Проектирование и разработка аптамеров-Gold наночастицу Based колориметрического анализа для В полевых условиях приложений

Краткое содержание

Дизайн и разработка анализа наночастиц колориметрического аптамеры золота для обнаружения малых молекул для в полевых условиях применения был рассмотрен. Кроме того, смарт-устройство колориметрический приложение (приложение) было подтверждено и была создана для использования в полевых условиях длительного хранения анализа.

Аннотация

Дизайн и разработка аптамеров-наночастиц золота (AuNP) колориметрического анализа для обнаружения малых молекул для в полевых условиях применения был рассмотрен. Целевая селективный AuNP цвета Анализы, основанные были разработаны в контролируемых доказательство правильности концепции лабораторных условиях. Тем не менее, эти схемы не оказывали до точки отказа, чтобы определить их практическое использование вне лабораторных условиях. Эта работа описывает общий подход для проектирования, разработки и устранения неисправностей в колориметрического анализа аптамеров-AuNP для малых аналитов молекулы и с использованием анализа для установки в полевых условиях. Анализ является предпочтительным, так как адсорбированные аптамеры пассивации поверхности наночастиц и обеспечивают средства для уменьшения и устранения ложных положительных ответов на нецелевых аналитов. Переходить эта система для практического использования требуется определения не только срок годности анализа аптамеров-AuNP, но создание методов и процедур для расширения долгосрочного хранения capabilностями. Кроме того, один из признанных проблем с колориметрического считывания является нагрузку на аналитиков, чтобы точно определить, часто тонкие изменения в цвете. Чтобы уменьшить ответственность на аналитиков в области, протокол цветовой анализ был разработан для выполнения цветовой идентификации обязанностей без необходимости выполнения этой задачи по лабораторным оборудованием класса. Способ создания и тестирования протокола анализа данных описан. Однако, чтобы понять и влиять на разработку адсорбированных аптамеров анализов, взаимодействия, связанные с аптамеров, цели и AuNPs требуют дальнейшего изучения. Полученные знания могут привести к покрой аптамеры для улучшенной функциональности.

Введение

Колориметрия является одним из старейших методов, используемых в аналитической химии. Для реализации этой технологии, качественное или количественное определение аналита производится на основании производства окрашенного соединения ^1. Как правило, цветные анализы используют реагенты, которые испытывают сдвиг цвета в присутствии вида аналита, что приводит к наблюдаемому или обнаруживаемое изменение цвета в спектре видимого света. Колориметрические был использован в обнаружении целей , начиная от атомов, ионов и малых молекул до сложных биологических молекул , таких как дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), пептидов и белков ^2-4. За последние два десятилетия, наноматериалы революцию в области анализов обнаружения, особенно в анализах на основе цвета ^5-6. Сочетание уникальных химических и физических свойств наноматериалов с элементом целевой селективного распознавания, такие как антитела, олигонуклеотидных аптамеров или пептидные аптамеры, привело к всплеску яп проектирование и разработка колориметрических анализов обнаружения ^7.

Наночастицы металлов имеют подтвержденную зависящее от размера, свойство изменения цвета, которое было использовано при разработке многочисленных колориметрических анализов. Наночастицы золота (AuNPs) представляют особый интерес из - за отличительного красного к синему сдвига цвета, когда дисперсный раствор частиц индуцируется агрегировать ^8, как правило , за счет точного добавления соли. Способность контролировать переход от дисперсного (красный) с совокупными (синий) государств привело к созданию колориметрических датчиков для ионной, небольшой молекулярной, пептидов, белков и клеточных мишеней ^2-4,9. Многие из этих датчиков используют аптамеров в качестве мотива цель распознавания.

Аптамеры представляют собой ДНК или рибонуклеиновой кислоты (РНК) , молекулы , выбранные из случайного пула 10 ¹² -10 ¹⁵ различных последовательностей ^10-11. Процесс отбора определяет целевые повторнокогнитивные элементы с аффинностью связывания в режиме низкой наномолярной, и Систематическое выделение лигандов экспоненциальным обогащением (SELEX) является наиболее широко известным процессом ^12-13. Преимущества аптамеры на основе олигонуклеотидных для приложений зондирования включают в себя простоту синтеза, управляемую химическую модификацию и химическую стабильность ^14-15.

