Методическая статья

Генерация Индуцированные-плюрипотентных стволовых клеток с использованием фибробластоподобных синовиоциты Выделен из суставов больных ревматоидным артритом

DOI:

10.3791/54072

⸱

16 октября 2016 г.

 ,  ,  , 
1CiSTEM Laboratory, Convergent Research Consortium for Immunologic Disease, Division of Rheumatology, Seoul St. Mary's Hospital, Republic of Korea, 2Division of Rheumatology, Department of Internal Medicine, Seoul St. Mary's Hospital, Institute of Medical Science, Republic of Korea, 3College of Medicine, The Catholic University of Korea, Republic of Korea

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы опишем протокол для генерации человека наведенного плюрипотентных стволовых клеток из пациента, полученных фибробластоподобных синовиоциты, с использованием лентивирусов системы без фидерных клеток.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Зрелые соматические клетки могут быть отменены в плюрипотентные стволовые клетки, как состояние, используя определенный набор факторов перепрограммирования. Многочисленные исследования породили наведенного плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) из различных типов соматических клеток с помощью трансдукции четыре Яманака факторы транскрипции: Oct4, Sox2, Klf4 и с-Myc. Изучение ИПСК остается на переднем крае биологической и клинических исследований. В частности, иПСК конкретного пациента могут быть использованы в качестве новаторского инструмента для изучения патобиологии заболевания, так как иПСК может быть вызван из ткани любого индивидуума. Ревматоидный артрит (РА) является хроническим воспалительным заболеванием, классифицируемых разрушением хряща и структуры кости в суставе. Синовиальной гиперплазии является одной из основных причин, или симптомы, которые приводят к этим результатам в РА. Фибробластоподобных синовиоциты (ФЛС) являются основным компонентом клетки в гиперплазированном синовии. ФЛС в суставе беспредельно размножаться, в конечном счете, вторжение в соседний cartilвозраст и кости. В настоящее время гиперпластический синовиальной можно удалить только с помощью хирургической процедуры. Удаленный синовиальной используется для исследований RA в качестве материала, который отражает воспалительное состояние сустава. В качестве основного игрока в патогенезе ревматоидного артрита, ФЛС может быть использован в качестве материала для создания и исследовать ИПСК пациентов с РА. В данном исследовании мы использовали FLSS пациента RA для создания иПСК. Использование лентивирусов системы, мы обнаружили, что ФЛС может генерировать RA конкретного пациента IPSC. В иПСК, полученные от ФЛС можно дополнительно использовать в качестве инструмента для изучения патофизиологии РА в будущем.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Плюрипотентные стволовые клетки платформа следующего поколения в различных клинических и биологических полей. Они являются многообещающим инструментом, который может быть использован при моделировании заболеваний, скрининга лекарственных средств и регенеративной медицинской терапии. Эмбриональные стволовые клетки человека (ЭСК) в основном были использованы для изучения и понимания плюрипотентных клеток. Тем не менее, изолированных разрушением человеческой бластоцисты, ЭСК связаны с несколькими этическими проблемами. В 2007 году доктор Яманака и его команда вспять процесс программирования клеток и разработал стволовые клетки из человеческой взрослых соматических клето....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Заявление по этике: Этот протокол исследования был одобрен этическими комитетами католического университета Кореи (KC12TISI0861).

1. синовиоцитов Выделение и расширения

  1. синовиоцитов Изоляция
    1. Стерилизация две пары хирургических ножниц и одну пару щипцов.
    2. Передача синовиальной ткани на 100 мм чашку и промывают 5 мл фосфатно-солевым буферным раствором (PBS), содержащем 1% пенициллина / стрептомицина.
    3. Отрезанные желтоватые жировую ткань и кости остатки. Передача обрезанную ткани на лунку 6-луночного планшета и добавляют 5 мл среды Игла в модификации Игла (DMEM) с 20% фетальной телячьей сыворотки (FBS).
    4. Нарезать тк....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данном исследовании мы опишем протокол для генерации иПСК из ФЛС с использованием лентивирусов системы. На рисунке 1А показана простая схема протокола изоляции FLS. После хирургического удаления синовиальной оболочки, ткань разрезали на маленькие кусочки с помощью хирургических ножниц. Коллагеназы был добавлен, чтобы изолировать клетки от комков ткани. Клетки инкубировали в течение 14 дней перед дальнейшей обработкой. На фиг.1В показан.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

До открытия ИПСК, ученые в основном использовали эмбриональные для изучения биологии стволовых клеток и других клеточных клонов путем дифференциации. Тем не менее, стволовые клетки происходят из внутренней массы бластоцисты, которая является ранней стадии эмбриона. Для выделения ЭСК, разрушение бластоцисты является неизбежным, повышение этических вопросов, которые невозможно преодолеть. Кроме того, хотя ЭСК имеют стволовости характеристики и плюрипотентности, они не могут быть получены от физических лиц и иногда не явля.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Исследовательской программой, финансируемой Корейскими центрами по контролю и профилактике заболеваний (HI13D2188).

