Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Генерация Индуцированные-плюрипотентных стволовых клеток с использованием фибробластоподобных синовиоциты Выделен из суставов больных ревматоидным артритом

9.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54072

⸱

16 октября 2016 г.

 ,  ,  , 
1CiSTEM Laboratory, Convergent Research Consortium for Immunologic Disease, Division of Rheumatology, Seoul St. Mary's Hospital, Republic of Korea, 2Division of Rheumatology, Department of Internal Medicine, Seoul St. Mary's Hospital, Institute of Medical Science, Republic of Korea, 3College of Medicine, The Catholic University of Korea, Republic of Korea

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы опишем протокол для генерации человека наведенного плюрипотентных стволовых клеток из пациента, полученных фибробластоподобных синовиоциты, с использованием лентивирусов системы без фидерных клеток.

Аннотация

Зрелые соматические клетки могут быть отменены в плюрипотентные стволовые клетки, как состояние, используя определенный набор факторов перепрограммирования. Многочисленные исследования породили наведенного плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) из различных типов соматических клеток с помощью трансдукции четыре Яманака факторы транскрипции: Oct4, Sox2, Klf4 и с-Myc. Изучение ИПСК остается на переднем крае биологической и клинических исследований. В частности, иПСК конкретного пациента могут быть использованы в качестве новаторского инструмента для изучения патобиологии заболевания, так как иПСК может быть вызван из ткани любого индивидуума. Ревматоидный артрит (РА) является хроническим воспалительным заболеванием, классифицируемых разрушением хряща и структуры кости в суставе. Синовиальной гиперплазии является одной из основных причин, или симптомы, которые приводят к этим результатам в РА. Фибробластоподобных синовиоциты (ФЛС) являются основным компонентом клетки в гиперплазированном синовии. ФЛС в суставе беспредельно размножаться, в конечном счете, вторжение в соседний cartilвозраст и кости. В настоящее время гиперпластический синовиальной можно удалить только с помощью хирургической процедуры. Удаленный синовиальной используется для исследований RA в качестве материала, который отражает воспалительное состояние сустава. В качестве основного игрока в патогенезе ревматоидного артрита, ФЛС может быть использован в качестве материала для создания и исследовать ИПСК пациентов с РА. В данном исследовании мы использовали FLSS пациента RA для создания иПСК. Использование лентивирусов системы, мы обнаружили, что ФЛС может генерировать RA конкретного пациента IPSC. В иПСК, полученные от ФЛС можно дополнительно использовать в качестве инструмента для изучения патофизиологии РА в будущем.

Введение

Плюрипотентные стволовые клетки платформа следующего поколения в различных клинических и биологических полей. Они являются многообещающим инструментом, который может быть использован при моделировании заболеваний, скрининга лекарственных средств и регенеративной медицинской терапии. Эмбриональные стволовые клетки человека (ЭСК) в основном были использованы для изучения и понимания плюрипотентных клеток. Тем не менее, изолированных разрушением человеческой бластоцисты, ЭСК связаны с несколькими этическими проблемами. В 2007 году доктор Яманака и его команда вспять процесс программирования клеток и разработал стволовые клетки из человеческой взрослых соматических клеток 1,2. Таким образом, в отличие от ЭСК, наведенного плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) могут быть получены из зрелых соматических клеток, избегая этических препятствий.

Как правило, иПСК генерируются поставку четырех экзогенных генов: Oct4, Sox2, Klf4 и с-Мус. Эти факторы Яманака первоначально доставлены с использованием лентивирусов и ретровирусных систем. Первые иПСК были получены из мышиного соматической Cгезов 3. Впоследствии, методика была применена к фибробластах дермы человека 1,2. Последующие исследования успешно создали иПСК из различных источников, таких как моча, кровь 4 5,6, кератиноциты 7, и несколько других типов клеток. Тем не менее, есть некоторые соматические клетки, которые не были использованы в перепрограммировании, а также скрининг возможностей перепрограммирования клеток разных типов от конкретных тканей в состоянии болезни, по-прежнему требуется.