Один из подходов к созданию колориметрического анализа сочетает в себе наноматериалы с элементами распознавания, состоит из сочетания этих двух видов через физической адсорбции ДНК-аптамеров молекул до AuNP поверхностей. С помощью связывания мишень-аптамеров, аптамер испытывает структурные изменения , которые изменяют ^16-18 взаимодействие аптамеров с поверхностью AuNP, что приводит к индуцируемым красного к синему цвета реакции ¹⁹ с добавлением соли. Эта удивительная особенность AuNPs обеспечивает наблюдаемый колориметрического механизм реагирования для устройств аптамеров основе, которые могут быть использованы для снятиязнак колориметрических анализов для различных аналитов.

Цветные анализы, разработанные с использованием нековалентных, физически адсорбированных аптамеры ДНК на AuNP поверхностях имеют клеймо быть слабым датчик платформы из-за проблем с надежностью, склонность к недостаточности вне контролируемых лабораторных условиях, а также отсутствие информации, доступной для использования в практической настройки. Тем не менее, на основе аптамеров-AuNP колориметрический анализ представляет интерес из-за простоты эксплуатации и наблюдаемой реакции цвета. Целью данной работы является создание протокола для проектирования, разработки, эксплуатации, уменьшение поверхности, связанных с ложной положительной реакции, а также длительного хранения ДНК-AuNP на основе колориметрического анализа с использованием кокаина в качестве репрезентативного аналита. Кроме того, мы предложили эту адсорбированный аптамеров анализа подход (Рисунок 1) как выгодно благодаря простоте и легкости в использовании , что привело к уменьшению числа стадий , чем при традиционном подходе для этих аптамеров-AuNP попкуAYS. Для этого теста, аптамер впервые был добавлен к AuNPs, которые позволяют адсорбироваться на поверхности в течение длительного периода времени. Дополнительным преимуществом такого подхода является сокращение реакции на нецелевых молекул аналита, связанных с поверхностными взаимодействий AuNP. Тем не менее, снижение ложных срабатываний ответ был за счет чувствительности анализа. Поэтому баланс между защитой поверхности и аналита доступности необходимо для поддержания нормальной функции анализа. Кроме того, основным недостатком анализа цветовых анализов с помощью иных средств, чем при помощи приборов является то, что результаты часто субъективны и открыты для интерпретации от аналитика к аналитику, в частности, при попытке дифференцировать тонкие различия в цвете. С другой стороны , существует целый ряд проблем , с возможностью создания на основе Instrumentation Laboratory полезной вне лаборатории, такие как наличие силы, практичности с портативностью и т.д. В этой работе, протокол анализа цвета был разработан для море портативность и устранить некоторые из догадок , обычно связанных с интерпретацией цвета на основе анализа ^20-21. По сравнению с предыдущими подходами, это усилие стремится подтолкнуть этих анализов в свои пределы для применений, помимо лабораторных условиях.

Протокол

1. Синтез с помощью цитрата Сокращение наночастиц золота (AuNP) и характеристика

1. Очистите коническую колбу (500 мл) и большой мешалку с 5 мл концентрированной азотной кислоты и 15 мл концентрированной соляной кислоты в химическом защитном кожухе.
   1. Влажный всю поверхность колбы с кислотной промывкой, смыва колбы нуклеазой свободной воды, и позволить колбу высохнуть.
2. Добавляют 100 мл 1 мМ золота (III) хлорида; следует использовать лист алюминиевой фольги, чтобы покрыть верхнюю часть кислотной очистке колбу Эрленмейера и тепла при непрерывном перемешивании на горячей плите до кипения.
3. Добавьте 10 мл 38,8 мМ цитрат натрия. Цвет меняется от прозрачного / серого, до темно-синий / черный, и, наконец, темно-красный в течение нескольких минут. Продолжайте перемешивание с помощью тепла от 10 мин.
4. Дать суспензии AuNP остыть до комнатной температуры и добавляют 110 мкл диэтилпирокарбонатом (DEPC) при непрерывном перемешивании.
5. Покройте всю колбуалюминиевая фольга и позволяют лечение DEPC инкубировать в течение ночи. Храните все AuNPs в темноте, в контейнерах для хранения янтарных или покрытые алюминиевой фольгой.
6. Автоклава подвеску AuNP, охлаждают до комнатной температуры и фильтруют через 0,22 мкм поры мембраны из ацетата целлюлозы. Храните фильтрованную, автоклавного маточного раствора AuNP в темноте при 4 ° С.
   Примечание: Лечение с помощью DEPC, стерилизации в автоклаве, и хранение при 4 ° C улучшит срок годности анализа аптамеров-AuNP. Хранение таким образом позволит анализа оставаться функциональным в течение более 2-х месяцев.
7. Вычислить концентрацию AuNP путем получения ультрафиолетовый-видимый поглощение при длине волны 520 нм, и используют коэффициент экстинкции (ɛ) 2,4 × 10 ⁸ л моль ^-1 см ^-1 с законом Бера путем вычисления концентрации (с). Концентрация была определена в 10 нМ с размером 15 нм, определенной методом динамического светорассеяния.
   Примечание: Концентрации будет варьироваться фром от партии к партии. Развести запасы AuNP с нуклеазы свободной воды по мере необходимости для поддержания желаемого 10 нМ AuNP суспензии.

