Method Article

Скрининг для функционального Некодирующих генетических вариантов Использование электрофоретической подвижности Сдвиг анализа (EMSA) и ДНК-сродства осадков Анализ (DAPA)

DOI:

10.3791/54093

⸱

August 21st, 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Autoimmune Genomics and Etiology, Cincinnati Children's Hospital, 2Medical Scientist Training Program, University of Cincinnati, 3Immunology Graduate Program, University of Cincinnati, 4Divisions of Biomedical Informatics and Developmental Biology, Cincinnati Children's Hospital

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы представляем стратегический план и протокол для выявления некодирующих генетических вариантов, влияющих на связывание ДНК с фактором транскрипции (TF). Представлен подробный экспериментальный протокол для анализа электрофоретического сдвига подвижности (EMSA) и анализа аффинного осаждения ДНК (DAPA) генотип-зависимого связывания TF DNA.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Популяционные и семейные генетические исследования обычно приводят к выявлению генетических вариантов, которые статистически связаны с клиническим заболеванием или фенотипом. Для многих заболеваний и признаков большинство вариантов не кодируются и, таким образом, могут действовать, воздействуя на тонкие, сравнительно трудно предсказуемые механизмы, контролирующие экспрессию генов. В этой статье мы опишем общий стратегический подход к приоритизации вариантов, не являющихся кодирующими, и их проверке на предмет их функции. Этот подход включает в себя вычислительную приоритизацию с использованием функциональных геномных баз данных с последующим экспериментальным анализом дифференциального связывания транскрипционных факторов (ТФ) с аллелями риска и без риска. Для анализа как электрофоретического сдвига подвижности (EMSA), так и анализа аффинного преципитации ДНК (DAPA) генетических вариантов используется синтетический ДНК-олигонуклеотид (олигонуклеотид) для идентификации факторов в ядерном лизате клеток заболевания или фенотипа. Для EMSA олигонуклеотиды со связанными ядерными факторами (часто TF) или без них анализируются с помощью неденатурирующего электрофореза на полиакриламидном геле трис-борат-ЭДТА (TBE). Для DAPA олигонуклеотиды связываются с магнитной колонкой, а ядерные факторы, которые специфически связывают последовательность ДНК, элюируются и анализируются с помощью масс-спектрометрии или с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с восстанавливающим додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) с последующим вестерн-блоттингом. Этот общий подход может быть широко использован для изучения функции некодирующих генетических вариантов, связанных с любым заболеванием, признаком или фенотипом.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Секвенирования и генотипирования на основе исследований, включая геномные исследования ассоциации (GWAS), кандидат исследований локуса, и глубокие секвенирования исследования, выявили множество генетических вариантов, которые статистически связаны с заболеванием, признаком, или фенотипа. Вопреки ранних предсказаний, большинство из этих вариантов (85-93%) расположены в некодирующих областей и не изменяют аминокислотную последовательность белков 1,2. Интерпретируя функции этих некодирующих вариантов и определения биологических механизмов , связывающих их с сопутствующей болезни, признак или фенотип оказался непростым 3-6. Мы разработали общую стратегию для выявления молекулярных механизмов, связывающих варианты к важному промежуточного фенотипа - экспрессии генов. Этот трубопровод разработан специально для идентификации модуляции TF связывания генетических вариантов. Эта стратегия сочетает в себе вычислительные подходы и методы молекулярной биологии, направленных предсказатьбиологические эффекты вариантов кандидатов в силикомарганца, и проверить эти предсказания эмпирически (рисунок 1).

figure-introduction-1
Рисунок 1:.. Стратегический подход для анализа некодирующих генетические варианты шагов, которые не включены в подробный протокол , связанный с этой рукописи заштрихованы серым цветом Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Во многих случаях, важно, чтобы начать путем расширения списка вариантов, чтобы включить все те, в высокой рычажной-неравновесия (LD) с каждым статистически связанным вариантом. ЛД является мерой неслучайной ассоциации аллелей двух различных хромосомных положениях, которые могут быть измерены с помощью R 2 статистики 7. R 2 представляет собой меру линКейдж неравновесие между двумя вариантами, с R 2 = 1 , обозначающее совершенной связи между двумя вариантами. Аллели в высокой LD оказываются совместно разделять на хромосоме через родовые популяции. Современные генотипирования массивы не включают в себя все известные варианты в геноме человека. Вместо этого они используют ЛД внутри генома человека и включают в себя подмножество известных вариантов , которые действуют в качестве прокси для других вариантов в пределах определенной области LD 8. Таким образом, вариант без какого-либо биологического последствие может быть связан с конкретным заболеванием, потому что это в LD с причинным вариантом: вариант с значимого биологического эффекта. С процедурной точки зрения рекомендуется преобразовать последний выпуск 1000 геномов проекта 9 файлов вариант вызова (VCF) в двоичные файлы , совместимые с Plink 10,11, инструмент с открытым исходным кодом для анализа всего генома ассоциации. Впоследствии все другие генетические варианты с LD г 2> 0,8 с каждым входом генетической ваRiant могут быть идентифицированы в качестве кандидатов. Важно использовать соответствующий ссылочный населения для этого , например , Step - , если вариант был выявлен у пациентов европейского происхождения, данные от субъектов аналогичного происхождения должны быть использованы для расширения LD.

