Методическая статья

Stripe Assay по изучению притягательные или отталкивающие активность белка подложки с использованием диссоциированных нейронах гиппокампа

10.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54096

⸱

19 июня 2016 г.

 ,  ,  , 
1Anatomy and Neuroscience, Hamamatsu University School of Medicine, 2Cell and Neurobiology, Zoological Institute, Karlsruhe Institute of Technology (KIT)

В этой статье

Краткое содержание

Аксонные направляющие молекулы регулируют миграцию нейронов и целевую навигацию по конусу роста. Мы представляем мощный метод, полосатый анализ, для оценки способности направляющих молекул притягивать или отталкивать нейроны. В этом протоколе мы демонстрируем анализ полос, демонстрируя способность FLRT2 отталкивать культивируемые нейроны гиппокампа.

Аннотация

Растущие аксоны развивают очень подвижную структуру на своем кончике, называемую конусом роста. Конус роста контактирует с сигналами внеклеточной окружающей среды для управления аксональным ростом. Нетрин, щель, семафорин и эфрин являются известными направляющими молекулами, которые могут притягивать или отталкивать аксоны при связывании с рецепторами и корецепторами на аксоне. Активированные рецепторы инициируют различные сигнальные молекулы в конусе роста, которые изменяют структуру и движение нейрона. Здесь мы опишем подробный протокол анализа полос для оценки способности направляющей молекулы привлекать или отталкивать нейроны. В этом методе диссоциированные нейроны гиппокампа мышей E15.5 культивируют на посудах, покрытых ламинином, обработанных чередующимися полосами эктодомена фибронектина и богатого лейцином трансмембранного белка-2 (FLRT2) и контрольного белка кристаллизованной области (Fc) фрагмента иммуноглобулина G (IgG). Как аксоны, так и тела клеток были сильно оттолкнуты от полосатых областей, покрытых FLRT2, после 24 ч культивирования. Иммуноокрашивание тау1 показало, что ~90% нейронов были распределены на полосках с покрытием Fc по сравнению с полосами с покрытием FLRT2-Fc (~10%). Этот результат указывает на то, что FLRT2 оказывает сильное отталкивающее действие на эти нейроны. Этот мощный метод применим не только для первичных культивируемых нейронов, но и для множества других клеток, таких как нейробласты.

Введение

Аксонов это процесс , с помощью которого вновь образованные нейроны посылают аксоны к своей цели при разработке системы 1,2 нервной. Развивающиеся аксоны несут в себе высокую двигательная структуру на их кончике называется конус роста. Конус роста ощущает внеклеточные сигналы для навигации путь аксона в. Молекулы Наведение, такие как щели, Semaphorin и Ephrins, могут привлекать или отталкивать аксоны в зависимости от их взаимодействия с соответствующими рецепторами и корецепторами на аксона 1,3,4. Активированные рецепторы передачи сигналов к конусу роста, которые влияют на его организации цитоскелета для аксонов и ростового конуса движений.

Различные методы были разработаны, чтобы оценить действие аттрактанта и репеллента молекул. Химио-аттрактанты и репелленты могут быть введены в рост / культуральной среды с градиентом концентрации (например., Камера Данна или х-горок) 5,6, в сильно концентрированном месте с помощью микро-рipette (например., поворачиваясь анализ) 7 или в гомогенной концентрации путем применения ванны (например., коллапс анализа конус роста) 8,9.

Другие методы включают в тест - полосках или микроконтактной печати (μCP), в котором химио-аттрактант или репеллент наносят на поверхность пластины в качестве подложки 10-12. Thestripe анализ был первоначально разработан Бонхёффера и коллегами в 1987 году для анализа топографического картирования в системе куриных ретино-tectal 13. Оригинальный метод требует вакуумной системы для белков оболочки на поликарбонатных нуклеопорные мембран с использованием полосатых и сложных топологий матриц. В более поздних версиях, рекомбинантные белки были непосредственно напечатаны на поверхности пластины культуры в полосатый узор с использованием узкой щели матрицы кремниевых 14,15. В последнее время различные исследовательские группы успешно применили эту полоса анализа к анализу деятельности молекулы аксонов 16-21.