....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Чашка 100 ммTPP93100
6-луночная пластинаTPP92006
50 мл Кузнечная трубкаSPL50050
15 мл Корническая трубкаSPL50015
10 мл Одноразовая пипеткаFalcon7551
мл Одноразовая пипеткаFalcon7543
12-луночная пластинаTPP92012
FLS Изоляционные материалы
хирургические ножницы
Хирургический щипец
DPBSLife Technologies14190-144
DMEMLife Technologies11995-073
Пеницилин стрептомицинSigma AldrichP4333
Фетальная бычья сыворотка (FBS)Life Technologies16000-044
КоллагеназаSigma AldrichC6885-100MG
ПарапленкаSigma Aldrich54956
PBS/1 mM EDTALife Technologies12604-039
iPSC Generation Материалы
DMEMLife Technologies11885
MEM Раствор заменимых аминокислот (100x)Life Technologies11140-050
β-меркаптоэтанолSigma AldrichM3148
ПолибренChemiconTR-1003-G
Пеницилин СтрептомицинLife TechnologiesP4333
Фетальная бычья сыворотка (FBS)Life Technologies16000-044
DPBSLife Technologies14190-144
Лентивирус
DMEM/F12, HEPESLife Technologies11330-057iPSC медиа ингредиент (500 мл)
Бикарбонат натрияLife Technologies25080-094iPSC медиа ингредиент (Conc.: 543 μ г/мл)
Селенит натрияSigma AldrichS5261iPSC медиа ингредиент  (Конц.: 14 нг/мл)
Вещественный ингредиент человеческого трансфферинаSigma AldrichT3705iPSC (Conc.: 10,7 μ г/мл)
Базовый ингредиент среды FGF2Peprotech100-18BiPSC  (Конц.: 100 нг/мл)
Human InsulinLife Technologies12585-014iPSC медиа ингредиент (Conc.: 20 μ г/мл)
Человеческий TGF&бета; 1Ингредиент среды Peprotech100-21iPSC (Конц.: 2 нг/мл)
Ингредиент среды AscorbicAcid Sigma AldrichA8960iPSC  (Конц.: 64 μ г/мл)
ПолибренChemiconTR-1003
Бутират натрияSigma AldrichB5887
ВитронектинLife TechnologiesA14700
ROCK Ингибитор SigmaAldrichY0503
Guality Control Материалы
18 мм Защитное стеклоSuperiorHSU-0111580
4% параформальдигид (PFA)Технологии и ИнновацияBPP-9004
Triton X-100BIOSESANG9002-93-1
Бычья сыворотка альбумин (BSA)Vector LabSP-5050
Anti-SSEA4 АнтителоMilliporeMAB4304
Anti-Oct4 АнтителоSanta CruzSC9081
Anti-TRA-1-60 АнтителоMilliporeMAB4360
Anti-Sox2 АнтителоBiolegend630801
Anti-TRA-1-81 АнтителоMilliporeMAB4381
Anti-Klf4 АнтителоAbcamab151733
Alexa Fluor 488 козье антитело против мыши IgG (H+L)Молекулярный зондA11029
Alexa Fluor 594 козье антитело против кролика IgG (H+L)Молекулярный зондA11037
DAPIMolecular ProbeD1306
Prolong gold antifade reagentInvitrogenP36934
Slide Glass, покрытыйHyun Il Lab-MateHMA-S9914
ТризолInvitrogen15596-018
ХлороформSigma Aldrich366919
изоприпилспиртMillipore109634
ЭтанолDuksan64-17-5
RevertAid First Strand набор для синтеза кДНКThermo ScientficK1622
i-Taq ДНК-полимеразаiNtRON BIOTECH25021
UltraPure 10x TBE BufferLife Technologies15581-044
загрузка звездыDyne BioA750
AgaroseSigma-Aldrich9012-36-6
1 kb (+) ДНК-маркер лестницыEnzynomicsDM003
Щелочная фосфатазаMilliporeSCR004
5

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
  2. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи