Микрожидком Платформа с высокой пропускной способностью изоляции одноклеточные и культуры

Summary

Здесь мы представляем протокол для выделения и культивирования одиночных клеток с помощью микрофлюидной платформы, в котором используется новая концепция дизайна микролунок, обеспечивающая высокоэффективную изоляцию одиночных клеток и долгосрочное клональное культивирование.

Abstract

Изучение гетерогенности одиночных клеток имеет решающее значение для многих биологических вопросов, но технически сложно. Таким образом, существует потребность в простом, но высокопроизводительном методе для проведения экспериментов с культурами одиночных клеток. В данной работе мы представляем стратегию на основе микрофлюидных чипов для высокоэффективной изоляции одиночных клеток (~77%) и демонстрируем ее способность выполнять долгосрочный анализ одноклеточной культуры (до 7 дней) и клеточной гетерогенности с использованием клоногенного анализа. Эти приложения были продемонстрированы с мышиными нервными стволовыми клетками KT98 и раковыми клетками человека A549 и MDA-MB-435. Высокая эффективность выделения одиночных клеток и долговременная культурационная способность достигаются за счет использования микролунок различных размеров в верхней и нижней части микрофлюидного канала. Малая микролуночная матрица предназначена для точной изоляции одиночных клеток, а большая микролуночная матрица используется для клональной культивирования одиночных клеток в микрофлюидном чипе. Эта микрофлюидная платформа представляет собой привлекательный подход для применения в культурах одиночных клеток благодаря гибкости регулируемых пространств для клеточных культур для различных стратегий культивирования без снижения эффективности изоляции.

Introduction

В настоящее время размещения отдельных клеток по отдельности в ферментационной пространстве обычно достигается за счет использования ограниченного разведения или флуоресценции активированного сортировки клеток (FACS). Для многих лабораторий, предельное разведение является удобным методом, так как он требует только пипеткой и тканевые культуры пластины, которые легко доступны. В этом случае суспензию клеток серийно разводили до соответствующей плотности клеток, и затем помещают в культуральные лунки с помощью ручной пипетки. Эти отдельные клетки , разделенные на отсеки, затем используются для анализа клеток, таких как генетической гетерогенности скрининг ¹ и колонии образование ^2. Тем не менее, этот метод является низкой пропускной способностью и трудоемкий, без использования роботизированную руку за помощью, так как распределение Пуассона характер методом серийных разведений ограничивает события одноклеточных до максимальной вероятностью 37% ^3. FACS машины с интегрированной роботизированной рукой может преодолеть ограничение распределения Пуассона путем точного НОАКING один для одной ячейки в культуре также одновременно ^4. Тем не менее, высокие механические напряжения сдвига (таким образом, снижение жизнеспособности клеток) ⁵ и машина покупка и эксплуатационные расходы ограничили его использование во многих лабораториях.

Чтобы преодолеть вышеуказанные ограничения, микромасштабные устройства были разработаны с высокой эффективностью загрузки отдельных клеток в лунках ^6. Тем не менее, Микролунки не обеспечивают достаточное пространство для нагруженные клетки к пролиферации, из-за необходимости делать размер каждого микропланештным, близкой к одной ячейке, чтобы максимизировать вероятность загрузки одноклеточных. Как Анализы культуры необходимы во многих приложениях , основанных на клетках (например, клоногенности ^7), более крупные Микролунки (от 90 - 650 мкм в диаметре или по длине боковой) также были использованы для обеспечения расширенных клеточных культур. Тем не менее, как и методом серийных разведений, они также обладают низкой эффективностью одноклеточ- погрузочных, в пределах от 10 -. 30% ⁸, 9

Ранее мы разработали высокой пропускной микрожидкостных платформу для выделения отдельных клеток в отдельных лунках и демонстрируют свое применение в клоногенности из изолированных клеток. ¹⁰ Устройство было сделано с поли-диметилсилоксан (PDMS), и включает в себя два набора микролуночные массивов с различными размерами микролуночные, которые могут в значительной степени улучшить эффективность при загрузке одной ячейки в микропланшета размер которого значительно больше, чем клетки. Следует отметить, что это понятие "двойного хорошо" позволяет размер области культуры, чтобы гибко регулироваться без влияния на эффективность улавливания одноклеточных, что делает его простым для регулировки конструкции устройства в соответствии с различными типами клеток и приложений. Этот метод высокой эффективности должно быть полезным для долгосрочных экспериментов на культуре клеток для исследования клеточной гетерогенности и моноклональное создании клеточной линии.

