Method Article

Микроинъекция для Трансгенез и редактирования генома в трехиглой колюшками

DOI:

10.3791/54055

⸱

May 13th, 2016

 ,  , 
1Department of Molecular and Cell Biology, University of California, Berkeley

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Трансгенные манипуляции и редактирования генома имеют решающее значение для функционально тестирования роли генов и цис - -regulatory элементов. Здесь подробный протокол микроинъекции для генерации геномных модификаций (в том числе Tol2-опосредованных флуоресцентных репортерных трансгенов конструкций, Таленс и CRISPRs) представлен для эмерджентное модели рыб, в трехиглой колюшки.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Трёхиглая колюшка рыбы возникла как мощной системы для изучения генетической основы широкого спектра морфологических, физиологических и поведенческих фенотипов. Замечательные разнообразные фенотипы, которые развивались, как морские популяции адаптироваться к окружающей среде бесчисленных пресноводных, в сочетании со способностью пересекать морские и пресноводные формы, дают редкую позвоночное систему, в которой генетика может быть использована для сопоставления геномных областей управлени эволюционировали черты. Отличные геномные ресурсы теперь доступны, способствуя молекулярно-генетических рассечение эволюционировали изменений. В то время как эксперименты картографирования генерировать списки интересных генов-кандидатов, функциональные генетические манипуляции необходимы для проверки роли этих генов. регуляции генов могут быть изучены с трансгенными репортерных плазмид и БАС интегрированы в геном, используя систему транспозаза Tol2. Функции специфических генов - кандидатов и цис - -regulatory элементы могут быть оценены путем индукции целевыхмутации с Talen и CRISPR / cas9 редактирования генома реагентов. Все методы требуют введения нуклеиновых кислот в оплодотворенных эмбрионов колюшки одноклеточных, задача сделал сложной толстой хориона из колюшки эмбрионов и относительно небольшим и тонким бластомере. Здесь подробный протокол для микроинъекции нуклеиновых кислот в колюшки эмбрионов описано для трансгенных и редактирования генома приложений для изучения экспрессии генов и функции, а также методов оценки успешности трансгеноза и обнаружения стабильных линий.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Одним из основных компонентов понимания того, как возникает биоразнообразие определения генетических и развития основ эволюционировали фенотипических изменений в природе. Трёхиглая колюшка рыбы, Gasterosteus колюшка, стала отличной моделью для изучения генетической основы эволюции. Колюшками претерпели множество адаптивных эволюционных изменений , как морские рыбы колонизировали бесчисленные среды пресной воды вокруг северного полушария, что приводит к драматическим морфологическими, физиологическими, и поведенческие изменения 1. Геномы лиц из двадцати одного населения колюшки были секвенированы и собраны, и карта связи с высокой плотностью была сформирована для дальнейшего совершенствования сборки 2,3. Генетические эксперименты картирования выявили участки генома , лежащие в основе эволюционировали фенотипов 4 - 6, а в некоторых случаях функциональные роли специфических генов - кандидатов были протестированы 7,8, Ряд геномных областей , лежащих в основе морфологических изменений были идентифицированы с многообещающими генов - кандидатов, однако эти кандидаты еще не были функционально протестированы 9 - 12. Кроме того, колюшки являются общими моделями для изучения генетики популяций / геномики 13,14, видообразования 15, поведение 1, эндокринологии 16, экотоксикологии 17, иммунология 18 и паразитологии 19. Будущие исследования в каждой из этих областей выиграют от способности выполнять функциональные генетические манипуляции в колюшки. Помимо манипулирования их кодирующих последовательностей, роли генов - кандидатов , могут быть оценены путем изучения их цис - -regulatory последовательности и функционально увеличение, уменьшение или устранение экспрессии гена - кандидата. Микроинъекция и Трансгенез методы в колюшками хорошо установлены 7,8,20 и первоначально были разработаны с использованием meganuclease-опосредованнойСпособ 21 впервые описан в оризии 22. Модифицированный метод микроинъекции, представленный здесь был оптимизирован для обоих Tol2-опосредованной трансгеноза и недавно разработанный геном редактирования реагентов, включая Таленс и CRISPRs.

Изменения в цис -regulatory элементов , как полагают, иметь решающее значение для морфологической эволюции, как СНГ -regulatory изменения могут избежать негативных последствий плейотропных мутаций кодирующих 23. Таким образом, тестирование и сравнение предполагаемых цис - -regulatory последовательности стала главной целью все большего числа эволюционных исследований. Кроме того, большинство вариантов человеческих болезней являются регуляторными варианты 24,25 и системы модели позвоночных животных крайне необходимы для изучения цис -regulatory функции элемента и логики. Рыбы , которые оплодотворяют их эмбрионы внешне в большом количестве предлагают мощные системы позвоночных животных для изучения цис -regulation. Система транспозонов Tol2, в котором foreiдп ДНК должны быть интегрированы в геном примыкают Tol2 транспозаза сайты связывания и со-инъецируют Tol2 мРНК транспозазы, работает с высокой эффективностью для успешной интеграции плазмидной конструкции в геномах рыб 26 - 28. Как правило, потенциальный энхансер клонировали выше базального промотора (например, hsp70l 29) и ген флуоресцентного репортер , такой как EGFP (усиленный зеленый флуоресцентный белок) или mCherry в Tol2 позвоночнике и вводили транспозазы мРНК 26. Наблюдение экспрессии флуоресцентного репортера, либо в инъецированных эмбрионов или потомство с стабильно интегрированных трансгенов, предоставляет информацию о пространственно-временной регуляции экспрессии генов с приводом от предполагаемого энхансера. В дальнейших экспериментах, валидированные энхансеры могут быть использованы для управления тканеспецифичную избыточную экспрессию генов, представляющих интерес.

Для анализа больших цис -regulatory регионов, высокого качества большого вставки геномабиблиотеки IC помощью бактериальных искусственных хромосом (БАС) были построены для морских и пресноводных колюшки 30. Эти BACs можно recombineered заменить ген с флуоресцентным репортерным геном в контексте большой (150-200 кб) геномной области 31. Флуоресцентный репортер затем выражается в пространственно-временной схеме, что определяется регуляторными последовательностями внутри БАКа. Для исследований в рыбе, сайты Tol2 могут быть добавлены к БАК , чтобы облегчить геномную интеграцию 32,33. На более поздних стадиях развития , когда гибридизация является технически сложной задачей, флуоресцентное считывание BAC может быть использован для изучения закономерностей экспрессии генов, как было показано для колюшки костного морфогенетического белка 6 (BMP6) 20. Кроме того, флуоресцентные паттерны экспрессии в личности могут быть отслежены с течением времени, которое не может быть достигнуто с гибридизация. BACs также может быть использован для добавления additionaл копию геномной области, чтобы увеличить дозировку представляющего интерес гена.

Для изучения функции гена, редактирование генома является взрывным расширением поля , которое может быть использовано для получения целевых изменений геномных последовательностей в самых разнообразных организмов 34. Активатора транскрипции, как эффекторные нуклеазы (Таленс) являются модульными, последовательность конкретных нуклеазы первоначально выделенные из возбудителей болезней растений , которые могут быть точно сконструированных связываться непосредственно с геномной последовательностью выбора и генерировать двойной нити сломать 35,36. Кластерные регулярно interspaced короткие палиндромные повторы (CRISPR) / системы CAS первоначально были найдены в бактериях и использовать направляющую РНК и белка cas9 генерировать разрыв в последовательности ДНК - мишени , комплементарной направляющей 37. Последующее ремонт двойного разрыва цепи, созданной обоими Таленс и CRISPRs часто выходит за небольшой вставки или делеции, которые могут нарушить функции последовательности-мишени35-37. В колюшками, Таленс были использованы для срыва экспрессии гена путем ориентации энхансер 20, и оба Таленс и CRISPRs успешно производят мутации в кодирующих последовательностях (неопубликованные данные). Подробный протокол для генерации CRISPRs для использования в данио рерио могут быть использованы в качестве ориентира для разработки CRISPRs для колюшками 38.

Трансгенные и геномные эксперименты редактирования требуют введения нуклеиновых кислот в недавно оплодотворенного одноклеточного эмбриона. Путем введения трансгенов или геном-инструмент для редактирования на ранних стадиях развития, число генетически измененных дочерних клеток в эмбрионе максимальна. Введенный эмбрионы затем визуально обследованы на флуоресценцию или молекулярно-скрининг на модификации генома. Если клетки, способствующие зародышевой успешно целенаправленным, трансген или мутация может быть передана к подмножеству потомства, даже тогда, когда после инъекции летальность высока. Мозаичное рыба может быть ауткроссной илискрещивали и потомство их просеивают, чтобы восстановить мутантные аллели или стабильно интегрированный трансген интерес. Этот протокол описывает способы введения трансгенов и генома редактирования реагентов в эмбрионы колюшки одноклеточных и мониторинга для успешных геномных изменений.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Вся рыба работа была одобрена Institutional Animal Care и использования комитета Калифорнийского университета в Беркли (номер протокола R330) путем.

1. Подготовьте нуклеиновые кислоты для инъекций

  1. Tol2 Плазмида Трансгенез (адаптировано из Fisher 26).
    1. Вырезать 10 мкг транспозаза плазмиды (ФКС-TP) 39 с 10 U NotI в буфере поставленную в течение 1 ч при 37 ° С до линеаризуем.
      Примечание: соглашений о передаче материала может потребоваться для получения Tol2 плазмид.
    2. Экстракт отрезанный плазмиду со 25: 1 смесью фенол:: 24 хлороформ: изоамиловый спирт и осадок этанола с ацетатом натрия в соответствии со стандартными протоколами 40. Ресуспендируют плазмиду в 50 мкл РНКазы без воды.
      Примечание: Фенол-хлороформ следует использовать в капюшоне и отходы должны быть надлежащим образом утилизировать в соответствии с ведомственным руководящим принципам.
    3. Настройка реакции Sp6 транскрипции в соответствии с инструкциями изготовителя.
    4. Использование РНК изолическихкомплект вания для очистки реакции транскрипции в соответствии с инструкциями изготовителя; ресуспендирования РНК в 50 мкл РНКазы воды.
    5. Удаление 1 мкл аликвоты РНК. Нагревают до 65 & deg; С в течение 5 мин для денатурации вторичные структуры затем сразу же охладить на льду. Замораживание оставшиеся реакции транскрипции при -80 ° С.
    6. Запуск РНК-аликвоты на геле 1% агарозном геле в ТАЕ 0,5 × (Трис-основание, уксусной кислоты, этилендиаминтетрауксусной кислоты) проточном буфере с стандартного размера РНК в одной полосе. Ожидаемый продукт 2200 пар оснований; отбрасывать , если> 5% от общего количества РНК появляется в мазке меньше 2200 б.п., что свидетельствует о экстенсивной деградации (рисунок 1).
    7. Количественная РНК с использованием спектрофотометра при длине волны 260 нм. Разбавить до 350 нг / мкл в РНКазы свободной воды и хранить 1 мкл аликвоты при -80 ° С (хорошо, по крайней мере, двух лет).
    8. Клон Tol2 репортерной плазмидой (например, с использованием pT2HE 8 или плазмид из комплекта Tol2 41) с цис- Регуляторный элемент интереса. Вкратце, ПЦР - амплификации геномной интерес ДНК - последовательность с праймерами , содержащими сайты рестрикции , найденные в плазмиде, переваривают ПЦР - продукта и вектор с ферментом (ами), лигирования вставки в вектор, и полученную плазмиду трансформации в компетентную E. палочка 40. Выделяют плазмиду с комплектом, который включает в себя эндотоксина полоскание в соответствии с протоколом производителя.
    9. Выполните вторую очистку плазмиды Tol2 с использованием набора для очистки ПЦР в соответствии с протоколом производителя. Элюции в 30 мкл РНКазы без воды.
      Примечание: выход из этой стадии, может быть низким (иногда под 50% входной плазмиды).
    10. Развести плазмиды до ~ 125 нг / мкл в РНКазы свободной воды.

figure-protocol-1
Рисунок 1. транспозаза мРНК гель. Очищенная транскрипции реакция пропроток (1 мкл) нагревают до 65 ° С, охлаждали на льду, и работать на агарозном геле 1% с 0.5x ТАЕ проточном буфере при 100 В. Размеры РНК лестницы в т.п.н. (БЗ) указаны слева , Полная длина мРНК транспозаза яркая полоса при ~ 2,2 кб. Небольшой , но приемлемое количество деградированных или неполной мРНК рассматривается ниже 2,2 кб. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

  1. BAC Трансгенез (см Suster 32,33 для BAC Recombineering техники)
    1. Подготовить BAC из E. палочка с использованием набора для очистки BAC в соответствии с протоколом производителя. С помощью осаждения этанолом для восстановления ДНК с экстракции стандартным натрия ацетат-этанол 40 и ресуспендируют ДНК при температуре ~ 250 нг / мкл в РНКазы свободной воды.
    2. Приготовьте мРНК транспозаза, как и в разделе 1.1.
  2. Мутация Индукционная с Таленс (см Чермак
  3. С помощью веб-приложения для разработки Таленс для интересующего гена 42. Если это возможно, дизайн Таленс сорвать фермента вырезать сайт рестрикции для облегчения молекулярный анализ.
  4. Клон Таленс и подготовить плазмиды для транскрипции по опубликованным протоколом 35.
  5. Расшифруйте мРНК Talen с реакцией Sp6 транскрипции в соответствии с инструкциями изготовителя и очистки мРНК, как описано для транспозазы в разделе 1.1.4. Количественно с помощью спектрофотометра и разбавляют до 200 нг / мкл в РНКазы свободной воды. Запуск мРНК Talen на геле, чтобы гарантировать, что это правильный размер и не деградирует, как описано в шаге 1.1.6.
  6. Дизайн пару праймеров ПЦР для амплификации примерно 100-200 п.н. , окружающую целевую последовательность Talen с помощью инструмента проектирования праймера и последовательность ДНК 43 мишени. Заказ соответствующего фермента рестрикции испытать для поражений на целевом сайте, основанные на шаге 1.3.1.
  • CRISPR Трансгенез (см Talbot и Amacher 38 для проектирования и подготовки CRISPRs):
    1. Проектирование и подготовка CRISPRs и cas9 мРНК в соответствии с протоколом 38 и порядок проверки соответствующих праймеров и ферменты рестрикции , как описано на этапе 1.3.4.

    • 2. Подготовка инъекций Реагенты

    1. Используйте боросиликатного Капилляры Подготовка иглы, как описано ниже.
      Примечание: эти капилляры не являются стандартными капилляры, используемые для данио микроинъекции, и изготовлены из более толстой и более сильного стекла, что имеет решающее значение для прокола жесткой колюшковые хориона.
      1. Всегда носите нитриловые или латексные перчатки при извлечении иглы, и не позволяют иглы контактировать с кожей или масла кожи.
      2. Определить микропипетка вытягивать параметры эмпирически испытаний рампе следующие инструкции изготовителя микропипетки Пуллера в. Например, с коробкой нити, следующие параметры отпугиватьдобывали оптимальным образом: (Heat = 515, Pull = 60, скорость = 60, задержка = 85, давление = 500). Эти настройки дают иглы , которая сужается резко при приблизительно 12 ° для ~ 2 мм , а затем долго расширение , которое сужается примерно 2 ° в течение ~ 6 мм (рисунок 2).
        Примечание: правильные параметры будут меняться в зависимости от съемника и нити, и вслепую с помощью программы без определения параметров сначала через рампе испытаний может навсегда разрушить нити съемника, который является сложным и дорогостоящим для замены.
      3. Следуйте инструкциям производителя, чтобы вытащить по крайней мере 4 микропипетки иглы из боросиликатного стекла с настройками, определенных в пункте 2.1.2.
      4. Иглы Хранить вертикально в банку для хранения капиллярная с острым концом вниз.
      5. Перед инъекционным, место для хранения капиллярная банку на лед, чтобы охладить иглы. Добавьте кусок влажного бумажного полотенца в банку, чтобы предотвратить испарение, как только иглы заполнены.
    2. Оплодотворите Яйца (AllШаги, выполняемые при комнатной температуре)
      1. Газа яйцо сцепление с беременной самки колюшки, осторожно сжимая живот и гладить в передних к задним направлении , чтобы подтолкнуть яйца через клоаку и в 35 х 10 мм 2 чашки Петри. Добавьте влажную кусок бумажного полотенца на одной стороне чашки Петри (не задевая яйца), чтобы создать влажность камеры. Поместите крышку на чашку Петри таким образом яйца остаться влажным.
      2. Эвтаназии самец колюшка в 0.025% Tricaine-S буферизованных с 0,1% -ным раствором бикарбоната натрия.
      3. Разрежьте брюшко, удаляют семенники и вымачивать в 250 мкл раствора Хэнкса (см Westerfield 44 для полного протокола для приготовления раствора Хэнкса).
      4. Оплодотворите не более 100 яиц с раствором спермы 50 мкл и осторожно перемешать с наконечником пипетки, чтобы гарантировать, что все яйца оплодотворены. Если сцепление> 100 яиц, оплодотворить половину поздних яиц, чтобы гарантировать, что все эмбрионы на стадии одноклеточного во время инъекции. Яйца могут быть оставлены неоплодотворенныхпри комнатной температуре в течение часа, а сперма обычно длится в течение 1-7 дней при температуре 4 ° С в растворе Хэнкса.
      5. Держите эмбрионов покрытые чашку Петри крышкой после оплодотворения, чтобы предотвратить высыхание. Разрешить 20-25 мин для первой ячейки, чтобы выйти и опухать (готовят материалы для инъекций в течение этого времени).
      6. Заполните 150 мм х 15 мм чашки Петри с колюшки водой. (Для того, чтобы колюшковые воду, сначала готовят 10% -ным раствором бикарбоната натрия, растворенного в деионизированной воде. Затем добавляют 3,5 г искусственной морской воде смеси и 0,217 мл 10% -ного бикарбоната натрия на 1 л деионизированной воды, и размешать / энергично встряхивают, чтобы растворить соль.)
    3. Приготовьте раствор для инъекций (В то время как Яйца Оплодотворение)
      1. Готовят раствор для инъекций в соответствии с таблицей 1 и хранить на льду.
        Примечание: концентрации некоторых нуклеиновых кислот были увеличены от опубликованных за данио в связи с увеличением объема колюшки бластомере.
    реактив Tol2 инъекции BAC инъекции Talen инъекции инъекции CRISPR
    мРНК Tol2 350 нг 350 нг - -
    ДНК 150-200 нг плазмидной 200-300 нг BAC - -
    мРНК Talen - - 200 нг каждого -
    CRISPR руководство РНК - - - 200 нг
    мРНК cas9 - - - 400 нг
    0,5% фенола красного inDulbecco в PBS 0,5 мкл 0,5 мкл 0,5 мкл 0,5 мкл
    РНКазы свободной воды 5 мкл 5 мкл 5 мкл 5 мкл

