Method Article

Скрининг для функционального Некодирующих генетических вариантов Использование электрофоретической подвижности Сдвиг анализа (EMSA) и ДНК-сродства осадков Анализ (DAPA)

DOI:

10.3791/54093

⸱

August 21st, 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Autoimmune Genomics and Etiology, Cincinnati Children's Hospital, 2Medical Scientist Training Program, University of Cincinnati, 3Immunology Graduate Program, University of Cincinnati, 4Divisions of Biomedical Informatics and Developmental Biology, Cincinnati Children's Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы представляем стратегический план и протокол для выявления некодирующих генетических вариантов, влияющих на связывание ДНК с фактором транскрипции (TF). Представлен подробный экспериментальный протокол для анализа электрофоретического сдвига подвижности (EMSA) и анализа аффинного осаждения ДНК (DAPA) генотип-зависимого связывания TF DNA.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Популяционные и семейные генетические исследования обычно приводят к выявлению генетических вариантов, которые статистически связаны с клиническим заболеванием или фенотипом. Для многих заболеваний и признаков большинство вариантов не кодируются и, таким образом, могут действовать, воздействуя на тонкие, сравнительно трудно предсказуемые механизмы, контролирующие экспрессию генов. В этой статье мы опишем общий стратегический подход к приоритизации вариантов, не являющихся кодирующими, и их проверке на предмет их функции. Этот подход включает в себя вычислительную приоритизацию с использованием функциональных геномных баз данных с последующим экспериментальным анализом дифференциального связывания транскрипционных факторов (ТФ) с аллелями риска и без риска. Для анализа как электрофоретического сдвига подвижности (EMSA), так и анализа аффинного преципитации ДНК (DAPA) генетических вариантов используется синтетический ДНК-олигонуклеотид (олигонуклеотид) для идентификации факторов в ядерном лизате клеток заболевания или фенотипа. Для EMSA олигонуклеотиды со связанными ядерными факторами (часто TF) или без них анализируются с помощью неденатурирующего электрофореза на полиакриламидном геле трис-борат-ЭДТА (TBE). Для DAPA олигонуклеотиды связываются с магнитной колонкой, а ядерные факторы, которые специфически связывают последовательность ДНК, элюируются и анализируются с помощью масс-спектрометрии или с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с восстанавливающим додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) с последующим вестерн-блоттингом. Этот общий подход может быть широко использован для изучения функции некодирующих генетических вариантов, связанных с любым заболеванием, признаком или фенотипом.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Секвенирования и генотипирования на основе исследований, включая геномные исследования ассоциации (GWAS), кандидат исследований локуса, и глубокие секвенирования исследования, выявили множество генетических вариантов, которые статистически связаны с заболеванием, признаком, или фенотипа. Вопреки ранних предсказаний, большинство из этих вариантов (85-93%) расположены в некодирующих областей и не изменяют аминокислотную последовательность белков 1,2. Интерпретируя функции этих некодирующих вариантов и определения биологических механизмов , связывающих их с сопутствующей болезни, признак или фенотип оказался непростым 3-6. Мы разработали общую стра....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Приготовление растворов и реагентов

  1. Заказывайте индивидуальные ДНК-олигонуклеотидные зонды для использования в EMSA и DAPA.
    1. Чтобы уменьшить неспецифическое связывание с белками, сконструируйте короткие олигонукосы (между 35-45 парами оснований (.о.) в длину)30 и поместите интересующий вариант непосредственно в центр, окруженный его эндогенной последовательностью 17.н. Для олигонофузоров EMSA добавьте 5' флуорофор. Для олигопластов DAPA добавьте 5' метку биотина.
    2. Упорядочьте как смысловую цепь, так и ее обратную цепь. В качестве альтернативы можно заказать дуплексные (предварительно отожженные) олиго. При названии олигон....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом разделе представлены репрезентативные результаты того, чего ожидать при выполнении EMSA или DAPA, а также охарактеризована вариативность в отношении качества лизата. Например, было высказано предположение, что многократное замораживание и размораживание образцов белка может привести к денатурации. Для изучения воспроизводимости анализа EMSA в контексте этих циклов «замораживание-оттаивание» два олигопласта 35.н., отличающиеся одним генетическим вариантом, инкубировали с одной парти.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Несмотря на то, что достижения в области технологий секвенирования и генотипирования значительно расширили наши возможности по выявлению генетических вариантов, связанных с заболеванием, наша способность понимать функциональные механизмы, на которые влияют эти варианты, отстает. Основным источником проблемы является то, что многие варианты, связанные с заболеванием, расположены в n кодирующих областях генома, которые, вероятно, влияют на более трудно предсказуемые механизмы, контролирующие экспрессию генов. Здесь мы пред.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Эрин Золлер, Джессику Бене и Линдси Хейс за вклад и руководство в разработке протокола. MTW был частично поддержан NIH R21 HG008186 и грантом Trustee Award от Исследовательского фонда детской больницы Цинциннати. ZHP частично поддерживали T32 GM063483-13.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Пользовательские ДНК-олигонуклеотидыIntegrated DNA Technologieshttp://www.idtdna.com/site/order/oligoentry
хлорида калияFisher ScientificBP366-500KCl, для буфера CE
HEPES (1 M)Fisher Scientific15630-080Для CE и NE буфера
EDTA (0,5M), pH 8,0Life TechnologiesR1021для CE, NE и буфера для отжига
Хлорид натрияFisher ScientificBP358-1NaCl, для NE буфера
Tris-HCl (1M), pH 8,0InvitrogenBP1756-100Для отжига буфера
фосфата Buffered Salt (1x)Fisher ScientificMT21040CMPBS, для промывки клеток
DL-раствор дитиотреитола (1 M)Sigma646563восстановитель
Ингибитор протеазы КоктейльThermo Scientific87786предотвращает катаболизм коктейля ингибиторов фосфатазы TFs
 Thermo Scientific78420Предотвращает дефосфорилирование TFs
Nonidet P-40 SubstituteIBI ScientificIB01140NP-40, для ядерной экстракции
BCA Protein Assay KitThermo Scientific23225Для измерения концентрации белка
Odyssey EMSA Buffer KitLicor829-07910Содержит все необходимые EMSA
буферы TBE Gels, 6%, 12 лунокInvitrogenEC6265BOXдля буфера EMSA
TBE (10x)Thermo ScientificB52для EMSA
FactorFinder Стартовый комплектMiltenyi Biotec130-092-318Содержит все необходимые буферы DAPA
Licor Odyssey CLxLicorРекомендуемый сканер для DAPA/EMSA
Антибиотик-антимикотикGibco15240-062Содержит 10 000 единиц/мл пенициллина, 10 000 микро; г/мл стрептомицина, и 25 &микро; г/мл Фунгизона® Антимикотическая
фетальная бычья сывороткаGibco26140-079FBS, для питательных сред
RPMI 1640 MediumGibco22400-071Содержит L-глутамин и 25 мМ ГЕПЕС

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hindorff, L. A., et al. Potential etiologic and functional implications of genome-wide association loci for human diseases and traits. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (23), 9362-9367 (2009).
  2. Maurano, M. T., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Non coding Genetic VariantsElectrophoretic Mobility Shift AssayDNA Affinity Precipitation AssayTranscription Factor BindingNuclear Lysate PreparationOligonucleotide Probe DesignEMSA Gel ElectrophoresisDAPA Streptavidin BeadsWestern Blot AnalysisAllele Specific Binding

Related Articles