Ревматоидный артрит (РА) является заболеванием, которое может поражать все суставы и привести к аутоиммунных состояний в других органах. РА поражает около 1% взрослых в развитых странах мира. Это довольно распространенное заболевание , и его частота возрастает с каждым годом 8. Тем не менее, RA трудно определить на ранних стадиях и oncebone разрушения происходит не существует лечения, которое может восстановить ущерб. Кроме того, эффективность лекарственного средства отличается от пациента к пациенту, и трудно предсказать, медикине, что требуется. Таким образом, разработка метода скрининга наркотиков необходим, и необходим материал клеток, которые могут отражать условия РА.

Фибробластоподобных синовиоцитов (FLSS) являются активным участником клеточное в патогенезе ревматоидного артрита 9,10. ФЛС существуют в синовиальной интимы прокладки между суставной капсулы и полости, которая также упоминается как синовии. Поддерживая совместную структуру и обеспечивая питательные вещества для окружающей хряща, ФЛС обычно играют решающую роль в совместной функции и техническом обслуживании. Тем не менее, ФЛС в РА имеют инвазивный фенотип. РА ФЛС есть рак , как фенотип, в конечном счете разрушает окружающую кость бесконечной пролиферации 10. С помощью этой уникальной характеристикой, ФЛС может быть использован в качестве перспективного материала, который может отражать патобиологии RA. Тем не менее, эти клетки редко производятся, так и клеточные фенотипы изменяют , так как клетки проходят через несколько проходов в ин витро условия. Таким образом, она может быть сложной, чтобы использовать RA FLSS в качестве инструмента, который может представлять состояние пациента.

Теоретически, RA пациента, полученных иПСК (RA-иПСК) может стать идеальным инструментом для скрининга лекарственных средств и проведения дальнейших исследований. Сформированные иПСК обладают способностью самообновления и может быть сохранена и расширена в пробирке. С плюрипотентности, эти клетки могут быть дифференцированы в зрелые хондроцитов и остеоцитов родах, которые могут способствовать клеточного материала для конкретных исследований в РА и других заболеваний , связанных с костями 11.

В данном исследовании мы покажем, как изолировать и расширить FLSS от удаленного хирургическим путем синовии, и как генерировать RA-ИПСК из ФЛС с использованием лентивирусов, содержащих Яманака факторы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Заявление по этике: Этот протокол исследования был одобрен этическими комитетами католического университета Кореи (KC12TISI0861).