Protocol

Примечание: Конструкции фотошаблонов для изготовления нашей микрожидком устройства были сделаны с использованием системы автоматизированного проектирования программного обеспечения (САПР). Проекты были затем использованы для изготовления фотошаблонов хромовые с использованием коммерческих услуг. Эти PDMS устройства были сделаны с использованием мягких методов литографии. ¹¹

1. Изготовление пресс-форм Мастер литографией

1. До начала процесса ¹² фотолитографии используют 4- х дюймовых кремниевых пластин в качестве подложки и обезвоживают пластин в обычной печи при 120 ° С в течение 10 мин.
2. Очистите обезвоженные кремниевых пластин с помощью плазменной обработки кислорода при 100 Вт в течение 30 секунд в очистителя плазмы.
3. Разогреть две конфорки при 65 ° C и 95 ° C, соответственно, для последующего процесса выпечки.
4. Coat 5 г негативного фоторезиста (PR) на очищенную кремниевых пластин спиновой для нанесения покрытий; спина при 1200 оборотов в минуту (SU-8 50) в течение 30 секунд, чтобы произвести Микроканал слой.
5. Поместите PRс покрытием пластины на предварительно нагретую плитке при 65 ° С в течение 12 мин, и передать его на другой предварительно разогретой конфорке при 95 ° С в течение 33 мин (за толщиной 100 мкм узоров), чтобы выполнить мягкий процесс выпечки.
6. После выпечки, поместите PR покрытием кремниевой пластины на держателе полуавтоматической маски выравнивателя и выровнять его фотошаблона прозрачности в 25400 точек на дюйм разрешение.
7. Проэкспонируйте PR покрытием кремниевой пластины , УФ - излучения (365 нм) в дозе 500 мДж / см ² , чтобы создать шаблон PR на кремниевой пластине.
8. Удалите пластину из выравнивателя и поместите его на плитке для пост-термообработки при температуре 95 ° С в течение 12 мин.
9. Замачивание вафель в СУ-8 разработчик раствора (монометилового эфира пропиленгликоля, ацетат PGMEA), чтобы смыть несшитый PR в течение 12 мин и осторожно сухой газообразным азотом, чтобы выставить меток выравнивания.
10. Опять же, пальто 5 г негативного фоторезиста на пластинах спиновой для нанесения покрытий; спина при 700 оборотах в минуту (SU-8 100) в течение 30 сек и 1200 оборотов в минуту (SU-8 10) в течение 30 секунд на 300 &# 181; м толстый образец и 27 мкм соответственно модели, чтобы сделать микролуночные слой.
11. Поместите пластину PR, нанесенными на плитке при 65 ° С в течение 4 мин и при 95 ° С в течение 8 мин (в течение 27 мкм глубокий слой снимаемого хорошо); и при температуре 65 ° С в течение 40 мин и при 95 ° С в течение 110 мин (для глубокого слоя культуры, а 300 мкм).
12. После охлаждения поместите PR покрытием кремниевой пластины на маске выравнивателя, оборудованного УФ-светом.
13. Проэкспонируйте PR покрытием кремниевой пластины для УФ - света (365 нм) в дозе 250 мДж / см ² (для 27 мкм толщиной образца) и 700 мДж / см ² (для 300 мкм толщиной образца).
14. Испечь вафли при температуре 95 ° С в течение 5 мин (27 мкм толщиной образца) и 30 мин (300 мкм толщиной образца), соответственно.
15. Смыть несшитый PR в PGMEA в течение 6 мин (27 мкм толщиной образца) и 25 мин (300 мкм толщиной образца), соответственно, а затем высушить их газообразным азотом.
16. Измерьте высоту модели функции навафля с помощью сканирующего лазерного профилометра путем размещения пластины на ху стадии сканирующего лазерного профилометра.
    1. Регулировка фокальной плоскости, чтобы четко показать рисунок особенности на пластине с помощью режима наблюдения "обзора камеры" под 20X объектива.
    2. Переключение режима наблюдения с "точки зрения" камеры для "лазерного зрения", и установить верхние и нижние положения особенностей.
    3. Установите режим измерения, площадь, качество и Z-поле вплоть до прозрачного (сверху), 1 линия (1,024 х 1), высокой точностью и 0,5 мкм соответственно, а затем нажмите нижнюю Старт, чтобы начать измерение.

