Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Оценка Myofilament Ca

9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54057

⸱

1 августа 2016 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology & Biomedical Sciences, Ischemic/hypoxic Disease Institute, Seoul National University College of Medicine, 2Yan Bian University Hospital, 3Institute of Cardiovascular Sciences, University of Manchester

В этой статье

Краткое содержание

В этой статье описывается протокол, который оценивает изменения чувствительности миофиламентаCa2+ во время сокращения в изолированных сердечных миоцитах из сердца крысы. Вместе с электрофизиологией сердца, уровнями систолического/диастолического цитозоля Ca+ 2+ и сокращением/расслаблением, это измерение необходимо для обоснования механизмов, опосредующих связь сердечных возбуждений-сокращений у здоровых и больных сердец.

Аннотация

Сердечная недостаточность и нарушения ритма сердца являются основными причинами смертности и заболеваемости во всем мире. Тем не менее, механизм патогенеза и миокардиальной неисправностью в больном сердце остается полностью выяснены. Последние убедительные данные свидетельствуют о том, что изменения в myofilament Ca 2+ чувствительности влияет на внутриклеточный Ca 2+ гомеостаз и ионных каналов деятельность в кардиомиоциты, основные механизмы , ответственные за потенциала действия сердца и сжатия у здоровых и больных сердец. Действительно, деятельность ионных каналов и транспортеров , лежащие в основе потенциалов действия сердца (например, Na +, Ca 2+ и K + каналов и Na + -Ca 2+ обменника) и внутриклеточного Са 2+ обработки белки (например., Рианодин рецепторы и Ca 2+ -АТФазы в саркоплазматического ретикулума (SERCA2a) или phospholamban и его фосфорилирования) традиционно измеряется в оценели фундаментальных механизмов сердечного возбуждения-сжатия (EC) муфты. Обе электрические действия в мембране и внутриклеточных изменений Са 2+ являются синхросигналы сцепления ЕС, в то время как myofilament является функциональной единицей сокращения и расслабления, и myofilament Ca 2+ чувствительности является обязательным при осуществлении миофибрилл производительности. Тем не менее, несколько исследований включают myofilament Ca 2+ чувствительности в функциональном анализе миокарда , если он не находится в центре внимания исследования. Здесь мы опишем протокол , который измеряет саркомер сокращения / повторного удлинения и внутриклеточный уровень Са 2+ с использованием Фура-2 AM (ратиометрический обнаружения) и оценить изменения myofilament Ca 2+ чувствительности в кардиомиоцитов из сердца крысы. Основная цель состоит в том, чтобы подчеркнуть , что myofilament Ca 2+ чувствительности следует принимать во внимание в муфте EC для механистического анализа. Комплексное исследование Iна каналах, ионные транспортеры, внутриклеточная обработки Ca 2+ и Ca 2+ myofilament чувствительности, лежащих в основе миоцитов сократимость у здоровых и больных сердца предоставит ценную информацию для разработки более эффективных стратегий поступательной и терапевтическую ценность.

Введение

Сердечный возбуждения-сжатия (EC) связи является основной схемой для анализа механических свойств миокарда, т.е. сократительной функции сердца 1,2. Муфта EC инициируется деполяризации мембраны вторичным по отношению к деятельности сарколемных ионных каналов (например, напряжения закрытого Na + канал, который можно измерить с помощью методов патч-зажим). После активации напряжения закрытого L-типа Ca 2+ каналы (LTCCs) и Са 2+ приток через LTCCs вызывают большую часть Ca 2+ через выпуск рианодиновых рецепторов (RyRs), увеличение концентрации цитозольного Са 2+ из наномолярной (Nm ) до микромолярные (мкМ) уровень. Такое увеличение цитозольного Ca 2+ способствует Са 2+ связывания с тропонина С (TNC) в тонких нитях и вызывает конформационные изменения комплекса синтетических нитей , чтобы облегчить взаимодействие актина-миозина и достигает myocardiАль контракции 3. С другой стороны , цитозольного Ca 2+ повторно uptaken обратно в саркоплазматического ретикулума (СР) через Ca 2+ -АТФазы в SR (SERCA2a) или выдавливают из миоцита через Na + / Ca 2+ обменника и plasmalemmal Ca 2+ АТФазы 1,2. Следовательно, снижение цитозольного Ca 2+ подстрекает конформационные изменения тонких нитей обратно в исходное состояние, что приводит к диссоциации актин-миозин и миоцитов релаксации 1-3. В этой схеме, активность SERCA2a , как правило , считается , чтобы определить скорость релаксации миокарда , поскольку она составляет 70 - 90% от цитозольной удаления Ca 2+ в большинстве млекопитающих клеток сердца 1. В качестве такого, ненормального обработка Ca 2+ LTCC, RyR и SERCA2a и т.д. были рассмотрены основные механизмы нарушенной сократимости и релаксации в сердце больном 1-4.