Здесь мы представляем подробный протокол для анализа полосы, который измеряет притяжение или отталкивание молекул аксонов для диссоциированных нейронов гиппокампа. Следует отметить, что этот метод может быть применен в минимально оборудованных лабораторных условиях. Для этого теста, чередуя полоски флуоресцентно меченого субстрата и контрольного белка генерируются на пластиковой чашке с использованием кремниевой матрицы с 90-мкм щели и покрывают ламинина. В нашей демонстрации, диссоциированных нейронов гиппокампа мышей E15.5 культивировали на чередующиеся полосы рекомбинантного эктодомена фибронектина и лейцин-богатый трансмембранный белок-2 (FLRT2) и управления Fc белка 21. Через 24 ч культуры, как аксоны и клеточные тела нейронов были сильно отталкивается от FLRT2 полос. Окрашивание с антителом анти-TAU1 показали, что ~ 90% нейронов были распределены по регионам с Fc-покрытием, по сравнению с ~ 10% на FLRT2-Fc, что указывает, что FLRT2 имеет сильное отталкивающеефункция для нейронов гиппокампа 21.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Процедуры с участием субъектов животных были одобрены по уходу и использованию комитета Institutional животных путем в Хамамацу школы медицины университета.

1. Получение матриц

  1. Кипятить 4-8 силиконовых матриц в микроволновой печи или на горячей плите в течение 5 мин и дайте им полностью высохнуть в течение 1 ч при ламинарном потоке (полосатая стороной вверх).
    Примечание: Следующие процедуры должны выполняться в соответствии с ламинарным потоком.
  2. Продуть сжатым воздухом или использовать прозрачную липкую ленту, чтобы удалить пыль из полосатой стороны матриц. Держите полосатую сторону чистой, чтобы он мог прочно прилипают к поверхности пластины.
  3. Осторожно поместите матрицы на 6-см пластиковой посуды, нажимая пальцем (одной матрицы на чашку; полоса стороной вниз). Избегайте попадания пузырьков воздуха между матрицей и блюдо. Отметьте расположение полос на нижней стороне культуры блюдо.
  4. Если матрица не может приложить, повторите процедуру с шага 1.2.

2. Генерация и нашивки Laminin покрытие для Neuron культуры

  1. Готовят флуоресцентно меченого рекомбинантного белка (25 мкл каждого для инъекций [стадии 2,2] или 100 мкл каждого для способа размещения [этапе 2.2.1]) путем смешивания с Fc-меченый белок (10-50 мкг / мл) и флуоресцентного dye- конъюгированные антитела против человеческого Fc-антитела (от 1 до 3 соотношение: 30-150 мкг / мл) в фосфатном буферном солевом растворе (PBS). Затем инкубирование смеси в течение 30 мин при комнатной температуре.
  2. С помощью 22-G шприца, вводят 25 мкл рекомбинантного белка , полученного на предыдущей стадии (2.1) через небольшое отверстие на стороне матрицы (стрелки на рисунке 1А, 1С и 1Е).
    1. В качестве альтернативы, поместите 100 мкл рекомбинантного белка в верхнюю щель матрицы и аспирата приблизительно половину раствора из небольшого отверстия (стрелки на рисунке 1А, 1С и 1Е), таким образом , что рекомбинантный белок остается в полосатой регионах.
  3. Выдержите блюдо в течение 30 мин при 37 ° С в инкубаторе для клеточных культур.
  4. Поместите 300 мкл PBS в верхнюю щель (рис 1б) и аспирата из небольшого отверстия , расположенного на стороне матрицы (стрелки на рисунке 1А, С и Е) для удаления неприкрепленные рекомбинантных белков. Не аспирация PBS полностью, потому что белки высохнет. Повторите этот шаг дважды. (3 раза всего)
  5. Осторожно снимите матрицу и немедленно поместить ~ 100 мкл контрольного белка (10-50 мкг / мл; Fc), чтобы покрыть всю полосатую область, создавая альтернативное покрытие. Затем, инкубировать блюдо в течение 30 мин при 37 ° С в инкубаторе для клеточных культур.
  6. После промывки поверхности посуды три раза PBS, пальто с ~ 100 мкл 20 мкг / мл ламинина в PBS.
    Примечание: Laminin следует оттаивали на льду, чтобы предотвратить затвердевание.
  7. Инкубируйте блюдо в течение 1 ч при 37 ° С в инкубаторе для клеточных культур.
  8. Промыть поверхности посуды три раза PBS и добавляют культуру Mediит. Поместите блюдо , покрытое культуральной среде в атмосфере 5% СО 2 инкубаторе при температуре 37 ° С до использования.