2. ДНК-аптамеров, буфер, раствор и анализа Получение

1. Покупка или синтезировать связывания аптамеров последовательностей с использованием стандартной химии ²² фосфорамидитную следующий кокаин:
   MN4 ^19: 5'-GGC GAC AAG GAA AAT ССТ TCA ACG AAG TGG GTC GCC-3 '
   MN6 ^19: 5'-GAC AAG GAA AAT ССТ TCA ATG AAG TGG GTC-3 '
2. Очищают аптамеров с использованием стандартных обессоливания ^23. Развести олигонуклеотиды в нуклеазы без воды на скорости либо 100 мкМ или 1 мМ маточных растворов. Алиготе и хранить при температуре -20 ° С в течение нескольких месяцев.
3. Покупка или готовить запасы стерильного 1 М 4- (2-гидроксиэтил) -1-пиперазинэтансульфонова кислота (HEPES) , рН 7,4, 100 мМ хлорида магния (MgCl _2), и 1 М хлорида натрия (NaCl).
4. Приготовьте 50 мл буфера в нуклеазы без воды Wiй концентрации 20 мМ HEPES, 2 мМ MgCl _2, рН 7,4 и хранят при комнатной температуре в течение нескольких месяцев.
5. Инкубируйте ДНК с раствором запас AuNP (10 нМ) в течение 3-4 ч при комнатной температуре и защите от света. Изменять объем AuNPs в соответствии с пожеланиями, чтобы обеспечить достаточное количество образца для испытания должны быть выполнены (2,5-7,5 мл).
   1. При этом использовать загрузку плотности 90, 120, 150 и 180 молекул ДНК / AuNP в этой работе. Изменять объем и концентрации ДНК соответственно. Настройтесь охват ДНК, чтобы уменьшить непреднамеренные AuNP связанных с цветом поверхности ответов нецелевых аналитов.
      Примечание: Увеличение охвата ДНК приводит к ухудшению чувствительности анализа. Плотности погрузочные вычисляются зная концентрацию запаса AuNP, и подсчете общего количества AuNPs, присутствующих в объеме, требуемой для использования в экспериментах. Если фактические плотности покрытия желательно, протоколы существуют для получения этих значений ^7. Охват ДНК определяли с использованием 50 кДа-мolecular масса отсечки спин колонки для разделения AuNP связанной ДНК из свободной ДНК. В AuNPs слишком велики, чтобы пройти через ротационную колонку, в то время как свободная ДНК будет проходить через легко. Следующим шагом для количественного определения свободной ДНК, собранной с использованием измерений оптической плотности или одноцепочечной ДНК флуоресцентный краситель.
6. Добавить равный объем 20 мМ HEPES, 2 мМ MgCl _2, рН 7,4 буфера и поместить образец при 4 ° С в темноте в течение ночи. Анализ аптамеров-AuNP был в 10 мМ HEPES, 1 мМ MgCl _2, рН 7,4 (буфера для тестирования ).