На самом деле, свободный цитозольного Ca 2+ , который функционирует как посланному на счетах сцепных ЕС для около 1% от общего внутриклеточного Са 2+ и большинство Са 2+ связывается с внутриклеточными Ca 2+ буфера 5,6. Это связано с тем , что различные Са 2+ буферы в изобилии в кардиомиоциты, например, мембранные фосфолипиды, АТФ, креатинфосфата, кальмодулин, парвальбумина, миофибрилла TnC, миозин, SERCA2a и calsequestrin в СР. 5.6.7. Среди них, SERCA2a и TnC являются преобладающими Са 2+ буферов 5,6,7. Кроме того, связывание Са 2+ с его буферами представляет собой динамический процесс во время подергивания (например, 30-50% Са 2+ связывается с TnC и отмежеваться от него во время Са 2+ 7) и изменения в Ca 2+ связывания причиной дополнительного "освобождение" свободного Са 2+ в цитозоле, приводит к переделок внутриклеточного Са 2+ концentration. Следовательно, возмущение внутриклеточного уровня Са 2+ вызывает аномальные движения myofilament, которые являются предшественниками сократительной дисфункции и аритмий 8,9. Многие факторы (как физиологические и патологические) могут быть источниками посттранскрипционных модификаций myofilament белков, которые влияют на myofilament Са 2+ буферизация и myofilament Ca 2+ чувствительности 8-10. Недавно было сообщено о том, что мутации в myofilament белки увеличивают Са 2+ сродство связывания и внутриклеточного обработку Ca 2+, вызывая паузы зависящих от потенцирование Ca 2+, Ca 2+ ненормальным релиз и аритмий 8. В соответствии с этой концепцией, мы также показали , что myofilament Ca 2+ десенсибилизации в гипертоников сердцах крыс вторичным по отношению к регуляцию нейрональной синтазы оксида азота связан с повышенным уровнем диастолического и систолического Ca 2+ уровней11, который , в свою очередь, повышает уязвимость к LTCC Ca 2+ -зависимые инактивация 12. Следовательно, myofilament Ca 2+ чувствительность является "активным" регулятором внутриклеточного Ca 2+ гомеостаза и сократительной функции кардиомиоцитов. Стало необходимо проанализировать взаимодействие между myofilament и Ca 2+ обработка белков для тщательного изучения миоцитов сцепления EC и сердечной функции.

Здесь мы опишем протокол , который оценивает изменения myofilament Ca 2+ чувствительности в изолированных кардиомиоцитов. Комплексный анализ внутриклеточного Ca 2+ профиль, myofilament Ca 2+ чувствительность и сжатие будет раскопать романа механизмы , лежащие в миокарде механики.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Протокол в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных, опубликованных Национальным институтом ООН здоровья (NIH Publication No. 85-23, пересмотренная 1996). Он был утвержден по уходу и использованию комитета Institutional животных (IACUC) Сеульского национального университета (утверждения IACUC № .: СНУ-101213-1) путем.