3. Культивирование нейронах гиппокампа от E15.5 эмбрионов мыши

  1. Эвтаназии мать с помощью цервикальной дислокации и выделить три E15.5 эмбрионов.
  2. Разрежьте кожу и череп сагиттальной на средней линии головы с ножницами, и удалить мозг, используя маленькую ложку. Перенести мозг осторожно к 60-мм чашки Петри, содержащую 3 мл Хэнкса сбалансированный солевой раствор (HBSS).
  3. Используя скальпель, вырезают полушарий включая кору головного мозга, гиппокампе и стриатуме (рис 2А). Затем, Рассеките из гиппокампа путем тщательного удаления оболочки мозга, и передать отсеченных гиппокампа ткани на 15-мл центрифужную пробирку , содержащую 2 мл раствора HBSS, на льду (рис 2B-C). Соберите 6 гиппокампа из 3-х эмбрионов в трубе, которые достаточны для культивирования нейронов в 8 блюд.
  4. Заменить HРешение ПБС с раствором трипсин / ЭДТА (2 мл) и инкубировать пробирку при 37 ° С в течение 15 мин на водяной бане.
    Примечание: Аспирируйте HBSS без центрифугирования и не сливают раствор HBSS путем наклона трубки.
  5. Нейтрализовать активность трипсина путем добавления 500 мкл фетальной бычьей сыворотки (FBS).
  6. Центрифуга смесь при 100 мкг в течение 5 мин. Удалить супернатант и промыть осадок с 2 мл культуральной среды. Повторите этот шаг еще раз.
  7. Пипетируйте гиппокампы вверх и вниз 10 раз в культуральной среде с использованием 1000 мкл наконечник с большим отверстием (вырезать наконечник), чтобы отделить ткани.
  8. Изменение к обычному (неразрезанные) 1000 мкл кончика и пипеткой диссоциированной ткани вверх и вниз, чтобы получить одной клеточной суспензии.
  9. Отдельные единичные клетки, пропуская их через сетчатый клеточный фильтр 80-100 мкм.
  10. Центрифуга отфильтрованной клеточной суспензии при 150 мкг в течение 5 мин.
  11. Удалить супернатант аспирацией и ресуспендируют ПеллЕТ (нейронов) в 2 мл культуральной среды.
  12. Граф клеток с использованием гемоцитометра с окрашивания трипановым синим, чтобы определить плотность и жизнеспособность. Затем пластины 10000 нейронов в 150 мкл культуральной среды для каждого набора stripes.The подвески должны быть тщательно помещены, чтобы покрыть всю область полосы.

4. Визуализация клеточных тел и аксонов с помощью иммунофлуоресценции Окрашивание с использованием анти-TAU1 антитело