    Таблица 1:. Инъекционные реагенты Все смеси должны быть готовы к общему объему по 5 мкл и хранили на льду.

    1. Fill иглы (на льду, должно быть не менее 10 мин для иглы, чтобы заполнить).
      1. Засыпка по меньшей мере, три иглы, с помощью пипетки раствора для инъекций 0,5 мкл на тупой верхний конец иглы в то время как иглы висит вертикально в банку для хранения капилляр. Будьте осторожны, чтобы капля остается на вершине и не стекает вниз сторону и избежать пузырей.
      2. После того, как красная жидкость в основном сливают заостренным кончиком иглы, добавить еще 0,5 мкл к тупым концом иглы и дайте ей стечь.

    3. Подготовка Inject Рог и иглы для микроинъекции

    Примечание: Эти шаги Cобычно делается после того, как оплодотворять яйца.

    1. Включите свет просвечивания для рассечения микроскопа и поместить стеклянную пластину ~ 13 см х 13 см на светлом базе микроскопа с 15 см штукатуркой лезвие пилы на верхней части стеклянной пластины 7. Сориентируйте пилу перпендикулярно к инъекционной аппарата с углублениями, обращенной к держателю иглы.
    2. Включите подачу воздуха и обеспечить давление устанавливается до ~ 200 кПа от регулятора.
    3. Включите блок управления и настройки параметров. Установить давление до ~ 150-175 кПа. Установить продолжительность впрыска до 180 мс.
    4. Освободить держатель иглы, вставьте заполненную иглу в держатель, пока сопротивление держателя резины может ощущаться, и затяните, пока палец плотно.
    5. Отрегулируйте угол наклона иглы до приблизительно 45 °.
    6. С помощью средства управления микроманипулятор для регулировки иглы так, чтобы конец центрирован в поле зрения. Увеличение до ~ 40-кратном увеличении и сосредоточиться на кончике иглы, которая не должна касатьсяниже стекла.
    7. Осторожно сломать кончик иглы, держа его с пинцетом часовщика. В идеале, не ломаются перпендикулярно, а при ~ 60 ° угол. Перерыв близко к кончику (не более 2-3 пинцеты ширины от конца, рисунок 2).

    figure-protocol-2
    Рисунок 2. Непрерывные и сломанные иглы микроинъекции. Верхняя игла цела и кончик нижней иглы была нарушена пинцетом (стрелка). Иглы заполнены раствором, содержащим 0,05% фенол красный. Шкала бар = 1 мм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

    1. Нажмите на педаль впрыска лапки несколько раз, чтобы проверить, не сломан ли игла. После нескольких нажатий, крошечные красные капельки должны начать выходить из тконец он. Если нет, попробуйте разбить иглу немного выше.
    2. Если игла имеет воздушный пузырь, увеличить блок обратное давление и нажмите на педаль несколько раз быстро работать пузырь вне.
    3. Отрегулируйте обратное давление:
      1. Используйте одноразовые пипетки передачи, чтобы поместить несколько капель воды колюшки на стеклянной пластине.
      2. Осторожно опустите иглу в воду.
      3. Увеличение обратного давления, пока слабый поток розовой жидкости не выходит из иглы (что указывает на положительное давление).
        Примечание: Если не хватает обратного давления, игла будет составлять цитоплазмы под действием капиллярных сил. Если слишком много обратное давление, объем впрыска может быть непреднамеренно слишком большим.
      4. Отвод иглу, насколько это возможно, так что он не будет поврежден во время подготовки эмбрионов (см ниже).
    4. В качестве альтернативы, настройте обратное давление на более высокое значение давления, так что постоянная сильная струя жидкости выходит из иглы шКурица он погружен в воду. Затем, нажав на педаль, чтобы впрыснуть становится ненужным; Однако, инъекция должна выполняться быстро, чтобы избежать чрезмерного употребления инъекционных наркотиков.
      Примечание: Не пытайтесь эту технику, когда впервые обучения вводить.

    4. Микроинъекция

    1. Около 25 мин после оплодотворения, использовать две подсказки 10 мкл пипеткой, чтобы удалить 5-10 эмбрионов от сцепления и передачи к стеклянной пластине.
    2. Тем не менее, используя кончики пипетку, аккуратно отделить эмбрионы в отдельных углублений пильного диска. Будьте осторожны, чтобы не проколоть эмбрионов.
    3. Использование передачи пипетка с конца обрезаются таким образом колюшки эмбрионы уместиться, добавьте достаточно колюшки воды, чтобы покрыть эмбрионов, оставить воду на 3-5 сек, а затем удалить излишки воды с пипеткой, оставляя небольшой объем воды покрытия каждый эмбрион.
      Примечание: Слишком много воды заставит хорионов затвердевать и сломать иглу, но небольшой объем воды необходимо поднять чОриона от клетки и желток (фиг.3А - В).
    4. Начиная с эмбриона дальше всего, сдвиньте стеклянную пластину и увеличить таким образом, чтобы первый зародыш заполняет примерно 25% поля зрения.
    5. Опустите иглу в поле зрения, а затем использовать 10 мкл пипеткой наконечник осторожно вращать зародыш , чтобы идентифицировать бластомера, зернистую, слегка желтый бугорок цитоплазмы на верхней части желтка (рис 3B), а затем повернуть так , чтобы бластомер прямо перпендикулярно к концу иглы (сохраняя при этом эмбрион в выемке пильного диска, рис 3C).
      Примечание: капли желтка может перемещаться как эмбрион поворачивается, так что не использовать их в качестве системы отсчета для расположения бластомере.
    6. Опустите иглу в цитоплазме, но не протолкнуть к базовому желтка. Оказывайте давление медленно и равномерно при прокалывании хориона, чтобы избежать поломки иглы. Еслиигла изгибается сильно, втягивать и попробуйте еще ​​раз в несколько ином месте.
    7. Выжмите педаль управления 3-4 раза , чтобы ввести так, чтобы красный болюс со слегка размытыми краями заполняет около ~ на 1/8 диаметр цитоплазме (рис 3D).
      1. Избегайте получения красного пилюлю с острыми краями , которые не начинают диффундировать, что указывает на инъекцию в желток под цитоплазмы (рис 3Е).
      2. Если яркий розовато-красное пятно быстро диффундирует, вставить иглу дальше, чтобы проколоть бластомера.
      3. Если болюсное желтеет мгновенно, вращать эмбрион для обеспечения бластомера была целенаправленной и впрыснуть снова (рис 3F).

    figure-protocol-3
    Рисунок 3. Внешний вид колюшки эмбрионов до и после инъекции. Все эмбрионы взяты из йе в перспективе , глядя вниз через микроскоп (для C 'и G , за исключением). (А) перед добавлением воды, оплодотворенные эмбрионы имеют однородный внешний вид с капель масла , плавающих в верхней части желтка. (B) После добавления воды, хориона набухает, открывая бластомера , которая выступает из желтка и виден в профиле. (С) Вращение зародыша так , что игла входит перпендикулярно по отношению к хориона и бластомере. (С ') боковой вид иглы, которая проколотой хориона с наконечником в цитоплазме. (D) Инъекции в результаты цитоплазмы в красное пятно с размытыми краями , которые исчезают с течением времени. (E) раствор для инъекций в желток , лежащих в основе результатов цитоплазмы красного пятна с четкими краями. (F) Инъекции в желток противоположном результатам цитоплазмы в рН-индуцированного сдвига цвета от красного до желтого. (G) Боковойпросмотр результатов впрыска, с Xs более местах к югу от идеальных инъекций. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

    1. С помощью элементов управления Микроманипулятор втягивать иглу, используя 10 мкл пипеткой наконечник, чтобы удерживать эмбрион, если он прилипает к игле.
    2. После того, как втягивания иглы, вставьте стеклянную пластину, чтобы выровнять следующий эмбрион с иглой.
    3. После введения всех эмбрионов, используйте переноса пипетку, чтобы добавить воду к эмбрионах, а затем собрать их в пипетки передачи и поместить в 150 мм чашки Петри полный колюшки воды.
    4. Вытрите стеклянную пластину с бумажным полотенцем, чтобы избежать накопления слишком много воды.
    5. Распределить свежих эмбрионов на пилу и повторите шаги с 4.4 по 4.10.
    6. Держите ~ 10% эмбрионов в качестве неинъецированных контроля с целью обеспечения неинъецированных эмбрионов развиваются нормально, и использовать в качестве контроля дикого типа для тон Молекулярные анализы описаны ниже.

    5. Сообщение Инъекции Уход

    1. Инкубируйте эмбрионов в чашки Петри при 18 ° C после инъекции до вылупления 10. После вылупления, задний личинок в аквариумах , как описано 10.
    2. Аккуратно слейте колюшки воды через один день после инъекции и заменить свежей колюшки водой. Заменить свежим колюшки водой, по крайней мере через день после этого.
    3. Проверьте наличие мертвых или неправильно сформированных эмбрионов ежедневно. Удалить такие эмбрионы, чтобы предотвратить распад от загрязнения воды.

    6. Анализ результатов инъекций

    1. Для инъекции флуоресцентных репортеры, мониторинг эмбрионов ежедневно в затемненном помещении с помощью флуоресцентного микроскопа рассекает с GFP или RFP фильтром (в зависимости от флуоресцентного трансгена). Запись анатомические паттерны экспрессии генов с цифровыми фотографиями и / или письменных описаний и подведении количества рыбы с различными ExpresSion домены (рисунки 4 и 5).
      Примечание: колюшками имеют autofluorescent, звездчатые клетки пигмента, которые видны под GFP фильтров, начиная с 4 дня после оплодотворения (DPF).
      1. Для создания стабильных линий, за исключением эмбрионов с детектируемой флуоресценции и расти до зрелого возраста , как описано 10.
      2. Скрещивание вводили взрослых рыб дикого типа рыбы с помощью процедуры экстракорпорального оплодотворения , описанной в разделе 2.2 и потомству экрана для флуоресценции , как описано в шаге 6.1 искать флуоресцентной потомства, что указывает на успешную передачу трансгенов.
      3. Для визуализации флуоресценции в вылупились, свободно плавающей личинки, добавляют 500 мкл 0,8% Tricaine до 150 мм Петри блюдо анестезировать рыбу и ждать, пока рыбы перестают двигаться к изображению. Немедленно промойте несколько раз со свежей водой колюшки следующие наблюдения и обработки изображений.
      4. Необязательно, чтобы сохранить флуоресценцию для дальнейшей обработки изображений, усыпить личинок в0,025% (250 мг / л) Tricaine буферном с 0,1% -ным раствором бикарбоната натрия и зафиксировать в течение 4 часов в 4% параформальдегида в 1X фосфатным буферным физиологическим раствором (PBS) при 4 ° С. Хранить в 1x PBS в течение двух недель.
        Примечание: фон автофлуоресценции увеличивается с течением времени.
    2. Диагностические ПЦР / переваривание генотипирование для Мутация индукции с CRISPRs или Таленс - Лучший Исполняется на 2-х дней после оплодотворения.
      1. Используйте передачу пипеткой поместить 10 инъецированные эмбрионы (2 DPF, до сих пор в хорионов) в первые 10 лунок 12-луночного ПЦР полосы трубки. Поместите неинъецированных управления рыбы в течение последних двух скважин.
      2. Удалите излишки воды колюшки.
      3. Добавьте 50 мкл буфера для лизиса (10 мМ Трис рН 8,3, 50 мМ KCl, 1,5 мМ MgCl 2, 0,3% Tween-20 и 0,3% NP-40) в каждую лунку.
      4. Место колпачки на трубках и инкубировать при температуре 95 ° С в течение 20 мин в амплификатор.
        Примечание: Желток побелеет и эластичными после стадии кипения.
      5. Снимайте крышки и использовать другую НКУ1000 мкл пипетку наконечник, чтобы вымачивать эмбриона в каждой пробирке.
        Примечание: Белый мусор будут собирать в нижней части трубы.
      6. Добавить 2,5 мкл 10 мг / мл протеиназы К в каждую лунку.
      7. Заменить крышки и инкубировать при 55 ° С в течение 1 часа, чтобы переварить белок, а затем 95 ° С в течение 20 мин, чтобы инактивировать протеиназы К. Хранить при -20 ° C, чтобы избежать роста плесени.
      8. Выполните ПЦР с использованием высокой точности воспроизведения полимеразы в соответствии с инструкциями изготовителя. Используйте эмбрион лизата в качестве ДНК-матрицы.
        Примечание: Следует проявлять осторожность, чтобы удалить жидкость из верхней части трубки для ДНК-матрицы, избегая каких-либо видимых хориона или желток обломков на дне пробирки.
      9. Перемешать продукт ПЦР в равном объеме с мастер-смеси, содержащей фермента рестрикции 1x Фермент специфичное буфера и 0,25 мкл фермента на образце. Всегда сохранять половину режиссерский продукта ПЦР для анализа на геле, чтобы подтвердить продукты ПЦР предсказанный размер. Выдержите ПЦР смешивали с ферментом при соответствующих условияхРестриктаза.
        Примечание: Некоторые ферменты могут потребоваться другие соотношения фермента буфера ПЦР-продукта; регулировать концентрацию буфера, если неинъецированных управления не показывают полное переваривание.
      10. После расщепления, работающие продукты на агарозном геле 1% рядом с размером ДНК лестницы, чтобы подтвердить ожидаемые размеры продукта.
        Примечание: Неограненные полосы в инъецированных эмбрионов указывают на наличие молекулярных повреждений (рисунок 6) и неинъецированных управления должны быть полностью переваривается интерпретировать результаты.
      11. Для подтверждения повреждения, вырезать режиссерский полос из агарозных гелей и очищают ДНК с использованием набора для экстракции геля. Используйте Sanger секвенирования, в идеале с помощью секвенирования праймера внутренней для ПЦР-праймеров для подтверждения поражения. В F 0 вводили эмбрионы, смесь поражений, вероятно , будет присутствовать, в результате чего качество Sanger чтения деградировать около целевого сайта.
      12. Для получения стабильной линии, сохранить все инъекционные эмбрионы из тисков, экранирующих положительный для молекулярных повреждений. ггрести рыбу, ауткросс, а затем экран подмножество F 1 эмбрионов для молекулярных поражений , как описано в пунктах 6.2.1 через 6.2.11. Если гетерозиготные носители идентифицируются, растут Оставшийся F 1 эмбрионов до зрелого возраста и выявления гетерозиготных лиц с использованием ДНК , выделенной из хвостового плавника клипа.

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Results

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Для гена трансгенов репортера , которые имеют энхансер активность, успешное инъекции приведет к конкретным, клеточной экспрессии трансгена (рис 4A, 4C). Введенные рыба может быть ауткроссной для получения стабильных линий ( на примере САК стабильной линии , показанной на рисунке 4B). Инъекционное ДНК в колюшки эмбрионов, как правило, приводит к гораздо более высокой летальностью, чем только РНК. Характерно , чтобы увидеть до 50% (иногда ...

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Discussion

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Потребители инъекционных одноклеточных колюшки эмбрионов для трансгеноза или редактирования генома представляет три основные задачи. Во-первых, по отношению к данио эмбрионов, колюшка эмбриональных хориона является жестким и часто ломаются иглы. Эта проблема может быть частично преодолена за счет использования более толстые и прочные стеклянные Дозаторы и инъекционного перпендикулярно хориона (см протокол, рисунок 2). Обеспечение того, как небольшое количество воды, как это возможно добавляется эмбрионо...

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Disclosures

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Авторы не имеют ничего раскрывать.

    Acknowledgements

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Эта работа была частично финансируется NIH R01 # DE021475 (CTM), в NIH Predoctoral Training Грант 5T32GM007127 (PAE), и НФС Graduate Fellowship (Research НАЗ). Мы благодарим Кевин Schwalbach для выполнения BAC recombineering и инъекции, Ник Donde для генерации данных секвенирования CRISPR Sanger, и Кэтрин Липари за полезную обратную связь по протоколу инъекции.