1. синовиоцитов Выделение и расширения

  1. синовиоцитов Изоляция
    1. Стерилизация две пары хирургических ножниц и одну пару щипцов.
    2. Передача синовиальной ткани на 100 мм чашку и промывают 5 мл фосфатно-солевым буферным раствором (PBS), содержащем 1% пенициллина / стрептомицина.
    3. Отрезанные желтоватые жировую ткань и кости остатки. Передача обрезанную ткани на лунку 6-луночного планшета и добавляют 5 мл среды Игла в модификации Игла (DMEM) с 20% фетальной телячьей сыворотки (FBS).
    4. Нарезать ткани с ножницами, пока кусочки не достаточно малы, чтобы проникать Пипеткой.
    5. Передача ткани, содержащей носитель в коническую пробирку на 50 мл. Урожай оставшийся материал путем добавления 5 мл DMEM с 20% FBS в 6-луночный планшет, а затем перенести в пробирку.
    6. Оттепель коллагеназы на льду. Добавить коллагеназы до конечной концентрации 0,01% и запечатать трубу с парафином. Инкубируют на водяной бане при 37 ° C при встряхивании в течение 4 часов.
    7. После инкубации, заполнить трубку с DMEM с 20% FBS, пока общий объем не 50 мл и центрифуге при 300 мкг, RT в течение 10 мин.
    8. Удалить супернатант, не нарушая гранул и добавляют 40 мл среды для ресуспендирования гранул.
    9. Повторите шаги 1.1.10-1.1.11.
    10. Ресуспендируют осадок в 25 мл DMEM с 20% FBS и ждать больших комков ткани опускаются на дно.
    11. Перенести супернатант в 100 мм чашку и инкубировать при 37 ° С в 5% CO 2 в течение 14 дней.
  2. Синовиоцитов обслуживание и расширение
    1. Выбросьте использованные носители из пластины и промыть клетки с 5 мл PBS.
    2. Добавить 1 мл ФБР / 1 мМ ЭДТА и инкубировать при 37 ° С в 5% CO 2 в течение 2 мин.
    3. Нажмите на блюдо мягко и transfeR клетки в коническую пробирку на 15 мл. Центрифуга клетки при 250 мкг, RT в течение 2 мин.
    4. Удалить супернатант, не нарушая гранул и ресуспендируют осадок в 30 мл DMEM с 20% FBS.
    5. Передача клетки до 3 х 100 мм чашках, не оставляя видимых остатки материала.
    6. Заменить носитель свежей средой каждые 3 d. Разделение клеток при 80% сплошности с использованием 1 мл ФБР / 1 мМ ЭДТА. Поддерживать до прохождения 3 перед использованием. Разделите каждое блюдо из клеток в 3-х блюд в каждом расколе.
      Примечание: После достижения прохода 3, клетки, которые не будут использоваться сразу же могут быть заморожены.

2. Перепрограммирование ФЛС Использование Лентивирусов-кодирующих факторы Яманака

  1. Трансдукция (Д0)
    1. Семенной 3 × 10 4 клеток на лунку 6-луночного планшета в ростовой среде (500 мл DMEM с добавлением 10% FBS и 1% пенициллина / стрептомицина , дополненной). Инкубируйте клетки O / N при температуре 37 ° С в 5% CO2.
    2. На следующий день, удалите один флакон, содержащий 4 лентивирусов Яманака факторов: Oct4, Klf4, Sox2 и с-Мус из морозильной камеры и оттепель при 4 ° С. Примечание: Лентивирус был получен в соответствии с процедурой , описанной в предыдущем исследовании 11.
    3. В то время как оттаивает вирус, изменения носителя питательной среды FLS (20% FBS плюс антибиотики в DMEM), содержащей 10 мкг / мл полибрен и 50 мкг / мл аскорбиновой кислоты.
    4. После смены носителя, добавляют 30 мкл лентивирусов к клеткам и аккуратно перемешать. Для улучшения инфекции, центрифугировать планшет при 680 х г, 35 ° С в течение 30 мин.
    5. После центрифугирования, инкубировать клетки при 37 ° С в 5% CO 2.
  2. Техническое обслуживание До перепрограммирование Видимый
    1. В течение 3 суток, замените носитель ежедневно с FLS ростовой средой, содержащей 0,1 мМ бутират натрия и 50 мкг / мл аскорбиновой кислоты.
    2. На следующий день, замените носитель со смесью сред роста FLS иIpsc медиа (соотношение 1: 1), содержащего 0,1 мМ бутират натрия и 50 мкг / мл аскорбиновой кислоты.
      Примечание: Компоненты СМИ иПСК приведен в списке материалов / оборудования.
  3. Деление клеток для формирования колонии
    1. Приготовьте витронектиновый покрытием 6-луночный планшет.
      1. Добавить 60 мкл витронектина до 6 мл PBS без Са 2+ и Mg 2+. Поместите 2 мл смеси в каждый лунки и инкубируют в КТ в течение по меньшей мере 1 ч. Примечание: Рабочая концентрация витронектина составляет 5 мкг / мл.
    2. На d5, мыть клетки с PBS.
    3. Добавить 1 мл PBS / 1 мМ ЭДТА , чтобы открепления клеток и инкубируют при 37 ° С в атмосфере 5% СО 2 в течение 2 мин.
    4. Урожай клетки и центрифуги при 250 мкг, RT в течение 2 мин.
    5. Разделение клеток при 3-х различных соотношениях (1: 3, 1: 6 и 1: 9) для достижения различных confluencies. Добавьте 900 мкл среды к осадку клеток и ресуспендируют. Добавьте 300, 150, и 100 мкл клеточной смеси на лунку 6-луночный планшет для достижения соотношении 1: 3, 1: 6 и 1: 9, соответственно.
    6. Замените носитель ежедневно с IPSC СМИ, пока не появятся колонии. Колонии появится примерно через D18. Примечание: На данном этапе IPSC колонии сосуществовать с не-перепрограммировать ФЛС.
  4. Сбор колонии
    1. Подготовка 48-луночный планшет с витронектином покрытием путем добавления 500 мкл витронектина в лунки, и инкубируют при комнатной температуре в течение по меньшей мере 1 ч.
    2. Поместите микроскоп на чистом столе, и снять 6-луночного планшета из инкубатора.
    3. Удалить решение витронектиновый из 48-луночного планшета и добавить 500 мкл среды IPSC, дополненной 10 мМ Rho-ассоциированной, суперспирализованный содержащий протеинкиназы (ROCK) ингибитор.
    4. Используя наконечник пипетки 10p, обвести колонии. Перенести принимаемое колонии в одну лунку 48-луночного планшета.
    5. После того, как собирание несколько колоний, инкубировать клетки при 37 ° С в атмосфере 5% СО 2.
    6. Поддерживать клетки до тех пор, пока колонии большие ENOтьфу для передачи. Примечание: Обычно мы пролили клетки, когда колония выходит из видимой области микроскопа, если смотреть на 100х.