1. Буфер Подготовка (Таблица Материалы и оборудование)

  1. Готовят 300 мл свежего раствора изоляции на день эксперимента (в мМ: NaCl 135; KCl 5,4, MgCl 2, 3,5; глюкоза, 5; HEPES, 5; Na 2 HPO 4, 0,4; таурин, 20; рН 7,4 с помощью NaOH).
  2. Приготовьте 100 мл раствора свежего хранения на день эксперимента (в мМ: NaCl 120; KCl 5,4; MgSO 4 5; CaCl 2 0,2; натрий-пируват 5; глюкоза 5,5; таурин 20; HEPES , 10; маннитол 29; рН 7,4 с помощью NaOH).
  3. Готовят 1 л раствора перфузии (в мМ: NaCl, 141.4, KCl, 4, NaH 2 PO 4, 0,33; MGCл 2, 1; HEPES, 10; глюкоза, 5,5; CaCl 2, 1,8; маннита, 14,5; рН 7,4 с помощью NaOH).
  4. Приготовьте 30 мл раствора коллагеназы 1 путем добавления коллагеназы (1 мг / мл), протеазу (0,1 мг / мл), бычий сывороточный альбумин (БСА, 1.67mg / мл) и Са 2+ (0,05 мМ) в 25 мл изоляции решение.
  5. Приготовьте 20 мл раствора коллагеназы 2 путем добавления коллагеназы (1 мг / мл), бычий сывороточный альбумин (1,67 мг / мл) и Са 2+ (0,05 мМ) до 16,7 мл раствора изоляции.
  6. Приготовьте 40 мл раствора БСА добавлением 0,4 г бычьего сывороточного альбумина в 40 мл раствора изоляции. Раздельное 10 мл и 30 мл в двух стаканах. Добавить Ca 2+ до 30 мл раствора БСА таким образом, чтобы конечная концентрация Са 2+ в растворе БСА составляет 1 мм.

2. Подготовка к изоляции левого желудочка (ЛЖ) миоцитов

  1. Передача 8-12-недельных, мужские Sprague-Dawley (SD) крыс в чистых транспортных клетках из вивария для подготовки и изоляции помещения.
  2. ЧАСесть два водяные бани до 37 о С.
    Примечание: Используйте один водяной бане в воду - резервуар с рубашкой и перфузионных трубок системы перфузионного Лангендорфа. Используйте другую ванну воды для того чтобы агитировать стволы ткани миокарда, чтобы отделить единичные миоциты.
  3. Добавляют 5 мл и 3,3 мл раствора БСА (без Са 2+) к 25 мл раствора коллагеназы 1 и 16,7 мл раствора коллагеназы 2 , чтобы компенсировать объем до 30 мл и 20 мл, соответственно.
  4. Добавить раствор изоляции (100 мл) и раствором коллагеназы 1 (30 мл) в колонку 1 (Кол 1) и колонки 2 (Кол 2) в системе Лангендорфа перфузионного, соответственно (Рис . 1А)
  5. Оксигенации раствора изоляции и раствором коллагеназы 1 в Кол.1 и Кол.2 через соединение кислорода трубки в перфузионной системе Лангендорфа (рис 1А). Точно так же, кислородсодержащих соединений раствор 2 коллагеназы и раствор БСА в встряхивании на водяной бане со 100% O 2 черезкислорода соединительной трубки.

3. Выделение миоцитов Л.В.