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Materials

    List of materials used in this article
    NameCompanyCatalog NumberComments
    Стереомикроскоп с транслюминациейLeicaS6e/KL300 Светодиодный
    ручной микроманипуляторПрикладная научная аппаратураMM33Микроманипулятор Marzhauser M33
    Система нажимаПрикладная научная аппаратураМППИ-3
    Аппаратура противодавленияПрикладная научная аппаратураБПУ
    Комплект держателя микропипеткиПрикладные научные приборыMPIP
    Магнитный держатель основанияПрикладные научные приборыМагнитное основание
    Ножной переключательПрикладные научные приборыFSW
    Железная пластина (магнитное основание)NarishigeIP
    Flaming/Brown Micropipette PullerSutter Instrument-97
    Пипетки переносные одноразовыеФишер13-711-7М
    0,5% фенол красный в ДПБССигма P0290Инъекционный индикатор
    #5 щипцов, биологический дюмоксель Fine Science Tools11252-30для ломания игл
    Банка для хранения микропипетокWorld Precision InstrumentsE210удерживает иглы
    6", 6 зубьев на дюйм гипсокартонная пила для гипсокартонаLenox20571 (S636RP)удерживает яйца для инъекций
    13 см x 13 см стеклянная пластиналюбой скобяноймагазин-капилляры
    боросиликатного стекла, 1,0 мм OD/0,58 мм ID World Precision Instruments1B100-F4* тверже стекла, чем канпилляры для инъекций рыбок данио-рерио
    150 x 15 мм чашка ПетриФишерFB0875714вырастить эмбрионы колюшки
    35 мм x 10 мм чашкаПетри Фишер08-757-100A магазинныеяйца перед инъекцией
    Растворимая океаническая сольInstant OceanSS15-10
    Бикарбонат натрияSigmaS5761-500G
    Трикейн метансульфонат/MS-222Western Chemical IncMS222рыбий анестезия/эвтаназия
    Sp6 набор для транскрипцииAmbionAM1340Для транскрипции TALEN и транспозазы мРНК
    RNeasy набор для очисткиQiagen74104очистить транспозазу или TALEN РНК
    QiaQuick набор для очистки ПЦРQiagen28104очистить плазмиды для инъекция
    Proteinase K 20 мг/млAmbionAM2546для препарата ДНК
    Nucleobond BAC 100 kitClontech740579для BAC препарата
    ДНК NotINEBR0189L
    Phusion polymeraseFisherF-530L
    Qiagen PlasmidPlus Midi kitQiagen12943содержит эндотоксин для промывки буфера
    QIAQuick Гелевая экстракцияQiagen28704 для секвенирования индуцированных мутаций
    Фенол:хлороформ:Изоамиловый спиртSigmaP2069-100ML
    Ацетат натрияSigmaS2889-250G Этанол
    (класс молекулярной биологии)SigmaE7023-500ML
    АгарозаSigmaA9539
    50x Трис-ацетат-ЭДТА буферThermoFisherB49
    0,5-10 Кб РНК-лестницаThermoFisher15623-200
    Nanodrop  СпектрофотометрThermo ScientificNanodrop 2000
    ПараформальдегидSigma158127-500G
    10x PBSThermoFisher70011-044
    1 kb Plus Лестница ДНКThermoFisher10787-018
    Хлорид калияSigmaP9541-500G
    Хлорид магнияSigmaM8266-100G
    NP-40ThermoFisher28324
    Твин 20SigmaP1379-500ML
    Tris pH 8.3TeknovaT1083
    12-полосная ПЦР-пробиркаThermo ScientificAB-1113
    из