  1. Через 24 ч культивирования, аспирата среду, не нарушая прилипшие клетки, и фиксируют нейроны с предварительно подогретой 4% параформальдегида (PFA) / 4% сахарозы / PBS при комнатной температуре в течение 15 мин.
  2. Промыть поверхности пластины 3 раза PBS. При желании, использовать водоотталкивающий ручку, чтобы нарисовать круг вокруг полосатой области, чтобы уменьшить количество антител, необходимое.
  3. Проницаемыми нейроны с 0,3% тритона Х-100 / PBS в течение 5 мин.
  4. Инкубируйте нейроны с блокирующим раствором, содержащим 3% ослиную сыворотку и 0,1% Тритон Х-100 для30 мин с последующей инкубацией с антителом анти-TAU1 (1: 200) в 1% ослиной сыворотки / 0,1% Тритон Х-100 / PBS / N O при температуре 4 ° С.
  5. Промыть поверхности пластины 3 раза PBS. Инкубируйте нейроны с флуорофором-конъюгированные антитела против мышиного IgG антител в 1% бычьего сывороточного альбумина (БСА) /0.1% Тритона Х-100 / PBS в течение 30 мин.
  6. Промыть поверхности пластины 3 раза PBS. Накройте полосатый область с крышкой х 18 мм стекла 18 мм с использованием 50 мкл antifade раствора. избежать воздушных пузырей, которые мешают визуализации.
  7. Получают флуоресцентные изображения с помощью флуоресцентного микроскопа с использованием соответствующей системы, например, x10 объектива, наборы фильтров для GFP и RFP, и 1000 мс время экспозиции (рисунок 3).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Разъединенные нейроны гиппокампа мышей E15.5 высевали и культивировали в течение 24 ч на полосы флуоресцентно меченых управления Fc (рис 3A-C) или FLRT2-Fc (рис 3D-F) , чередующиеся с немеченого управления Fc. В обоих случаях, нейроны были агрегируются и расширили свои аксоны в виде пучков. Об управлении Fc / Fc полосы, нейроны были распределены равномерно по флуоресцентно меченных и не меченных полос, и они расширили свои аксоны в случайных направлениях...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Этот протокол описывает тест-полосках, который использует рекомбинантный белок и разложенных нейроны из гиппокампа E15.5 мыши. Этот анализ позволяет эффективно наблюдать отталкивающих, привлекательных, или нейтральных ответов нейронов к рекомбинантного белка, представляющего интерес, помещенный в полосатый узор. Основным преимуществом этого протокола является простой способ для формирования полосы, в которых белок непосредственно напечатанным на поверхность пластиковой тарелки, по сравнению с традиционным методом, котор...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами на научные исследования от Японского общества содействия науке (23700412, 25122707 и 26670090 to S.Y.).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Центрифужная пробирка 15 млViolamo 1-3500-01
4% параформальдегид (PFA)Nacalai01954-85
Alexa Fluor 488 Козье антитело IgG к человекуThermo ScientificA11013
Alexa Fluor 594 Антитело IgG к мышам Donkey ThermoScientificA-21203Разведение 1/500
Антитело против Tau1ChemiconMAB3420Разведение 1/200
AntifadeThermo ScientificP7481Можно использовать альтернативные монтажные среды
B27Добавка Thermo Scientific17504-044Разбавление 1/50
Бычий сывороточный альбуминSigma01-2030-2
Сетчатый фильтр для клеток 100 мкмBD Falcon352360
Центрифугирующая машинаKubota2410
Защитное стекло 18ммx18ммМацунами18x18 мм No1
DAKO ручкаDAKOS2002Можно использовать альтернативную водоотталкивающую ручку
Одноразовый скальпельFeather2975#11
FBSThermo Scientific10437-028
Флуоресцендный микроскопNikonE600
Щипцы No5Fine Science Tools11254-20
GlutaMAXThermo Scientific35050-061Разведение 1/100
Шприц HamiltonHamilton805N22 калибра, 50 мкл
HBSSThermo Scientific14170-112
IgG человека, фрагмент fc Jackson009-000-008
LamininThermo Scientific23017-015
Нейробазальныйтермо Scientific21103-049
Нормальная сыворотка ослаJackson017-000-121
PBSNacalai14249-24
Пенициллин-стрептомицинThermo Scientific15070-063Разведение 1/100
Пластиковая питательная чашка, 60 ммThermo Scientific150288
силиконовые матрицыДоступно и приобретается у профессора Мартина Бастмайера (bastmeyer@kit.edu)
Стерео микроскопOlympusSZ61
Tip, 1000 мклWatson125-1000S
Прозрачная липкая лентаTesa57315Альтернативная клейкая лента может быть использована
Triton X-100SigmaT8787
Трипан синий, 0.4%Bio-Rad145-0013
Трипсин/ЭДТАThermo Scientific25300-054
Питательная средаНейробазал с добавлением B27, GlutaMAX и пенициллин-стрептомицина.