3. Соль титрование и настройка Анализ

1. Определить начальную концентрацию соли, необходимой для индукции анализа ответа цвета солью титрования с анализа пустым. Добавьте 20 мкл метанола (пробел) до 180 мкл аликвоты аптамеров-AuNP анализа в 96-луночный планшет. Titrate образцы с увеличением объемов исходного раствора NaCl (1 М или 2 М) и определить точку эквивалентности (рис 2 Примечание: Анализ можно масштабировать до меньших объемов, сохраняя соотношение количества метанола заготовки (или растворенной анализируемого вещества) к аптамеров-AuNP анализа то же самое.
   1. При этом определить объем NaCl, необходимое, чтобы вызвать малейшее изменение цвета с помощью визуального наблюдения. Исходным концентрации для анализа было 75 до 130 мм для MN4 и MN6 соответственно в / AuNP плотности покрытия 60 молекулы ДНК.
      Примечание: Для количественного определения для начальной концентрации соли, средняя точка кривой титрования служит хорошей отправной точкой. Кроме того, используемые концентрации будут варьироваться в зависимости от аптамеров, плотности покрытия ДНК, изо дня в день работы, и от партии к партии.
2. Оптимизация отклика для анализа, добавить 20 мкл разбавленных молекул аналита в метаноле до 180 мкл аликвоты аптамеров-AuNP анализа в 96-луночный планшет при комнатной температуре. Сразу же добавить концентрацию NaCl, определенный в предыдущем шаге, чтобы инициировать реакцию анализа цвета.
   НЕТTE: Используйте многоканальную пипетку для выполнения нескольких экспериментов одновременно.
3. Получить наибольшее изменение цвета, возможно путем увеличения или уменьшения концентрации NaCl, и сравнение целевого ответа на пустой ответ. Используйте концентрацию NaCl, которая обеспечивает самую большую разницу отклика.
4. Заметим, или измерения отклика анализа 150 сек следующий NaCl дополнение. Анализ оптической плотности при длине волны 650 нм и 530 нм с помощью спектрометра или получить цифровой фотоаппарат ответа анализа (смотри раздел 4 для протокола анализа фото).
   Примечание: микропланшет-ридера использовалась при получении измерения для этой работы.
5. Plot результаты как отношение оптической плотности , полученные при 650 нм и 530 нм (E ₆₅₀ / E ₅₃₀₎ в зависимости от концентрации аналита. Нормализовать реакцию анализа на чистый сигнал, как это было сделано в этой работе.

4. Фото и цифрового анализа изображений цвета Анализ протокола

1. ДГОе образцы анализа, как было описано (разделах 3.2-3.3). Поместите 96-луночного планшета на просвечивания.
   Примечание: Стандартная лаборатория трансиллюминатор, как правило, слишком яркий, чтобы получить пригодные для использования цифровых изображений для этого анализа. Эти Трансиллюминаторы вызывают регулярно расположенные "темные линии" появляться в цифровом изображении благодаря интенсивности источника света. Создание просвечивания из светодиодах (LED) на основе светового короба и кусок из матового пластика работает хорошо.
2. Получить фотографии 96-луночный планшет при 150 сек после NaCl Кроме того, импортировать изображения в программное обеспечение для анализа изображений, а также рассчитать средние красного, зеленого и синего (RGB), используя инкрементный метод усреднения, как показано в уравнении 1 ^24:
   (1)
3. Преобразование значения RGB из стандартного RGB (SRGB) цветовое пространство для диаграммы цветности (CIExyY) цветового пространства, с использованием следующих уравнений ^24:
   (2)
   (3)
   (4)
4. Преобразование экспоненциальные значения RGB для линейных значений RGB с использованием уравнения 2. Матрица указано в уравнении 3 используется для расчета X, Y и Z значения МКО цветового пространства ^24.
5. Вычислить значения х и у , используя уравнение цветности 4 , представляющий средний цвет пикселов в области , выбранных для анализа ^24.
6. Проведение анализа в каждую лунку и построить значения цветности для генерирования калибровочной кривой (рисунок 4). Получить стандартную ошибку, анализируя цвет различных областей той же скважине.