3. Иммунофлуоресценции Окрашивание

  1. Cell Подготовка
    1. Поместите стерильную 18 мм защитное стекло в 12-луночного планшета.
    2. Добавьте 1 мл PBS, чтобы охладить и полоскать покровного стекла.
    3. Заменить на 1 мл мл витронектина раствора 10 мкг /.
    4. Инкубируйте планшет при комнатной температуре в течение по меньшей мере 1 ч.
    5. Отменить решение витронектиновый и ИПСК пластины в витронектина покрытием пластины 12-луночного и культуры в течение 7 дней при температуре 37 ° С, 5% СО 2, изменение средств массовой информации ежедневно.
  2. Cell Окрашивание
    1. Выбросьте культуральной среды и промыть клетки с PBS один раз.
    2. Зафиксировать клетки в 0,4% параформальдегида (PFA) в течение 30 мин при комнатной температуре.
    3. Клетки проницаемыми с 0,1% тритона Х-100 в течение 5 мин при комнатной температуре.
    4. Удалите пермеабилизациираствора и блок с ФБС, содержащим 2% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в течение 30 мин при комнатной температуре.
    5. Развести антитела в PBS , содержащем 2% BSA в соответствии с таблицей 1. Инкубируйте клетки с первичными антителами в течение 2 ч при комнатной температуре.
    6. Добавить вторичные антитела (разбавленный 1: 200) и инкубировать клетки в течение 1 часа при комнатной температуре, избегая света.
    7. Treat клеток с 1 мкл / мл DAPI в течение 10 мин.
    8. Поместите покровное стекло поверх предметное стекло с реагентом antifade и инкубируют при комнатной температуре в течение 24 ч, избегая света.
    9. Проверьте выражение с помощью флуоресцентного микроскопа.

