2 мкл ДПШ I-обработанного продукта ПЦР с помощью электрофореза в агарозном геле.
  3. мутанты экрана.
    1. Transform 2 мкл ПЦР - продукта в E. палочки DH5 & компетентные клетки путем теплового шока в течение 45 секунд при 42 ° C.
    2. Распространение трансформированных клеток на пластине LB, содержащей 50 мкг / мл канамицина и инкубируйте при 37 ° C в течение 16 часов.
    3. Изолировать плазмидной ДНК из бактериальных колоний с использованием коммерческого набора для щелочного лизиса в соответствии с протоколом производителя.
    4. Лечить плазмиды ДНК, выделенной в Протоколе стадии 8.3.3 с XhoI ферментом рестрикции, чтобы проверить наличие желаемых молчащих мутаций в соответствии с протоколом производителя.
    5. Выстраивание последовательностиДНК плазмиды уточнена шагом протокола 8.3.4 с промотором Т7 праймера, чтобы подтвердить коррекцию кодирующей последовательности мутантов НР-NAP в соответствии с протоколом производителя.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Принципиальная схема экспериментальной процедуры отрицательной очистки рекомбинантного HP-NAP экспрессируется в E. палочка с использованием DEAE ионообменных смол в пакетном режиме, показан на рисунке 1. Этот метод очистки основан на связывании белков клетки - хозяина и / или других , чем HP-NAP к смоле примесей. При рН 8,0, почти нет других белков , кроме HP-NAP в своей нативной форме извлекают из несвязанной фракции (Фигура 2А и В).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Отрицательный пакетный режим хроматографии с DEAE анионитов , представленные здесь подходит для очистки рекомбинантного HP-NAP сверхэкспрессируется в E палочки. Значения рН буферов , используемых на стадиях лизиса клеток и очистки очень важно для обеспечения растворимости HP-NAP в E. палочки лизаты и эффективное отделение рекомбинантного HP-NAP от примесей клеток хозяина, соответственно. Бактериальные клетки должны быть лизированы при рН 9,0, а отрицательный очистку следует проводить при рН 8,0 для пол...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

HWF и YCY являются изобретателями патентов TW I 432579 и US 8,673,312 на способ одноступенчатой очистки белка, активирующего нейтрофилы Helicobacter pylori . Все материалы, описанные в рукописи, будут доступны для исследовательских целей. Авторы подтверждают, что это не меняет их приверженности всем политикам JoVE в отношении обмена данными и материалами.

Благодарности

Мы благодарим доктора Чао-Шэн Ченга из Национального университета Цинхуа, Тайвань, за проведение измерения кругового дихроизма. Мы также благодарим докторов Евантию Галанис и Янко Д. Янкова из клиники Майо, США, за предоставление моноклонального антитела против HP-NAP. Мы выражаем признательность докторам Хань-Вэнь Чангу и Чун-Чу Чену из Мемориальной больницы Маккая, Синьчжу, Тайвань, за предоставление консультаций по применению IRB, г-ну Те-Лунг Цай из Мемориальной больницы Маккая, Синьчжу, Тайвань, за руководство анализом изолированных нейтрофилов, и г-же Цзюй-Чен Вэн из Национального университета Цинхуа, Тайвань, за ее техническую помощь. Эта работа была поддержана грантами Министерства науки и технологий Тайваня (MOST 104-2311-B-007-003, NSC101-2311-B-007-007 и NSC98-2311-B-007-006-MY3), совместной исследовательской программой Национального университета Цинхуа и Мемориальной больницы Маккея (100N7727E1, 101N2727E1, 103N2773E1) и исследовательской программой Национального университета Цинхуа (104N2052E1).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы



Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<прочный>Материал
pET42a-NAP Н/ДН/Дподготовлен в соответствии с Дополнительными данными Refernce 15 
> http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0006291X08018317E. coli BL21 (DE3)Thermo Fisher Scientific IncC6000-03https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/C600003
КанамицинAmresco25389-94-0http://www.amresco-inc.com/KANAMYCIN-SULFATE-0408.cmsx
Изопропил &бета;-D-1-тиогалактопиранизид (IPTG)MD Biomedical Inc101-367-93-1http://www.antibody-antibodies.com/product_det.php?id=238064&supplier=search&name
=IPTG%20
фенилметилсульфонилфторид (PMSF)Sigma-Aldrich10837091001ингибитор протеазы
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/PMSFRO?lang=en®ion=TW
N-альфа-тозил-L-лизинил-хлорметилкетон (TLCK)Ингибитор протеазыSigma-AldrichT7254
N-тозил-L-фенилаланинил-хлорметилкетон (TPCK)Ингибитор протеазыSigma-AldrichT4376
Стандарт белка (бычий сывороточный альбумин)Sigma-AldrichP5619 стандартный белок для Bio-Rad Protein Assay
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/p5619?lang=en®ion=TW
DEAE– Сефадекс   форма хлорида А-25Sigma-AldrichA25120http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a25120?lang=en®ion=TW
диализной трубке Spectrum/PorSpectrum Laboratories132720с молекулярной массой 14 кДа<бр/> http://www.spectrumlabs.com/dialysis/RCtubing.html?Pn=132720;
Агрегаты Acrodisc® с Mustang® Мембрана EPallMSTG25E3для удаления эндотоксинов; работает при скорости потока от 1 до 4 мл/мин
http://www.pall.com/main/laboratory/product.page?id=19992
мышиного моноклонального антитела MAb 16F4N/AN/Aподнятого против очищенного HP-NAP штамма H. pylori NCTC 11637, как описано в Refernce 23;   Подарок от докторов Эвантии Галанис и Янко Д. Янкова из клиники Майо, США
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0264410X10017585
HiLoad 16/600 Superdex 200 pgGE Healthcare Life Sciences28989335для гелевой фильтрации хроматографии
http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28989335
набор для окрашивания серебра PlusOne, белокGE Healthcare Медико-биологические науки17-1150-01http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/17115001
Ficoll-Paque PLUSGE Здравоохранение Медико-биологические науки17-1440-02для центрифугирования градиента плотности для очистки нейтрофилов человека
http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-tw/products/AlternativeProductStructure
_16963/17144002
Плоскодонная 96-луночная белая пластинаThermo Fisher Scientific Inc236108http://www.thermoscientific.com/en/product/nunc-f96-microwell-black-white-polystyrene-plate.html
люминоломSigma-AldrichA8511защищена от света<бр/> http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a8511?lang=en®ion=TW
Expand   Длинная матричная ПЦР-системаSigma-Aldrich11681834001источник высокоточного ПЦР-фермента mix
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/elongro?lang=en®ion=TW
Dpn INew England BiolabsR0176Shttps://www.neb.com/products/r0176-dpni
Xho INew England BiolabsR0146Shttps://www.neb.com/products/r0146-xhoi
E. coli DH5αThermo Fisher Scientific Inc18265-017https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18265017
Name<strong>Company>Номер продуктаКомментарии
Equipment
 
U-2800 двухлучевой УФ/ВИД спектрофотометрHitachi Н/Дснят с рынка и модернизирован до новой модели<бр/> http://hitachi-hta.com/products/life-sciences-chemical-analysis/uvvisible-spectrophotometers
гомогенизатор высокого давления EmulsiFlex-C3Avestin IncC315320http://www.avestin.com/English/c3page.html
Hitachi Koki himac CP80WX общего ультрацентрифугиHitachi Koki Co90106401для выделения растворимых и нерастворимых белковых фракций из E. coli lysates
http://centrifuges.hitachi-koki.com/products/ultra/cp_wx/cp_wx.html
Ä KTA FPLCGE Healthcare Life Sciences18-1900-26для гель-фильтрации хроматографии
http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/18190026
Aviv model 62ADS CD спектрофотометрAviv BiomedicalN/Aвыведен из продажи и модернизирован до новой модели
http://www.avivbiomedical.com/circular.php LAS-3000 imaging systemFujifilmN/Aснят с производства и заменен
http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28955810
счетчик Wallac 1420 (Victor2) MultilabelCounter Perkin-Elmer1420-018для определения хемилюминесценции
http://www.perkinelmer.com/catalog/product/id/1420-018
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7254?lang=en®ion=TW http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4376?lang=en®ion=TW