5. Замораживание Аптамер-AuNP Анализ для долгосрочного хранения

1. Подготовьте аптамеров-AuNP компоненты анализа, как описано в разделах 2.4 и 2.5, Сделать отдельные растворы, содержащие 1 г / мл трегалозу и 1 г / мл сахарозы в нуклеазы без воды, чтобы сделать криогенной решение.
   Примечание: Высокие концентрации трегалозы и сахарозы использовались для снижения коэффициента разбавления при приготовлении теста для замораживания. Нагреть сахарные растворы на плитке в стакане воды, чтобы полностью растворить сахар перед употреблением.
2. Приготовьте раствор, содержащий 19,2 мг / мл трегалозы и 4,8 мг / мл сахарозы с 60 MN4-ДНК / AuNP анализа при конечном объеме 200 мкл в 1,5 мл микроцентрифужных пробирках. Конечные концентрации криогенного решение будет меняться в зависимости от покрытия ДНК.
   Примечание: Образцы должны быть заморожены, не должна превышать 300 мкл. Большие объемы могут не замерзает должным образом.
3. Флэш заморозить образцы с использованием -146 ° C морозильнике или в жидком азоте. Хранить образцы замораживали до использования. Хранение может быть в -80 ° С или -20 ° С, как только вспышка замораживания завершена.
4. Для этой работы, оставьте образцы в -146 ° C морозильнике надночь, а затем передать в морозильной камере -20 C ° для длительного хранения.
   Примечание: Вспышка замораживание может привести к аптамер-AuNPs агрегировать. Проверьте целостность процесса замораживания путем мониторинга профиля оптической плотности и сравнивая его с незамерзшей образца. Если наблюдается агрегация, увеличение количества криогенного раствора, чтобы компенсировать эту проблему.
5. Растаяйте образцов при комнатной температуре и использовать достаточно только по мере необходимости образцы для проведения экспериментов. Получить спектры поглощения образцов талых и сравнить с исходным спектров незамороженном криогенного раствора обработанного образца. Измеряют поглощение от 400 нм до 700 нм.
6. Выполните титрование соли (раздел 3.1), тест анализа (раздел 3.2), и сюжет результатов (разделы 3.3 и 3.4), как описано выше.

Результаты

Основная цель данной работы заключалась в разработке и исследовать стабильность и надежность аптамеров на основе AuNP колориметрического анализа для использования в полевых условиях. Как было отмечено в предыдущей публикации, две различные стратегии для создания анализа были исследованы ^7. Анализы были названы Свободную аптамеров Пробирной и адсорбированная аптамеров анализа. Адсорбированная Аптамер Анализ был более привлекательным для целей анализа на fieldable обнаружения

Обсуждение

За последнее десятилетие, на основе наночастиц колориметрические анализы были разработаны для обнаружения целей , включают небольшие молекулы, ДНК, белки и клетки ^2-4. Анализы, которые используют ДНК-аптамеров с наночастицами были все больший интерес. Как правило, эти колориметрические анализы выполняются путем смешивания ДНК-аптамер с молекул аналита с последующим добавлением к AuNPs ^9-10. Тем не менее, эти анализы были использованы в доказательство правильности концепции демонстраций с контролиру...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Хлоридгидрат золота(III) хлорида	Сигма	254169	Чистота 99,999% важна, и растворы всегда создавались свежими
Дигидрат натрия цитрат	Сигма	W302600-1KG-K	Мы обнаружили, что производитель сильно влияет на анализы AuNP, и решения всегда создавались свежими
Синергия	Bio-TEK	HT	Подойдёт любой спектрометр поглощения, но считыватель пластин обеспечивает анализ множественных образцов
4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-этансульфонная кислота (HEPES) буфер, 1  M стерилизирована	Амреско	J848	Любой стерилизованный бренд подойдёт
Corning, фильтрационная система объёмом 250 мл, 0,22  & микро; М целлюлозный ацетат	Рыбак	430767	Другие мембраны были обнаружены способными удалять AuNP
УФ-спектрофотометр	Вариан	Кэри 300	Любой спектрометр поглощения подойдёт
Гексагидрат хлорида магния	Fluka	63068	≥ 98% подходит любой бренд
ДНК	IDT	Обычай	ДНК очищалась с помощью колонки для очистки соли, можно использовать более высокие методы очистки
Прокаин гидрохлорид	ACROS	AC20731-1000	Было подготовлено 99% запасов 1 мг/мл метанола
Соляная кислота	Рыбак	A144S-500	36,5-38,0% с другими брендами подойдёт
Кокаин гидрохлорид	Липомед	COC-156-HC-1LM	Мы обнаружили, что производитель сильно влияет на анализы AuNP
Азотная кислота	Рыбак	A509-SK212	65% с другими брендами подойдёт
Раствор хлорида натрия, биореагент 5 м	Сигма	S5150-1L	Стерильные растворы из твёрдого материала подойдут
Диэтилпирокарбонат	Сигма	D5758-25 мл	≥ 97% подходит любой бренд
Гидрохлорид экгониниметилестра	Липомед	COC-205-HC-1LM	Мы получили контроль EME от того же производителя, что и мишень для кокаина
Микроцентрифугные трубки, Axygen Scientific, нестерильные, 1.7  мл	VWR	10011-722	Мы обнаружили, что производитель сильно влияет на анализы AuNP, а трубки были автоклавированы внутри компании
Вода без нуклеазы
метанол