    References

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. Bell, M. A., Foster, S. A. The Evolutionary Biology of the Threespine Stickleback. , Oxford University Press. (1994).
    2. Jones, F. C., et al. The genomic basis of adaptive evolution in threespine sticklebacks. Nature. 484 (7392), 55-61 (2012).
    3. Glazer, A. M., Killingbeck, E. E., Mitros, T., Rokhsar, D. S., Miller, C. T. Genome assembly improvement and mapping convergently evolved skeletal traits in sticklebacks with Genotyping-by-Sequencing. G3. 5 (7), 1463-1472 (2015).
    4. Miller, C. T., et al. Modular skeletal evolution in sticklebacks is controlled by additive and clustered quantitative trait Loci. Genetics. 197 (1), 405-420 (2014).
    5. Shapiro, M. D., et al. Genetic and developmental basis of evolutionary pelvic reduction in threespine sticklebacks. Nature. 428 (6984), 717-723 (2004).
    6. Colosimo, P. F., et al. Widespread parallel evolution in sticklebacks by repeated fixation of Ectodysplasin alleles. Science. 307 (5717), 1928-1933 (2005).
    7. Chan, Y. F., et al. Adaptive evolution of pelvic reduction in sticklebacks by recurrent deletion of a Pitx1 enhancer. Science. 327 (5963), 302-305 (2010).
    8. O'Brown, N. M., Summers, B. R., Jones, F. C., Brady, S. D., Kingsley, D. M. A recurrent regulatory change underlying altered expression and Wnt response of the stickleback armor plates gene EDA. eLife. , e05290(2015).
    9. Cleves, P. A., et al. Evolved tooth gain in sticklebacks is associated with a cis-regulatory allele of Bmp6. Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (38), 13912-13917 (2014).
    10. Erickson, P. A., Glazer, A. M., Cleves, P. A., Smith, A. S., Miller, C. T. Two developmentally temporal quantitative trait loci underlie convergent evolution of increased branchial bone length in sticklebacks. Proc. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 281 (1788), 20140822(2014).
    11. Glazer, A. M., Cleves, P. A., Erickson, P. A., Lam, A. Y., Miller, C. T. Parallel developmental genetic features underlie stickleback gill raker evolution. EvoDevo. 5 (1), (2014).
    12. Ellis, N. A., et al. Distinct developmental and genetic mechanisms underlie convergently evolved tooth gain in sticklebacks. Development. 142, 2442-2451 (2015).
    13. Hohenlohe, P. A., Bassham, S., Currey, M., Cresko, W. A. Extensive linkage disequilibrium and parallel adaptive divergence across threespine stickleback genomes. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 367 (1587), 395-408 (2012).
    14. Hohenlohe, P. A., et al. Population genomics of parallel adaptation in threespine stickleback using sequenced RAD tags. PLoS Genet. 6 (2), e1000862(2010).
    15. McKinnon, J. S., Rundle, H. D. Speciation in nature: the threespine stickleback model systems. Trends Ecol. Evol. 17 (10), 480-488 (2002).
    16. Shao, Y. T., et al. Androgen feedback effects on LH and FSH, and photoperiodic control of reproduction in male three-spined sticklebacks, Gasterosteus aculeatus. Gen. Comp. Endocrinol. 182, 16-23 (2013).
    17. Katsiadaki, I., et al. Three-spined stickleback: an emerging model in environmental endocrine disruption. Environ. Sci. Int. J. Environ. Physiol. Toxicol. 14 (5), 263-283 (2007).
    18. Lenz, T. L., Eizaguirre, C., Rotter, B., Kalbe, M., Milinski, M. Exploring local immunological adaptation of two stickleback ecotypes by experimental infection and transcriptome-wide digital gene expression analysis. Mol. Ecol. 22 (3), 774-786 (2013).
    19. Barber, I. Sticklebacks as model hosts in ecological and evolutionary parasitology. Trends Parasitol. 29 (11), 556-566 (2013).
    20. Erickson, P. A., et al. A 190 base pair, TGF-β responsive tooth and fin enhancer is required for stickleback Bmp6 expression. Dev. Biol. 401 (2), 310-323 (2015).
    21. Hosemann, K. E., Colosimo, P. F., Summers, B. R., Kingsley, D. M. A simple and efficient microinjection protocol for making transgenic sticklebacks. Behaviour. 141 (11/12), 1345-1355 (2004).
    22. Thermes, V., et al. I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish. Mech. Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).
    23. Carroll, S. B. Evo-Devo and an expanding evolutionary synthesis: a genetic theory of morphological evolution. Cell. 134 (1), 25-36 (2008).
    24. Maurano, M. T., et al. Systematic localization of common disease-associated variation in regulatory DNA. Science. 337 (6099), 1190-1195 (2012).
    25. Hindorff, L. A., et al. Potential etiologic and functional implications of genome-wide association loci for human diseases and traits. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (23), 9362-9367 (2009).
    26. Fisher, S., et al. Evaluating the biological relevance of putative enhancers using Tol2 transposon-mediated transgenesis in zebrafish. Nat. Protoc. 1 (3), 1297-1305 (2006).
    27. Kawakami, K., Shima, A., Kawakami, N. Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (21), 11403-11408 (2000).
    28. Kikuta, H., Kawakami, K. Transient and stable transgenesis using Tol2 transposon vectors. Methods in Moleculario Biology: Zebrafish. , 69-84 (2009).
    29. Halloran, M. C., et al. Laser-induced gene expression in specific cells of transgenic zebrafish. Dev. Camb. Engl. 127 (9), 1953-1960 (2000).
    30. Kingsley, D. M., et al. New genomic tools for molecular studies of evolutionary change in threespine sticklebacks. Behaviour. 141 (11/12), 1331-1344 (2004).
    31. Mortlock, D. P., Guenther, C., Kingsley, D. M. A general approach for identifying distant regulatory elements applied to the Gdf6 gene. Genome Res. 13 (9), 2069-2081 (2003).
    32. Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish. Nat. Protoc. 6 (12), 1998-2021 (2011).
    33. Suster, M. L., Sumiyama, K., Kawakami, K. Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish and mice. BMC Genomics. 10 (1), 477(2009).
    34. Kim, H., Kim, J. S. A guide to genome engineering with programmable nucleases. Nat. Rev. Genet. 15 (5), 321-334 (2014).
    35. Cermak, T., et al. Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting. Nucleic Acids Res. 39 (17), (2011).
    36. Miller, J. C., et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nat. Biotechnol. 29 (2), 143-148 (2011).
    37. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
    38. Talbot, J. C., Amacher, S. L. A streamlined CRISPR pipeline to reliably generate zebrafish frameshifting alleles. Zebrafish. 11 (6), 583-585 (2014).
    39. Kawakami, K., et al. A Transposon-Mediated Gene Trap Approach Identifies Developmentally Regulated Genes in Zebrafish. Dev. Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
    40. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular cloning a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2012).
    41. Villefranc, J. A., Amigo, J., Lawson, N. D. Gateway compatible vectors for analysis of gene function in the zebrafish. Dev. Dyn. 236 (11), 3077-3087 (2007).
    42. Doyle, E. L., et al. TAL Effector-Nucleotide Targeter (TALE-NT) 2.0: tools for TAL effector design and target prediction. Nucleic Acids Res. 40 (W1), W117-W122 (2012).
    43. Untergasser, A., et al. Primer3-new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Res. 40 (15), e115(2012).
    44. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio) . , 5th Edition, University of Oregon. Press: Eugene, OR. (2007).
    45. Dale, R. M., Topczewski, J. Identification of an evolutionarily conserved regulatory element of the zebrafish col2a1a. Dev. Biol. 357 (2), 518-531 (2011).
    46. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat. Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
    47. Qi, L. S., et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of Gene expression. Cell. 152 (5), 1173-1183 (2013).

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Reprints and Permissions

    Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

    Request Permission

    Tags

    Stickleback EmbryosMicroinjection TechniqueTransgenesis ApplicationsGenome EditingTol2 TransposaseTALEN CRISPRBlastomere InjectionChorion PenetrationTransgene ExpressionStable Lines

    Related Articles