Расширение LD часто приводит десятки вариантов кандидатов, и вполне вероятно, что лишь небольшая часть из них внести свой вклад в механизм заболевания. Часто, это неосуществимо экспериментально исследовать каждый из этих вариантов по отдельности. Поэтому полезно использовать тысячи доступных функциональных публично геномных наборов данных в качестве фильтра для определения приоритетности вариантов. Например, КОДИРОВАНИЯ консорциум 12 выполнил тысячи чиповых-сл экспериментов , описывающих связывание ТФ и сопутствующих факторов и гистонов марок в широком диапазоне контекстов, наряду с данными хроматина доступности от технологий , таких как ДНКазы сл 13, ATAC -seq 14 и FAIRE-15 сл. Databтузы и веб - серверы , такие как браузера УСК генома 16, Дорожная карта Epigenomics 17 Blueprint эпигеном 18, Cistrome 19 и ReMap 20 обеспечивают свободный доступ к данным , полученных с помощью этих и других экспериментальных методов в широком диапазоне типов и условий клеток. Когда есть слишком много вариантов, чтобы проверить экспериментально, эти данные могут быть использованы для приоритеты тех, которые находятся в пределах возможных регуляторных областей в соответствующих тканей и клеток типов. Кроме того, в тех случаях, когда вариант в микросхеме-сл пика для специфического белка, эти данные могут обеспечить потенциальных клиентов, как к специфическому TF (ами) или кофакторов, связывание может затрагивающий.

Далее, полученные по приоритетам варианты экспериментально скринингу для проверки связывания с использованием EMSA 21,22 предсказанную генотип-зависимого белка. EMSA измеряет изменение миграции олиго на невосстановительной геле КЭ. Флуоресцентно меченных олиго инкубируют сядерный лизат, и связывание ядерных факторов замедлит движение олиго на геле. Таким образом, олиго-, который связан больше ядерных факторов представит в качестве более сильного флуоресцентного сигнала при сканировании. Следует отметить, что EMSA не требует предсказания о специфических белков, связывание будут затронуты.

После того, как варианты идентифицируются, которые расположены в пределах прогнозируемых регуляторных областей и способны дифференцированно связывания ядерных факторов, вычислительные методы используются для прогнозирования конкретный TF (ы), связывание которого они могут повлиять. Мы предпочитаем использовать CIS-BP 23,24, RegulomeDB 25, UNIProbe 26 и 27 Джаспер. После того, как кандидат ТФ определены, эти прогнозы могут быть специально протестированы с использованием антител против этих ТФ (EMSA-supershifts и Dapa-вестерны). EMSA-supershift включает добавление антитела к TF специфичные к ядерной лизата и олиго. Положительный результат в EMSA-supershift является магнезииesented как дальнейший сдвиг в полосе EMSA или потери полосы (обзор в ссылке 28). В дополнительном Dapa, 5'-биотинилированные олиго дуплекс, содержащий вариант и 20 пар оснований нуклеотидов фланговый инкубируют с ядерными лизата из соответствующего типа (ов) клеток, чтобы захватить любые ядерные факторы, специфически связывающих олигонуклеотидов. Фактор-комплекс олиго дуплексной ядерная скованной стрептавидином микрогранулы в магнитном колонке. Связанные ядерные факторы собираются непосредственно через элюирования 29,48. Связующие предсказания затем могут быть оценены с помощью Вестерн-блоттинга с использованием антител, специфичных к белку. В тех случаях, когда нет никаких очевидных предсказаний, или слишком много прогнозов, то элюции из вариантов отжимания экспериментов Dapa могут быть отправлены в активную зону протеомики для выявления кандидатов ТФ с использованием масс-спектрометрии, которые впоследствии могут быть проверены с помощью этих ранее описанных методы.