4. В режиме реального времени полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР)

  1. Экстракт мРНК из клеточного осадка с помощью гуанидина тиоцианата-фенол-хлороформ методом экстракции 11.
  2. Amplify кДНК из 2 мкг тотальной мРНК с использованием обратной транскрипции 11.
  3. Смешайте компоненты, необходимые для проведения ПЦР с использованием 2 мкл кДНК ТЭМПластина 11.
  4. Выполните RT-PCR и проверить результаты помощью гель - электрофореза 11.

5. щелочной фосфатазы (AP) Окрашивание

  1. Культура иПСК в течение 5-7 дней при 37 ° С, 5% СО 2 до окрашивания.
  2. Аспирируйте средства массовой информации и зафиксировать клетки с 4% PFA в течение 1 мин.
  3. Выбросьте закрепитель и промойте клетки с буфером для ополаскивания 1X.
  4. Подготовка реагентов для окрашивания AP. Перемешайте реагенты в следующем соотношении: Fast Red Violet: нафтол AS-BI фосфатный раствор: вода = 2: 1: 1.
  5. Инкубируйте клетки с красящим раствором при комнатной температуре в течение 15 мин, избегая света.
  6. Выбросьте окрашивание раствора и промыть клетки с буфером для ополаскивания.
  7. Накройте клетки с PBS, чтобы предотвратить высыхание и проверять выражение с использованием светлого поля микроскопа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В данном исследовании мы опишем протокол для генерации иПСК из ФЛС с использованием лентивирусов системы. На рисунке 1А показана простая схема протокола изоляции FLS. После хирургического удаления синовиальной оболочки, ткань разрезали на маленькие кусочки с помощью хирургических ножниц. Коллагеназы был добавлен, чтобы изолировать клетки от комков ткани. Клетки инкубировали в течение 14 дней перед дальнейшей обработкой. На фиг.1В показан...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