  1. Обезболить на SD крыс через внутрибрюшинной инъекции пентобарбитала натрия (30 мг / кг) и подтвердить обезболивающий статус носком сдавливания и отсутствие абстинентного отражения.
  2. Перемещение крысы рассечение лотка. В положении лежа на спине, закрепите четыре ноги по бокам тела с лентой.
  3. Применить грудные середине осевые разрезы с хирургическими ножницами, чтобы открыть сундук, обеспечивая, чтобы не повредить сердце. Используйте другую пару чистых ножницами , чтобы рассекать сердце из сообщающихся сосудов (например, верхней и нижней полой вене, легочных сосудов и аорты) и перикарда мембраны 13.
  4. Оставьте часть аорты достаточной длины (5 - 8 мм), зажим аорты с тонким пинцетом, и быстро монтировать канюлю системы перфузионного Лангендорфа в течение 1 мин (фиг.1А). Tie шовная нить 4/0 плотно над аортой.
  5. Включите клапан на Кол.1 и заливать изолированное сердце с предварительно нагретым и насыщенным кислородом раствором изоляции в течение 10 мин (скорость перфузии: 12-14 мл / мин). Выключите клапан на Кол.1, включите клапан на Седло 2 и заливать сердце с раствором коллагеназы 1 для 8 - 10 мин.
  6. Демонтировать переваренной сердце путем разрезания аорту и передать его, удерживая аорту с пинцетом в колбу , содержащую свежий раствор изоляции (рис 1Bi). Используйте тонкие ножницы и пинцет , чтобы вырезать большую часть свободной стенки левого желудочка ( в том числе перегородку) на более мелкие куски (~ 22 мм, рис 1Bii).
  7. Передача части в колбу , содержащую предварительно нагретым и насыщенным кислородом свежим раствором коллагеназы 2 (рис 1Biii). Встряхивают в течение 10 мин. Хранить доставки кислорода к миоцитов раствора, содержащего коллагеназы 2.
  8. Перемещение миоцит - суспензии в 10 мл центрифужные пробирки с помощью капельницы с всасывающим луковице и добавить Ca 2+ - раствор , содержащий БСА (1: 1 по объему). Центрифуга на 30 г в течение 2 мин и отбросить супернатант. Повторное приостановить миоцитов осадок в 5 мл раствора БСА. Центрифуга и отбросить супернатант.
  9. Дисперсные миоцита гранул и держать миоцитов в 10 мл раствора для хранения предварительно насыщенной кислородом при комнатной температуре (рис 1Biv-VI).
  10. Повторите процедуры (шаги 3.7 - 3.9) с оставшейся ткани ЛЖ в колбе.
    Примечание: Продолжайте повторять процедуры (шаги 3.7 - 3.9), пока большая часть ткани левого желудочка не исчезает, чтобы получить хороший выход миоцитов.
  11. Хранить миоциты в растворе для хранения в течение 6-8 ч при комнатной температуре до конца эксперимента.

4. Одновременные измерения внутриклеточного Са 2+ и миоцитов Относительное сужение

  1. Нагрузка LV миоциты с ацетоксиметил эфира фура-2 AM (2 мкМ).
    Примечание: Выполните все процедуры загрузки и эксперименты с заряженными миоцитов в темной трубке (рис 1Bvii).
    1. Centrifuge миоцитов суспензию (1 мл) при 2000 х г в течение 10 сек. Удалите супернатант и повторно приостанавливать миоцитов осадок в 1 мл раствора Тироде с низкой концентрацией Ca 2+ (250 мкМ, Таблица материалов и оборудования).
    2. Добавить фура-2АМ и полоксамер 407 (2 мкл), мягко рассеивать миоцитов суспензии, и держать смесь при комнатной температуре (20 - 24 ° С) в течение 15 мин (рис 1Bvii).
    3. Центрифуга смесь в течение 5 сек, отбросить супернатант и разогнать миоцитов осадок в 1 мл перфузионного раствора , содержащего 500 мкМ Са 2+. Через 10 мин, центрифугируют смесь в течение 5 сек и отбросить супернатант.
    4. Добавить свежий перфузионный раствор (500 мкМ Са2 +, 1 мл) и держать фура-2 утра - загруженную миоцитов осадок в этом растворе для записей.
  2. Измерение LV миоцитов сжатия и внутриклеточного Са 2+
    1. Перед записью, заполнить трубку перфузионного, которая проходит черезВодяная рубашка с раствором Тироде, который предварительно нагревают до 36 о С.
    2. Поместите несколько капель Fura 2 AM - загруженная LV миоцитов подвеска на камеру перевернутой флуоресцентного микроскопа для 5 - 8 мин. Медленно заливать раствор Тироде (2,2 мл / мин).
    3. Нажмите кнопку "Пуск" на передней панели цифрового стимулятора, чтобы начать стимуляцию поля (2 Гц).
      Примечание: Выходное напряжение (10 В, 5 мсек) применяется к миоцитов в камере через платиновые провода, расположенные по обе стороны камеры.
      1. Выберите миоциты, что контракт стабильно (не те, показывая гипер- или гипо- сжатия) для записи.
    4. Отрегулируйте миоцит выбора в горизонтальном положении системы обнаружения саркомера видеопрограмм и настроить фокус микроскопа для получения оптимальных изображений саркомеров. Поместите фиолетовый прямоугольник на область, в которой ясно саркомеры четко не наблюдается до среднегодлин саркомера (красный пик) отображает уникальный резкий пик (рис 2А, нижний рисунок).
    5. Запишите изменения длины саркомера в ответ на стимуляцию поля (рис 2А и В).
      Примечание: Используйте загруженные миоцитов в течение 1 - 2 ч.
    6. Отрегулируйте диафрагму камеры таким образом , чтобы поле в системе обнаружения саркомер видео на основе является размер миоцитов (рис 2А). Стимулируют миоцит с возбуждением на 360 нм / 380 нм и излучение на длине волны 510 нм (частота приобретения 1000 Гц). Запись саркомер укорочение и отношение фура2 АМ при стимуляции поля (рис 2В).