В оставшейся части статьи обе, подробный протокол для EMSA и Dapa анализа генетических вариантов предусмотрена.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Приготовление растворов и реагентов

  1. Заказывайте индивидуальные ДНК-олигонуклеотидные зонды для использования в EMSA и DAPA.
    1. Чтобы уменьшить неспецифическое связывание с белками, сконструируйте короткие олигонукосы (между 35-45 парами оснований (.о.) в длину)30 и поместите интересующий вариант непосредственно в центр, окруженный его эндогенной последовательностью 17.н. Для олигонофузоров EMSA добавьте 5' флуорофор. Для олигопластов DAPA добавьте 5' метку биотина.
    2. Упорядочьте как смысловую цепь, так и ее обратную цепь. В качестве альтернативы можно заказать дуплексные (предварительно отожженные) олиго. При названии олигон основывайте номенклатуру на установленном референсном геноме.
      Примечание: Обозначения «риск» и «нериск» могут быть специфичными для болезни и проекта, в то время как «референтные» и «нереферентные» более универсальны.
    3. По прибытии олигонотидов кратковременно раскрутите содержимое и ресуспендируйте в безнуклеазной воде до конечной концентрации 100 μМ. Храните ресуспендированный исходный материал при температуре -20 °C. Защитите олигоноса, помеченные флуорофором, от света, обернув его алюминиевой фольгой.
имяпоследовательность
rs76562819_REF_FORGTAATGCCTTAATGAGAGAGAGTTAGTCATCTTCTCACTTC
rs76562819_REF_REVGAAGTGAGAAGATGACTAACTCTCTCTCATTAAGGCATTAC
rs76562819_NONREF_FORGTAATGCCTTAATGAGAGAGGGTTAGTCATCTTCTCACTTC
rs76562819_NONREF_REVGAAGTGAGAAGATGACTAACCCTCTCTCATTAAGGCATTAC

Таблица 1: Пример конструкции олигонуклеотида EMSA/DAPA для тестирования SNP на дифференциальное связывание. "REF" обозначает референсный аллель, в то время как "NONREF" обозначает нереференсный аллель. «FOR» обозначает переднюю цепь, в то время как «REV» указывает на ее дополнение. SNP выделен красным цветом.

  1. Приготовьте буфер для цитоплазматической экстракции (КЭ) с конечной концентрацией 10 мМ HEPES (pH 7,9), 10 mM KCl и 0,1 mM EDTA в деионизированной воде.
  2. Приготовьте буфер для ядерной экстракции (NE) с конечной концентрацией 20 мМ HEPES (pH 7,9), 0,4 M NaCl и 1 mM EDTA в деионизированной воде.
  3. В деионизированной воде готовят буфер для отжига с конечной концентрацией 10 мМ Трис (pH 7,5-8,0), 50 мМ NaCl и 1 мМ ЭДТА.

2. Получение ядерного лизата из культивируемых клеток

Примечание: Этот экспериментальный протокол был оптимизирован с использованием В-лимфобластоидных клеточных линий, но был протестирован на нескольких других неродственных клеточных линиях адгезивных/суспензионных клеток и работает универсально.

  1. Культивирование В-лимфобластоидных клеток в Мемориальном институте Розуэлл Парк (RPMI) 1640 с 2 мМ L-глутамина, 10% фетальной бычьей сыворотки и 1x антибиотиком-антимикотиком, содержащим 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 250 нг/мл амфотерицина В.
    1. Высевайте в диапазоне 200 000-500 000 жизнеспособных клеток/мл и инкубируйте колбы при температуре 37 °C с 5% углекислым газом в вертикальном положении с вентилируемыми или незакрепленными крышками.
      Примечание: Рост В-лимфобластоидных клеток замедляется, когда они достигают более 1 000 000 клеток/мл. Разбивайте клеточные бласты путем пипетирования вверх и вниз несколько раз и возвращайте клетки к 200 000-500 000 клеток/мл для поддержания быстрого темпа роста.
  2. Дважды промойте культивируемые клетки 10 мл ледяного фосфатного буферного раствора (PBS), уменьшите до 4 °C, 300 x g в течение 5 минут и удалите PBS с помощью аспирации.
  3. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра и ресуспендируйте гранулы в виде 1 мл ледяного PBS на 107 клеток.
    Примечание: Например, при лизисе 2 x 107 клеток, ресуспендируйте в 2 мл PBS.
  4. Аликвотируйте от 1 мл до 1,5 мл микроцентрифужных пробирок так, чтобы каждая пробирка содержала 10-7 ячеек в PBS. Центрифугируйте при 3 300 x g в течение 2 мин 4 °C и отсасывайте PBS.
  5. Перед применением добавьте 1 мМ дитиотреитол (DTT), 1x ингибитор фосфатазы и 1x ингибитор протеазы в рабочую массу CE-буфера. Ресуспендируйте клеточную гранулу с 400 мкл буфера CE и инкубируйте на льду в течение 15 минут.
  6. Добавьте 25 μл 10% Nonidet P-40 и перемешайте с помощью пипетирования. Центрифуга при 4 °C, максимальная скорость в течение 3 мин. Сцедите и выбросьте надосадочную жидкость.
  7. Перед применением добавьте 1 мМ DTT, 1x ингибитор фосфатазы и 1x ингибитор протеазы в рабочий запас NE буфера. Суспензируйте клеточную гранулу с 30 мкл NE-буфера и перемешайте методом вортексирования.
  8. Инкубировать при 4 °C в вращателе пробирок или на льду в течение 10 мин. Центрифуга 3 300 x g в течение 2 мин 4 °C.
  9. Соберите прозрачную надосадочную жидкость (ядерный лизат) и аликвоту перед хранением при температуре -80 °C, чтобы избежать многократных циклов замораживания-оттаивания, которые могут привести к ухудшению белка. Оставьте аликвоту объемом 10 мкл для измерения концентрации белка с помощью анализа бихониловой кислоты (BCA)31.