Ссылки

  1. Dickson, B. J. Molecular mechanisms of axon guidance. Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).
  2. Bashaw, G. J., Klein, R. Signaling from axon guidance receptors. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (5), 001941(2010).
  3. Hong, K., Nishiyama, M., Henley, J., Tessier-Lavigne, M., Poo, M. Calcium signalling in the guidance of nerve growth by netrin-1. Nature. 403 (6765), 93-98 (2000).
  4. Ming, G. -l, Henley, J., Tessier-Lavigne, M., Song, H. -j, Poo, M. -m Electrical Activity Modulates Growth Cone Guidance by Diffusible Factors. Neuron. 29 (2), 441-452 (2001).
  5. Dudanova, I., et al. Genetic evidence for a contribution of EphA:ephrinA reverse signaling to motor axon guidance. J Neurosci. 32 (15), 5209-5215 (2012).
  6. Ye, B. Q., Geng, Z. H., Ma, L., Geng, J. G. Slit2 regulates attractive eosinophil and repulsive neutrophil chemotaxis through differential srGAP1 expression during lung inflammation. J Immunol. 185 (10), 6294-6305 (2010).
  7. Ly, A., et al. DSCAM is a netrin receptor that collaborates with DCC in mediating turning responses to netrin-1. Cell. 133 (7), 1241-1254 (2008).
  8. Hata, K., Kaibuchi, K., Inagaki, S., Yamashita, T. Unc5B associates with LARG to mediate the action of repulsive guidance molecule. J Cell Biol. 184 (5), 737-750 (2009).
  9. Egea, J., et al. Regulation of EphA 4 kinase activity is required for a subset of axon guidance decisions suggesting a key role for receptor clustering in Eph function. Neuron. 47 (4), 515-528 (2005).
  10. von Philipsborn, A. C., Lang, S., Jiang, Z., Bonhoeffer, F., Bastmeyer, M. Substrate-Bound Protein Gradients for Cell Culture Fabricated by Microfluidic Networks and Microcontact Printing. Sci Signal. , (2007).
  11. Jackman, R., Wilbur, J., Whitesides, G. Fabrication of submicrometer features on curved substrates by microcontact printing. Science. 269 (5224), 664-666 (1995).
  12. Mrksich, M., Whitesides, G. M. Using self-assembled monolayers to understand the interactions of man-made surfaces with proteins and cells. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 25, 55-78 (1996).
  13. Walter, J., Kern-Veits, B., Huf, J., Stolze, B., Bonhoeffer, F. Recognition of position-specific properties of tectai cell membranes by retinal axons in vitro. Development. 101, 685-696 (1987).
  14. Knoll, B., Weinl, C., Nordheim, A., Bonhoeffer, F. Stripe assay to examine axonal guidance and cell migration. Nat Protoc. 2 (5), 1216-1224 (2007).
  15. Weschenfelder, M., Weth, F., Knoll, B., Bastmeyer, M. The stripe assay: studying growth preference and axon guidance on binary choice substrates in vitro. Methods Mol Biol. 1018, 229-246 (2013).
  16. Seiradake, E., et al. Structure and functional relevance of the Slit2 homodimerization domain. EMBO Rep. 10 (7), 736-741 (2009).
  17. Gebhardt, C., Bastmeyer, M., Weth, F. Balancing of ephrin/Eph forward and reverse signaling as the driving force of adaptive topographic mapping. Development. 139 (2), 335-345 (2012).
  18. Atapattu, L., et al. Antibodies binding the ADAM10 substrate recognition domain inhibit Eph function. J Cell Sci. 125, (Pt 24) 6084-6093 (2012).
  19. Stark, D. A., Karvas, R. M., Siegel, A. L., Cornelison, D. D. Eph/ephrin interactions modulate muscle satellite cell motility and patterning. Development. 138 (24), 5279-5289 (2011).
  20. Seiradake, E., et al. FLRT Structure: Balancing Repulsion and Cell Adhesion in Cortical and Vascular Development. Neuron. 84 (2), 370-385 (2014).
  21. Yamagishi, S., et al. FLRT2 and FLRT3 act as repulsive guidance cues for Unc5-positive neurons. EMBO J. 30 (14), 2920-2933 (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

FLRT2Tau1

Похожие статьи