5. Оценка Myofilament Ca 2+ Чувствительность

  1. Среднее значение на основании длины саркомера и Ca 2+ в стационарном состоянии (10 - 20 следов) и участок контура фазовой плоскости соотношения Fura-2 против длины саркомера того же миоцита (оба с измеренным значениемс и дельта изменения; рис. 2в)
  2. В каждом участке, определяют соотношение Фура -2 при 50% релаксации (EC 50, Рис 2С). Сравните оба цикла и EC 50 каждого вмешательства.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

миоциты LV изолированы от нормальных, так и с гипертонической болезнью сердца крысы. В форме стерженьков миоциты с четкими страт (представляющих саркомеры) и стабильных сокращений в ответ на стимуляцию поля считаются оптимальными миоциты и выбраны для записей (рис 2А). В примере , показанном на F igure 2А, А фура 2 утра -loaded Л.В. миоцитов расположен горизонтально , а апертура камеры регулируется таким образом, что миоцитов занимает большую часть облас...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Здесь мы описываем протоколы для оценки изменений myofilament Ca 2+ чувствительности в одной изолированной сердечной миоцита и подчеркнуть важность измерения этого параметра наряду с электрофизиологических свойств, внутриклеточный Ca 2+, и динамику myofilament. Это происходит потому, что записи одного или двух из параметров не могут эксплицировать механизмы, лежащие в основе сердечного сокращения и расслабления. В отличие от традиционных методов , которые измеряют сокращение миоцитов и внутриклеточ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Это исследование было поддержано Основном программой исследования науки через Национальный исследовательский фонд Кореи (NRF), финансируемой Министерством образования, науки и техники (2013068067); выпускница программы Brain Korea 21 Министерства образования, науки и техники, Сеульский национальный госпиталь университета, Корейского общества гипертонии (2013 г.), исследовательского фонда SK Telecom корейской (нет. 3420130290), а также из Национального фонда естественных наук Китая (NSFC 31460265; NSFC 81260035).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Sprague Dawley ratKoatech8-12 недель
Пентобарбитал SodiumHanlim Pharmaceutical (Корея)AHN901Код страховки:645301220
NaClSigmaS9625
KClSigmaP4504
2PO4SigmaS8282
HEPESSigmaH3375
ГлюкозаSigmaG8270
CaCl2BiosesangC2002
MgCl2BiosesangM2001
MannitolSigmaM4125
MgSO4SigmaM5921
Sodium ПируватСигмаP2256
ТауринMerck8.08616.1000
Na2HPO4  Sigma71649
Фетальный альбумин крупного рогатого скотаSigmaA7906
Коллагеназа типа 2WorthingtonLS004177
протеазаSigmaP6911
Fura-2 (AM)Молекулярные зондыF1221
Pluronic F127 20% раствор в DMSOInvitrogenP3000MP