3. Электрофоретический анализ сдвига подвижности (EMSA)

  1. Подготовьте олигорабочую массу и гель EMSA.
    1. Если олигону заказывают в дуплексном исполнении, разморозьте 100 мкМ заготовку и разбавьте 1:2 000 в буфере для отжига до получения 50 нМ рабочего состава.
    2. Если олигоны были заказаны как одноцепочечные, разморозьте 100 мкМ заготовки и разбавьте 1:10 в буфере для отжига до 100 нМ рабочих частей. Соедините 100 мкл 100 мкл 100 нМ цепочечного раствора друг с другом в микроцентрифужной пробирке.
      1. Поместите в нагревательный блок при температуре 95 °C на 5 минут. Выключите нагревательный блок и дайте олигону медленно остыть до комнатной температуры в течение как минимум одного часа перед использованием.
    3. Предварительно запустите гель EMSA.
      1. Снимите предметное стекло с предварительно отлитого 6% геля TBE и промойте под деионизированной водой несколько раз, чтобы удалить буфер из лунок. Приготовьте 1 л буфера 0,5x TBE, добавив 50 мл 10x TBE к 950 мл деионизированной воды.
      2. Соберите аппарат для гель-электрофореза и проверьте наличие утечек, заполнив внутреннюю камеру буфером 0,5x TBE. Если буфер не просачивается во внешнюю камеру, заполните внешнюю камеру примерно на две трети.
      3. Предварительно запустите гель при 100 В течение 60 минут.
      4. Промойте каждую лунку 200 μл 0,5x TBE буфера.
  2. Приготовьте мастер-микс для связывания буфера.
    1. Приготовьте 10-кратный связывающий буфер с конечной концентрацией 100 мМ Трис, 500 мМ KCl, 10 мМ DTT; pH 7,5 в деионизированной воде.
    2. В микроцентрифужной пробирке создать мастер-смесь, состоящую из реагентов, общих для всех реакций (10 мкл 10x связывающего буфера, 10 мкл DTT/полисорбата, 5 мкл Poly d(I-C) и 2,5 мкл ДНК спермы лосося; Таблица 2). Подготовьте дополнительные 10% для компенсации потери объема из-за пипетирования.
реагентФинальная кон.Rxn #1Rxn #2Rxn #3Rxn #4
Сверхчистая водадо 20 мкл об.13,5 мкл11,98 мкл13,5μл11,98 мкл
10x буфер привязки1x2 мкл2 мкл2 мкл2 мкл
ДТТ/ТВ-201x2 мкл2 мкл2 мкл2 мкл
ДНК спермы лосося500 нг/мкл0,5 мкл0,5 мкл0,5 мкл0,5 мкл
1μг/μл Poly d(I-C)1 μг1 μл1 μл1 μл1 μл
Ядерный экстракт (5,26 мкг/мкл)8 μг- T1,52 мкл- T1,52 мкл
Северо-восточный буфер1,52 мкл- T1,52 мкл- T
Референсный аллель oligo50 фмоль1 μл1 μл- T- T
Нереференсный аллель олиго50 фмоль- T- T1 μл1 μл

Таблица 2: Пример настройки реакции EMSA. В таблице приведен пример EMSA для проверки гипотезы о том, что существует генотип-зависимое связывание TFs с конкретным SNP.