Ссылки

  1. Centers for Disease Control and Prevention. Chapter 3, Infectious diseases related to travel. CDC Health Information for International Travel 2016. Brunette, G. W., et al. , Oxford University Press. (2015).
  2. Bauer, B., Meyer, T. F. The human gastric pathogen Helicobacter pylori its association with gastric cancer and ulcer disease. Ulcers. 2011, 340157(2011).
  3. Malfertheiner, P., et al. Management of Helicobacter pylori infection--the Maastricht IV/ Florence Consensus Report. Gut. Gut. 61 (5), 646-664 (2012).
  4. Evans, D. J. Jr., et al. Characterization of a Helicobacter pylori neutrophil-activating protein. Infect. Immun. 63 (6), 2213-2220 (1995).
  5. Fu, H. W. Helicobacter pylori neutrophil-activating protein: from molecular pathogenesis to clinical applications. World J. Gastroenterol. 20 (18), 5294-5301 (2014).
  6. de Bernard, M., D'Elios, M. M. The immune modulating activity of the Helicobacter pylori HP-NAP: Friend or foe? Toxicon. 56 (7), 1186-1192 (2010).
  7. Malfertheiner, P., et al. Safety and immunogenicity of an intramuscular Helicobacter pylori in noninfected volunteers: a phase I study. Gastroenterology. 135 (3), 787-795 (2008).
  8. Codolo, G., et al. HP-NAP inhibits the growth of bladder cancer in mice by activating a cytotoxic Th1 response. Cancer Immunol. Immunother. 61 (1), 31-40 (2012).
  9. Codolo, G., et al. The neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori Th2 inflammation in ovalbumin-induced allergic asthma. Cell. Microbiol. 10 (11), 2355-2363 (2008).
  10. Del Prete,, G,, et al. Immunosuppression of TH2 responses in Trichinella spiralis by Helicobacter pylori neutrophil-activating protein. J. Allergy Clin. Immunol. 122 (5), 908-913.e5 (2008).
  11. Tang, R. X., Luo, D. J., Sun, A. H., Yan, J. Diversity of Helicobacter pylori in expression of antigens and induction of antibodies. World J. Gastroenterol. 14 (30), 4816-4822 (2008).
  12. Long, M., Luo, J., Li, Y., Zeng, F. Y., Li, M. Detection and evaluation of antibodies against neutrophil-activating protein of Helicobacter pylori in patients with gastric cancer. World J. Gastroenterol. 15 (19), 2381-2388 (2009).
  13. Song, H., et al. A CagA-independent cluster of antigens related to the risk of noncardia gastric cancer: associations between Helicobacter pylori and gastric adenocarcinoma explored by multiplex serology. Int. J. Cancer. 134 (12), 2942-2950 (2014).
  14. Kottakis, F., et al. Helicobacter pylori neutrophil-activating protein activates neutrophils by its C-terminal region even without dodecamer formation, which is a prerequisite for DNA protection--novel approaches against Helicobacter pylori inflammation. FEBS J. 275 (2), 302-317 (2008).
  15. Thoreson, A. C., et al. Differences in surface-exposed antigen expression between Helicobacter pylori isolated from duodenal ulcer patients and from asymptomatic subjects. J. Clin. Microbiol. 38 (9), 3436-3441 (2000).
  16. Wang, C. A., Liu, Y. C., Du, S. Y., Lin, C. W., Fu, H. W. Helicobacter pylori neutrophil-activating protein promotes myeloperoxidase release from human neutrophils. Biochem. Biophys. Res. Commun. 377 (1), 52-56 (2008).
  17. Iyer, G., et al. Reduced surface area chromatography for flow-through purification of viruses and virus like particles. J. Chromatogr. A. 1218 (26), 3973-3981 (2011).
  18. Wongchuphan, R., et al. Purification of rabbit polyclonal immunoglobulin G using anion exchangers. Process Biochem. 46 (1), 101-107 (2011).
  19. Lu, X., Zhao, D., Su, Z. Purification of hemoglobin by ion exchange chromatography in flow-through mode with PEG as an escort. Artif. Cells Blood Substit. Immobil. Biotechnol. 32 (2), 209-227 (2004).
  20. Brooks, S. P., Storey, K. B. Purification and characterization of a protein phosphatase that dephosphorylates pyruvate kinase in an anoxia tolerant animal. Biochem. Mol. Biol. Int. 38 (6), 1223-1234 (1996).
  21. Gewirtz, A. T., et al. Salmonella typhimurium translocates flagellin across intestinal epithelia, inducing a proinflammatory response. J. Clin. Invest. 107 (1), 99-109 (2001).
  22. Levison, P. R. Large-scale ion-exchange column chromatography of proteins: Comparison of different formats. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 790 (1-2), 17-33 (2003).
  23. Lee, M. F. X., Chan, E. S., Tey, B. T. Negative chromatography: Progress, applications and future perspectives. Process Biochem. 49 (6), 1005-1011 (2014).
  24. Yang, Y. C., et al. High yield purification of Helicobacter pylori neutrophil-activating protein overexpressed in Escherichia coli. BMC biotechnol. 15 (23), (2015).
  25. Iankov, I. D., Haralambieva, I. H., Galanis, E. Immunogenicity of attenuated measles virus engineered to express Helicobacter pylori neutrophil-activating protein. Vaccine. 29 (8), 1710-1720 (2011).
  26. Shih, K. S., et al. One-step chromatographic purification of Helicobacter pylori protein expressed in Bacillus subtilis. PLoS One. 8 (4), e60786(2013).
  27. Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC biotechnol. 8 (91), (2008).
  28. Karnik, A., Karnik, R., Grefen, C. SDM-assist software to design site-directed mutagenesis primers introducing 'silent' restriction sites. BMC bioinformatics. 14 (105), (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

HP NAPDEAEpH
Один шаг Отрицательный хроматографической очистки
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.