Встряхивающая водяная баняChang ShinНаучная модель: C-108
IonWizard Softwae SuiteIonOptix LtdЭкспериментальный строительСбор и анализ данных ЕС-связи в миоцитах
миоцитов кальция и Система регистрации сократимостиIonOptix Ltd
Циркуляционная водяная баняBS-techBW2-8
Миоцитарный флуоресцентный микроскопNikonDIATPHOTO 200
MyoCam-S PowerIonOptix
Флуоресценция & ВидеодетекторIonOptixMyoCam-S
CFA300
PMT400
флуоресцентный и Системный интерфейсIonOptixFSI700
Возбуждающий источник светаIonOptixmSTEP
Дуговая лампа высокой интенсивности Источник питанияCairn Resисследовательский
Контроллер колеса фильтровIonOptixGB/MUS200
Цифровые стимуляторы Медицинскиесистемы CorportionS-98 Mutimode
Составы экспериментальных растворов
НазваниеCompanyНомер в каталоге<strong>Комментарии
Изоляционный раствор (pH: 7.4, NaOH)
Концентрация NaClSigmaS9625(ммоль) 135
Концентрация KClSigmaP4504(ммоль) 5,4
HEPESSigmaH3375Концентрация (ммоль) 5
ГлюкозаSigmaG8270Концентрация (ммоль) 5
мгCl<суб>2BiosesangM2001Концентрация (ммоль) 3,5
ТауринСигмаCB2742654концентрация (ммоль) 20
Na2HPO4  Sigma71649Концентрация (ммоль) 0,4
Накопительный раствор (pH: 7,4, NaOH)
NaClSigmaS9625Концентрация (ммоль) 120
KClSigmaP4504Концентрация (ммоль) 5,4
HEPESSigmaH3375Концентрация (ммоль) 10
ГлюкозаSigmaG8270Концентрация (ммоль) 5,5
CaCl2BiosesangC2002Концентрация (ммоль) 0,2
MannitolSigmaM4125Концентрация (ммоль) 29
мгSO4SigmaM5921Концентрация (ммоль) 5
Пируват натрияSigmaP2256Концентрация (ммоль) 5
ТауринSigmaCB2742654Концентрация (ммоль) 20
Перфузионный раствор (раствор Tyrode, pH: 7,4, NaOH)
NaClSigmaS9625Концентрация (ммоль) 141,4
KClSigmaP4504Концентрация (ммоль) 4
2PO4SigmaS8282Концентрация (ммоль) 0,33
HEPESSigmaH3375Концентрация (ммоль) 10
ГлюкозаSigmaG8270Концентрация (ммоль) 5,5
CaCl2BiosesangC2002Концентрация (ммоль) 1,8          Для загрузки Fura 2AM концентрации CaCl2 составляют 0,25 мМ и 0,5 мМ
MgCl2BiosesangM2001Концентрация (ммоль) 1
MannitolSigmaM4125Концентрация (ммоль) 14,5
Раствор коллангеназы 1
Раствор изоляции (30 мл)
Фетальный альбумин крупного рогатого скота (раствор BSA 5 мл)Концентрация (ммоль) 1,67 мг/мл
Коллагеназа типа 2WorthingtonLS004177Концентрация (ммоль) 1 мг/мл
ПротеазаSigmaP6911Концентрация (ммоль) 0,1 мг/мл
CaCl2BiosesangC2002Концентрация (ммоль) 0,05 мМ
Раствор коллангеназы 2
Изоляционный раствор ( 20 мл)
Бычий фетальный альбумин (раствор БСА 3,3 мл)Концентрация (ммоль) 1,67 мг/мл
Коллагеназа типа 2УортингтонКонцентрация LS004177 (ммоль) 1 мг/мл
CaCl<суб>2BiosesangC2002Концентрация (ммоль) 0,05 мМ
раствор
Раствор изоляции ( 40 мл)
фетального альбумина крупного рогатого скотаSigmaA7906(ммоль) 400 мг
CaCl2BiosesangC2002Концентрация (ммоль) 1 мМ
БСАКонцентрация