  1. Добавьте в каждую микроцентрифужную пробирку воду, не содержащую нуклеаз, таким образом, чтобы конечный объем после добавления всех реагентов составил 20 мкл.
  2. Добавьте соответствующее количество (5,5 мкл) исходной смеси в каждую микроцентрифужную пробирку.
  3. Добавьте 8 г ядерного лизата в соответствующие микроцентрифужные пробирки. Включите пробирки, содержащие олиго без ядерного экстракта, в качестве отрицательного контроля (например, Таблица 2, Rxn #1 и Rxn #3).
    Примечание: Оптимальное количество лизата на реакцию должно быть определено экспериментально путем титрования. Как правило, достаточно титрования в диапазоне 2-10 мкг лизата.
  4. Добавьте 50 фмоль олиго в соответствующие микроцентрифужные пробирки. Щелкните, чтобы перемешать, и ненадолго открутите содержимое до дна пробирки. Инкубировать в течение 20 минут при комнатной температуре.
    Примечание: При попытке суперсдвига инкубируйте смесь лизата с антителами в течение 20 минут при комнатной температуре до добавления олигонухов. Для достижения наилучших результатов рекомендуется использовать 1 мкг антитела класса ChIP.
  5. Добавьте 2 мкл 10-кратного оранжевого загрузочного красителя в каждую микроцентрифужную пробирку. Пипеткой вверх и вниз перемешивайте.
  6. Загрузите образцы в предварительно прогонный гель с содержанием 6% клещевого энцефалита, пипетируя вверх и вниз для смешивания, а затем вытолкните каждый образец в отдельную лунку. Запускайте гель при напряжении 80 В, пока оранжевый краситель не пройдет от 2/3 до 3/4 пути вниз по гелю. Это должно занять примерно 60-75 минут.
  7. Извлеките гель из пластиковой кассеты, поддев ее гелевым ножом, и поместите гель в контейнер с буфером 0,5% TBE, чтобы предотвратить его высыхание.
  8. Поместите гель на поверхность инфракрасной и хемилюминесцентной системы визуализации, убедившись, что все пузырьки или загрязнения, которые могут нарушить изображение.
  9. Используя программное обеспечение системы сканирования, нажмите вкладку «Получить», а затем выберите «Нарисовать новый», чтобы нарисовать рамку вокруг области, соответствующей расположению геля на поверхности сканера.
  10. В разделе "Каналы" вкладки "Приобретение" выберите канал, соответствующий длине волны флуорофорной метки на олиго. В разделе «Сканер» нажмите «предварительный просмотр», чтобы получить некачественный предварительный просмотр скана. Отрегулируйте область сканирования, перетащив синюю рамку, окружающую полученное изображение предварительного просмотра, вниз к той части геля, которую необходимо изобразить.
    Примечание: Например, если вы используете олигонуоры с флуорофором 700 нм, перед сканированием убедитесь, что выбран канал «700 нм».
  11. В разделе «Элементы управления сканированием» выберите параметр разрешения «84 μM» и вариант качества «Средний». Установите фокус на смещение на половину толщины геля. Примечание: Например, гель толщиной 1 мм будет использовать смещение фокусировки на 0,5 мм.
  12. В разделе "Сканер" нажмите "Начать", чтобы начать сканирование.
    Примечание: Во время сканирования яркость, контрастность и цветовую схему часто можно настроить вручную в зависимости от производителя сканирующей системы.
  13. После завершения сканирования выберите вкладку «Изображение» и нажмите «Повернуть или отразить» в разделе «Создать» для коррекции ориентации. Сохраните файл изображения, нажав «Экспорт» в главном меню, а затем выберите «Просмотр одного изображения».

4. Анализ аффинной очистки ДНК (DAPA)

  1. Приготовление рабочего состава 5 мкМ олиго.
    1. Если олигону заказывают в дуплексном режиме, разморозьте 100 мкМ заготовку и разбавьте 1:20 в буфере для отжига до получения 5 мкМ рабочей массы.
    2. Если олигопласты заказывают одноцепочечные, разморозьте 100 μМ заготовки и разбавьте 1:10 в буфере для отжига до 10 μМ рабочих частей. Соедините 10 мкл комплементарных нитей 10 мкМ друг с другом. Поместите в нагревательный блок при температуре 95 °C на 5 минут. Перед использованием выключите нагревательный блок и дайте олигону медленно остыть до комнатной температуры.
  2. Перед началом нагрейте связующий буфер, буфер промывки низкой жесткости, буфер промывки высокой жесткости и буфер элюирования до комнатной температуры.
    Примечание: Конечная концентрация Poly d(I-C) в концентрации 50 нг/мл может быть добавлена в буфер для связывания, буфер для промывки с низкой жесткостью и буфер для промывки с высокой концентрацией для уменьшения потенциального неспецифического связывания белков с олигонухими
    3. .
  3. Приготовьте связующие смеси для каждого варианта.
    1. Смешайте 1 объем ядерного лизата с 2 объемами связующего буфера.
      Примечание: Необходимое количество лизата должно быть определено экспериментально из-за различной распространенности TF. В большинстве случаев достаточно использовать от 100 до 250 мкг ядерного лизата на колонку.
    2. Добавьте 1x ингибитор фосфатазы, 1x ингибитор протеазы и 1x усилитель связывания (по желанию) и перемешайте, несколько раз перевернув пробирку.
      Примечание: 100-кратный усилитель связывания состоит из 750 мМ MgCl2 и 300 мМ ZnCl2. Добавляйте усилитель связывания, если связывание ТФ с ДНК зависит от кофакторов или восстановителей. Если эта информация неизвестна, добавьте усилитель связывания.
    3. Добавьте 10 мкл 5 мкМ биотинилированной захватывающей ДНК (50 пмоль) в каждую соответствующую смесь связывания. Инкубировать в течение 20 минут при комнатной температуре.
      Примечание: Время инкубации и температура могут варьироваться в зависимости от ТФ. Оптимальные значения нужно определять экспериментальным путем.
  4. Добавьте 100 μл микрогранул стрептавидина. Выдерживать 10 минут при комнатной температуре.
  5. Для каждого испытуемого олигозонда поместите в магнитный сепаратор обвязочную колонку. Поместите микроцентрифужную пробирку непосредственно под каждую связующую колонну и нанесите 100 мкл связующего буфера для промывки колонки.
  6. Перед тем, как продолжить, издайте пипеткой содержимое каждой связующей смеси в отдельные колонки и дайте жидкости полностью протечь через колонку в микроцентрифужную трубку. Обязательно пометьте столбцы вариантом олиго, который использовался в связующей смеси. Проточные пробы промаркируйте и замените их новыми микроцентрифужными пробирками для сбора промывок с низкой жесткостью.
  7. Нанесите на колонку 100 μл промывочного буфера низкой жесткости; подождите, пока резервуар колонки опустеет. Повторите стирку 4 раза. Промаркируйте промывочные пробы с низкой прочностью и замените их новыми микроцентрифужными пробирками для сбора промывок высокой прочности.
  8. Нанесите на колонку 100 μл промывочного буфера высокой прочности; подождите, пока резервуар колонки опустеет. Повторите стирку 4 раза. Просмотрите пробы с высокой строгостью и замените их новыми микроцентрифужными пробирками для сбора предварительного элюирования.
  9. Добавьте в колонку 30 μл нативного элюирующего буфера и дайте постоять 5 мин. Пометьте образцы предварительного элюирования и замените их новыми микроцентрифужными пробирками для сбора элюирования.
    Примечание: Это не разбавляет связанный белок; Он вымывает оставшийся буфер высокой строгости из столбца и заменяет его буфером элюирования для максимизации эффективности элюирования.
  10. Добавьте дополнительный нативный буфер элюирования объемом 50 мкл для элюирования связанных TF. Для получения более высокого выхода, но менее концентрированного элюата добавьте еще 50 мкл нативного элюирующего буфера и соберите проточный раствор.
    Примечание: Проанализируйте образцы элюирования с помощью масс-спектрометрии для определения идентичности связанных TF32. После этого проверьте протеомные результаты с помощью электрофореза в полиакриламидном геле додецилсульфита натрия (SDS-PAGE) с последующим вестерн-блоттингом33. Если масс-спектрометрия недоступна, проведите окрашивание серебром, используя стандартную методику, вместо вестерн-блоттинга, чтобы определить размер белка (белков), демонстрирующих связывание, зависящее от генотипа. Используйте эту информацию, чтобы сузить список прогнозируемых TF на основе вычислительных подходов, описанных во введении.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом разделе представлены репрезентативные результаты того, чего ожидать при выполнении EMSA или DAPA, а также охарактеризована вариативность в отношении качества лизата. Например, было высказано предположение, что многократное замораживание и размораживание образцов белка может привести к денатурации. Для изучения воспроизводимости анализа EMSA в контексте этих циклов «замораживание-оттаивание» два олигопласта 35.н., отличающиеся одним генетическим вариантом, инкубировали с одной парти...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Несмотря на то, что достижения в области технологий секвенирования и генотипирования значительно расширили наши возможности по выявлению генетических вариантов, связанных с заболеванием, наша способность понимать функциональные механизмы, на которые влияют эти варианты, отстает. Основным источником проблемы является то, что многие варианты, связанные с заболеванием, расположены в n кодирующих областях генома, которые, вероятно, влияют на более трудно предсказуемые механизмы, контролирующие экспрессию генов. Здесь мы пред...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Эрин Золлер, Джессику Бене и Линдси Хейс за вклад и руководство в разработке протокола. MTW был частично поддержан NIH R21 HG008186 и грантом Trustee Award от Исследовательского фонда детской больницы Цинциннати. ZHP частично поддерживали T32 GM063483-13.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Пользовательские ДНК-олигонуклеотидыIntegrated DNA Technologieshttp://www.idtdna.com/site/order/oligoentry
хлорида калияFisher ScientificBP366-500KCl, для буфера CE
HEPES (1 M)Fisher Scientific15630-080Для CE и NE буфера
EDTA (0,5M), pH 8,0Life TechnologiesR1021для CE, NE и буфера для отжига
Хлорид натрияFisher ScientificBP358-1NaCl, для NE буфера
Tris-HCl (1M), pH 8,0InvitrogenBP1756-100Для отжига буфера
фосфата Buffered Salt (1x)Fisher ScientificMT21040CMPBS, для промывки клеток
DL-раствор дитиотреитола (1 M)Sigma646563восстановитель
Ингибитор протеазы КоктейльThermo Scientific87786предотвращает катаболизм коктейля ингибиторов фосфатазы TFs
 Thermo Scientific78420Предотвращает дефосфорилирование TFs
Nonidet P-40 SubstituteIBI ScientificIB01140NP-40, для ядерной экстракции
BCA Protein Assay KitThermo Scientific23225Для измерения концентрации белка
Odyssey EMSA Buffer KitLicor829-07910Содержит все необходимые EMSA
буферы TBE Gels, 6%, 12 лунокInvitrogenEC6265BOXдля буфера EMSA
TBE (10x)Thermo ScientificB52для EMSA
FactorFinder Стартовый комплектMiltenyi Biotec130-092-318Содержит все необходимые буферы DAPA
Licor Odyssey CLxLicorРекомендуемый сканер для DAPA/EMSA
Антибиотик-антимикотикGibco15240-062Содержит 10 000 единиц/мл пенициллина, 10 000 микро; г/мл стрептомицина, и 25 &микро; г/мл Фунгизона® Антимикотическая
фетальная бычья сывороткаGibco26140-079FBS, для питательных сред
RPMI 1640 MediumGibco22400-071Содержит L-глутамин и 25 мМ ГЕПЕС

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hindorff, L. A., et al. Potential etiologic and functional implications of genome-wide association loci for human diseases and traits. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (23), 9362-9367 (2009).
  2. Maurano, M. T., et al. Systematic localization of common disease-associated variation in regulatory DNA. Science. 337 (6099), 1190-1195 (2012).
  3. Ward, L. D., Kellis, M. Interpreting noncoding genetic variation in complex traits and human disease. Nat Biotechnol. 30 (11), 1095-1106 (2012).
  4. Paul, D. S., Soranzo, N., Beck, S. Functional interpretation of non-coding sequence variation: concepts and challenges. Bioessays. 36 (2), 191-199 (2014).
  5. Zhang, F., Lupski, J. R. Non-coding genetic variants in human disease. Hum Mol Genet. , (2015).
  6. Lee, T. I., Young, R. A. Transcriptional regulation and its misregulation in disease. Cell. 152 (6), 1237-1251 (2013).
  7. Slatkin, M. Linkage disequilibrium--understanding the evolutionary past and mapping the medical future. Nat Rev Genet. 9 (6), 477-485 (2008).
  8. Bush, W. S., Moore, J. H. Chapter 11: Genome-wide association studies. PLoS Comput Biol. 8 (12), e1002822(2012).
  9. 1000 Genomes Project Consortium. An integrated map of genetic variation from 1,092 human genomes. Nature. 491 (7422), 56-65 (2012).
  10. Chang, C. C., et al. Second-generation PLINK: rising to the challenge of larger and richer datasets. Gigascience. 4, 7(2015).
  11. Purcell, S., et al. PLINK: a tool set for whole-genome association and population-based linkage analyses. Am J Hum Genet. 81 (3), 559-575 (2007).
  12. ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  13. Crawford, G. E., et al. Genome-wide mapping of DNase hypersensitive sites using massively parallel signature sequencing (MPSS). Genome Res. 16 (1), 123-131 (2006).
  14. Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nat Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
  15. Giresi, P. G., Kim, J., McDaniell, R. M., Iyer, V. R., Lieb, J. D. FAIRE Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) isolates active regulatory elements from human chromatin. Genome Res. 17 (6), 877-885 (2007).
  16. Kent, W. J., et al. The human genome browser at UCSC. Genome Res. 12 (6), 996-1006 (2002).
  17. Roadmap Epigenomics Consortium. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).
  18. Martens, J. H., Stunnenberg, H. G. BLUEPRINT: mapping human blood cell epigenomes. Haematologica. 98 (10), 1487-1489 (2013).
  19. Liu, T., et al. Cistrome: an integrative platform for transcriptional regulation studies. Genome Biol. 12 (8), R83(2011).
  20. Griffon, A., et al. Integrative analysis of public ChIP-seq experiments reveals a complex multi-cell regulatory landscape. Nucleic Acids Res. 43 (4), e27(2015).
  21. Staudt, L. M., et al. A lymphoid-specific protein binding to the octamer motif of immunoglobulin genes. Nature. 323 (6089), 640-643 (1986).
  22. Singh, H., Sen, R., Baltimore, D., Sharp, P. A. A nuclear factor that binds to a conserved sequence motif in transcriptional control elements of immunoglobulin genes. Nature. 319 (6049), 154-158 (1986).
  23. Weirauch, M. T., et al. Determination and inference of eukaryotic transcription factor sequence specificity. Cell. 158 (6), 1431-1443 (2014).
  24. Ward, L. D., Kellis, M. HaploReg: a resource for exploring chromatin states, conservation, and regulatory motif alterations within sets of genetically linked variants. Nucleic Acids Res. 40 (Database issue), D930-D934 (2012).
  25. Boyle, A. P., et al. Annotation of functional variation in personal genomes using RegulomeDB. Genome Res. 22 (9), 1790-1797 (2012).
  26. Hume, M. A., Barrera, L. A., Gisselbrecht, S. S., Bulyk, M. L. UniPROBE, update 2015: new tools and content for the online database of protein-binding microarray data on protein-DNA interactions. Nucleic Acids Res. 43 (Database issue), D117-D122 (2015).