До открытия ИПСК, ученые в основном использовали эмбриональные для изучения биологии стволовых клеток и других клеточных клонов путем дифференциации. Тем не менее, стволовые клетки происходят из внутренней массы бластоцисты, которая является ранней стадии эмбриона. Для выделения ЭСК, разрушение бластоцисты является неизбежным, повышение этических вопросов, которые невозможно преодолеть. Кроме того, хотя ЭСК имеют стволовости характеристики и плюрипотентности, они не могут быть получены от физических лиц и иногда не явля...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана Исследовательской программой, финансируемой Корейскими центрами по контролю и профилактике заболеваний (HI13D2188).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Чашка 100 ммTPP93100
6-луночная пластинаTPP92006
50 мл Кузнечная трубкаSPL50050
15 мл Корническая трубкаSPL50015
10 мл Одноразовая пипеткаFalcon7551
мл Одноразовая пипеткаFalcon7543
12-луночная пластинаTPP92012
FLS Изоляционные материалы
хирургические ножницы
Хирургический щипец
DPBSLife Technologies14190-144
DMEMLife Technologies11995-073
Пеницилин стрептомицинSigma AldrichP4333
Фетальная бычья сыворотка (FBS)Life Technologies16000-044
КоллагеназаSigma AldrichC6885-100MG
ПарапленкаSigma Aldrich54956
PBS/1 mM EDTALife Technologies12604-039
iPSC Generation Материалы
DMEMLife Technologies11885
MEM Раствор заменимых аминокислот (100x)Life Technologies11140-050
β-меркаптоэтанолSigma AldrichM3148
ПолибренChemiconTR-1003-G
Пеницилин СтрептомицинLife TechnologiesP4333
Фетальная бычья сыворотка (FBS)Life Technologies16000-044
DPBSLife Technologies14190-144
Лентивирус
DMEM/F12, HEPESLife Technologies11330-057iPSC медиа ингредиент (500 мл)
Бикарбонат натрияLife Technologies25080-094iPSC медиа ингредиент (Conc.: 543 μ г/мл)
Селенит натрияSigma AldrichS5261iPSC медиа ингредиент  (Конц.: 14 нг/мл)
Вещественный ингредиент человеческого трансфферинаSigma AldrichT3705iPSC (Conc.: 10,7 μ г/мл)
Базовый ингредиент среды FGF2Peprotech100-18BiPSC  (Конц.: 100 нг/мл)
Human InsulinLife Technologies12585-014iPSC медиа ингредиент (Conc.: 20 μ г/мл)
Человеческий TGF&бета; 1Ингредиент среды Peprotech100-21iPSC (Конц.: 2 нг/мл)
Ингредиент среды AscorbicAcid Sigma AldrichA8960iPSC  (Конц.: 64 μ г/мл)
ПолибренChemiconTR-1003
Бутират натрияSigma AldrichB5887
ВитронектинLife TechnologiesA14700
ROCK Ингибитор SigmaAldrichY0503
Guality Control Материалы
18 мм Защитное стеклоSuperiorHSU-0111580
4% параформальдигид (PFA)Технологии и ИнновацияBPP-9004
Triton X-100BIOSESANG9002-93-1
Бычья сыворотка альбумин (BSA)Vector LabSP-5050
Anti-SSEA4 АнтителоMilliporeMAB4304
Anti-Oct4 АнтителоSanta CruzSC9081
Anti-TRA-1-60 АнтителоMilliporeMAB4360
Anti-Sox2 АнтителоBiolegend630801
Anti-TRA-1-81 АнтителоMilliporeMAB4381
Anti-Klf4 АнтителоAbcamab151733
Alexa Fluor 488 козье антитело против мыши IgG (H+L)Молекулярный зондA11029
Alexa Fluor 594 козье антитело против кролика IgG (H+L)Молекулярный зондA11037
DAPIMolecular ProbeD1306
Prolong gold antifade reagentInvitrogenP36934
Slide Glass, покрытыйHyun Il Lab-MateHMA-S9914
ТризолInvitrogen15596-018
ХлороформSigma Aldrich366919
изоприпилспиртMillipore109634
ЭтанолDuksan64-17-5
RevertAid First Strand набор для синтеза кДНКThermo ScientficK1622
i-Taq ДНК-полимеразаiNtRON BIOTECH25021
UltraPure 10x TBE BufferLife Technologies15581-044
загрузка звездыDyne BioA750
AgaroseSigma-Aldrich9012-36-6
1 kb (+) ДНК-маркер лестницыEnzynomicsDM003
Щелочная фосфатазаMilliporeSCR004
5

Ссылки

  1. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
  2. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  3. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  4. Zhou, T., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples. Nat Protoc. 7 (12), 2080-2089 (2012).
  5. Haase, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood. Cell Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).
  6. Loh, Y. H., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human blood. Blood. 113 (22), 5476-5479 (2009).
  7. Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat Biotechnol. 26 (11), 1276-1284 (2008).
  8. Scott, D. L., Wolfe, F., Huizinga, T. W. Rheumatoid arthritis. Lancet. 376 (9746), 1094-1108 (2010).
  9. Chang, S. K., Gu, Z., Brenner, M. B. Fibroblast-like synoviocytes in inflammatory arthritis pathology: the emerging role of cadherin-11. Immunol Rev. 233 (1), 256-266 (2010).
  10. Bartok, B., Firestein, G. S. Fibroblast-like synoviocytes: key effector cells in rheumatoid arthritis. Immunol Rev. 233 (1), 233-255 (2010).
  11. Lee, J., et al. Generation of disease-specific induced pluripotent stem cells from patients with rheumatoid arthritis and osteoarthritis. Arthritis Res Ther. 16 (1), R41(2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Лентивирусная трансдукцияфакторы Яманакивыделение тканейкультура клетокпокрытие витронектиномпикирование колонийформирование тератомы
Генерация Индуцированные-плюрипотентных стволовых клеток с использованием фибробластоподобных синовиоциты Выделен из суставов больных ревматоидным артритом
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.