Ссылки

  1. Bers, D. M., et al. Cardiac excitation-contraction coupling. Nature. 415 (6868), 198-205 (2002).
  2. Eisner, D. A., et al. Integrative analysis of calcium cycling in cardiac muscle. Circ Res. 87 (12), 1087-1094 (2000).
  3. Palmiter, K. A., et al. Molecular mechanisms regulating the myofilament response to Ca2+: implications of mutations causal for familial hypertrophic cardiomyopathy. Basic Res Cardiol. 92 (S1), 63-74 (1997).
  4. Missiaen, L., et al. Abnormal intracellular Ca2+ homeostasis and disease. Cell Calcium. 28 (1), 1-21 (2000).
  5. Trafford, A. W., et al. A novel, rapid and reversible method to measure Ca buffering and time-course of total sarcoplasmic reticulum Ca content in cardiac ventricular myocytes. Pflugers Arch. 437 (3), 501-503 (1999).
  6. Berlin, J. R., et al. Intrinsic cytosolic calcium buffering properties of single rat cardiac myocytes. Biophys J. 67 (4), 1775-1787 (1994).
  7. Robertson, S. P., et al. The time-course of Ca2+ exchange with calmodulin, troponin, parvalbumin, and myosin in response to transient increases in Ca2+. Biophys J. 34 (3), 559-569 (1981).
  8. Schober, T., et al. Myofilament Ca2+ sensitization increases cytosolic Ca2+ binding affinity, alters intracellular Ca2+ homeostasis, and causes pause-dependent Ca2+-triggered arrhythmia. Circ Res. 112 (2), 170-179 (2012).
  9. Briston, S. J., et al. Balanced changes in Ca buffering by SERCA and troponin contribute to Ca handling during β-adrenergic stimulation in cardiac myocytes. Cardiovasc Res. 104 (2), 347-354 (2014).
  10. Patel, B. G., Wilder, T., John Solaro, R. J., et al. Novel control of cardiac myofilament response to calcium by S-glutathionylation at specific sites of myosin binding protein C. Front Physiol. 4, 336(2013).
  11. Jin, C. Z., et al. Myofilament Ca2+ desensitization mediates positive lusitropic effect of neuronal nitric oxide synthase in left ventricular myocytes from murine hypertensive heart. J Mol Cell Cardiol. 60, 107-115 (2013).
  12. Wang, Y., et al. Modulation of L-type Ca2+ channel activity by neuronal nitric oxide synthase and myofilament Ca2+ sensitivity in cardiac myocytes from hypertensive rat. Cell Calcium. 58 (3), 264-274 (2015).
  13. Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M., et al. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. J Mol Cell Cardiol. 51 (3), 288-298 (2011).
  14. Spurgeon, H. A., et al. Cytosolic calcium and myofilaments in single rat cardiac myocytes achieve a dynamic equilibrium during twitch relaxation. J Physiol. 447, 83-102 (1992).
  15. Preston, L. C., et al. Functional effects of the DCM mutant Gly159Asp troponin C in skinned muscle fibres. Pflugers Arch. 453 (6), 771-776 (2007).
  16. Willott, R. H., et al. Mutations in Troponin that cause HCM, DCM AND RCM: what can we learn about thin filament function? J Mol Cell Cardiol. 48 (5), 882-892 (2010).
  17. Yasuda, S. I., et al. A novel method to study contraction characteristics of a single cardiac myocyte using carbon fibers. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 281 (3), H1442-H1446 (2001).
  18. Sears, C. E., et al. Cardiac neuronal nitric oxide synthase isoform regulates myocardial contraction and calcium handling. Circ Res. 92 (5), e52-e59 (2003).
  19. Ashley, E. A., et al. Cardiac nitric oxide synthase 1 regulates basal and beta-adrenergic contractility in murine ventricular myocytes. Circulation. 105 (25), 3011-3016 (2002).
  20. Zhang, Y. H., et al. Reduced phospholamban phosphorylation is associated with impaired relaxation in left ventricular myocytes from neuronal NO synthase-deficient mice. Circ Res. 102 (2), 242-249 (2008).
  21. Roe, M. W., Lemasters, J. J., Herman, B., et al. Assessment of Fura-2 for measurements of cytosolic free calcium. Cell Calcium. 11 (2-3), 63-73 (1990).
  22. Grynkiewicz, G., et al. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J Biol Chem. 260 (6), 3440-3450 (1985).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Fura 2AMpatch clamp
Оценка Myofilament Ca
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.