  27. Mathelier, A., et al. JASPAR 2014: an extensively expanded and updated open-access database of transcription factor binding profiles. Nucleic Acids Res. 42 (Database issue), 142-147 (2014).
  28. Smith, M. F. Jr, Delbary-Gossart, S. Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA). Methods Mol Med. 50, 249-257 (2001).
  29. Franza, B. R., Josephs, S. F., Gilman, M. Z., Ryan, W., Clarkson, B. Characterization of cellular proteins recognizing the HIV enhancer using a microscale DNA-affinity precipitation assay. Nature. 330 (6146), 391-395 (1987).
  30. LI-COR. Odyssey Infrared EMSA Kit: Instruction Manual. , Available from: http://www.licor.com/bio/pack_inserts/?pi=829-07910 (2014).
  31. Thermo Fisher Scientific, Inc. BCA Protein Assay Kit: User Guide. , Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0011430_Pierce_BCA_Protein_Asy_UG.pdf (2014).
  32. Wijeratne, A. B., et al. Phosphopeptide separation using radially aligned titania nanotubes on titanium wire. ACS Appl Mater Interfaces. 7 (21), 11155-11164 (2015).
  33. Silva, J. M., McMahon, M. The Fastest Western in Town: A Contemporary Twist on the Classic Western Blot Analysis. J. Vis. Exp. (84), (2014).
  34. Lu, X., et al. Lupus Risk Variant Increases pSTAT1 Binding and Decreases ETS1 Expression. Am J Hum Genet. 96 (5), 731-739 (2015).
  35. Ramana, C. V., Chatterjee-Kishore, M., Nguyen, H., Stark, G. R. Complex roles of Stat1 in regulating gene expression. Oncogene. 19 (21), 2619-2627 (2000).
  36. Fillebeen, C., Wilkinson, N., Pantopoulos, K. Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) for the Study of RNA-Protein Interactions: The IRE/IRP Example. J. Vis. Exp. (94), e52230(2014).
  37. Heng, T. S., Painter, M. W. Immunological Genome Project, C. The Immunological Genome Project: networks of gene expression in immune cells. Nat Immunol. 9 (10), 1091-1094 (2008).
  38. Wu, C., et al. BioGPS: an extensible and customizable portal for querying and organizing gene annotation resources. Genome Biol. 10 (11), R130(2009).
  39. Wu, C., Macleod, I., Su, A. I. BioGPS and MyGene.info: organizing online, gene-centric information. Nucleic Acids Res. 41 (Database issue), D561-D565 (2013).
  40. Wang, J., et al. Sequence features and chromatin structure around the genomic regions bound by 119 human transcription factors. Genome Res. 22 (9), 1798-1812 (2012).
  41. Holden, N. S., Tacon, C. E. Principles and problems of the electrophoretic mobility shift assay. J Pharmacol Toxicol Methods. 63 (1), 7-14 (2011).
  42. Miltenyi Biotec, Inc. µMACS FactorFinder Kit: Data sheet. , Available from: http://www.miltenyibiotec.com/en/products-and-services/macsmolecular/protein-research/biotinylated-molecule-isolation/macs-factorfinder-kit.aspx (2014).
  43. Xu, J., Liu, H., Park, J. S., Lan, Y., Jiang, R. Osr1 acts downstream of and interacts synergistically with Six2 to maintain nephron progenitor cells during kidney organogenesis. Development. 141 (7), 1442-1452 (2014).
  44. Yang, T. -P., et al. Genevar: a database and Java application for the analysis and visualization of SNP-gene associations in eQTL studies. Bioinformatics. 26 (19), 2474-2476 (2010).
  45. Fort, A., et al. A liver enhancer in the fibrinogen gene cluster. Blood. 117 (1), 276-282 (2011).
  46. Solberg, N., Krauss, S. Luciferase assay to study the activity of a cloned promoter DNA fragment. Methods Mol Biol. 977, 65-78 (2013).
  47. Rahman, M., et al. A repressor element in the 5'-untranslated region of human Pax5 exon 1A. Gene. 263 (1-2), 59-66 (2001).
  48. Mali, P., et al. RNA-Guided Human Genome Engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Non coding Genetic VariantsElectrophoretic Mobility Shift AssayDNA Affinity Precipitation AssayTranscription Factor BindingNuclear Lysate PreparationOligonucleotide Probe DesignEMSA Gel ElectrophoresisDAPA Streptavidin BeadsWestern Blot AnalysisAllele Specific Binding

Related Articles