2. Подготовка PDMS устройств для изоляции одноклеточные

1. Перед тем как литье PDMS, silanize мастер-формы с трихлорсилана, чтобы создать гидрофобную поверхность, что делает его легче слезть PDMS реплики из основных форм.
   1. Поместите мастер-формы и весовой лодку, содержащую200 мкл трихлорсилана в эксикаторе и применять вакуум (-85 кПа) в течение 15 мин.
   2. Прекратить вакуум, а затем оставить мастер формы в эксикаторе до silanize мастер-формы при комнатной температуре в течение по меньшей мере 1 ч.
   3. Удалите мастер-формы из эксикаторе и поместить каждую основную форму в 10 см чашку Петри.
2. Смешайте общее количество 17.6 г ПДМС полимерного комплекта, содержащего основание и отвердитель в соотношении 10: 1, а затем залить PDMS на мастер-формы в чашке Петри.
3. Поместите чашку Петри в эксикаторе и применять вакуум (-85 кПа) в течение 1 ч для удаления пузырьков воздуха в PDMS.
4. Удалите чашку Петри из эксикаторе и поместить его в обычной печи при температуре 65 ° С в течение 3 - 6 ч, чтобы вылечить PDMS.
5. Удалите отвержденного PDMS реплики из основных форм и пробивать два отверстия как вход и выход на обоих концах микроканала на захвате ну массива PDMS реплики с помощью перфоратора с внутренним диаметром-0.75 мм для струйного канала (фиг.2А).
6. Используйте ленту, чтобы очистить поверхность реплик PDMS, а затем поместить реплики PDMS в очистителя плазмы для кратковременного лечения кислородной плазмы (100 Вт в течение 14 секунд).
7. Удаление реплик PDMS из кислородной плазмы машины.
8. Совместите верхнюю часть (содержащую миропланшет захвата) и нижний слой PDMS (содержащие лунках культура) реплику вручную под стереомикроскопа и привести их в контакт.
9. Поместите выровненные PDMS репликами в сушильном шкафу при температуре 65 ° С в течение 24 часов для достижения постоянного сцепления между PDMS репликами с образованием конечного устройства.
10. Замочите устройство PDMS в деионизированной (DI) -Water заполненного контейнера и поместите контейнер в эксикаторе под вакуумом (-85 кПа) в течение 15 мин, чтобы удалить воздух из микроканала устройства PDMS.
11. Поместите DI заполненный водой устройство PDMS в капот культуры ткани и использовать УФ-излучения (длина волны света: 254 нм), чтобы стерилизовать устройства для 30 мильп.
12. Заменить DI воды в устройстве PDMS с 5% бычьего сывороточного альбумина в (BSA) в растворе 1X PBS и инкубируют при температуре 37 ° С в течение 30 мин, чтобы предотвратить клетки от прилипания к поверхности PDMS.
    Примечание: Покрытие БСА имеет решающее значение для повышения эффективности передачи изолированных клеток от захвата-хорошо к культуре-хорошо.
13. Заменить 5% раствор БСА в устройстве PDMS стерильным раствором 1x PBS.

3. Получение одноклеточные Подвеска

1. Культура нейрональных стволовых клеток KT98 и А549 карциномы человека клеток и MDA-MB-435 у нас в чашке Петри в обычных клеточных культур инкубатор (37 ° C, 5% CO ₂ и 95% влажности) для подготовки клеток для эксперимента ПДМС клеточного устройства ,
2. Удаляют использованную питательную среду (DMEM базальной среды, подаваемой с 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 1% антибиотиков) из культуральной чашки с клетками, выращиваемых до 70 - 80% слияния.
3. Осторожно промыть клетки с стерилизованных PBS три раза.
4. Удаляют PBS, и добавьте 2 мл рекомбинантного фермента смеси с протеолитическими, коллагенолитических и деятельности ДНКазы (смотрите в список материалов для получения подробной информации).
5. Выдержите культуры блюдо при комнатной температуре в течение 5 мин, а затем нажмите культуры блюдо для облегчения открепления клеток.
6. Добавляют 4 мл стерилизованного PBS, чтобы разогнать клетки, а затем передачи клеточной суспензии в 15 мл коническую трубку.
7. Центрифуга трубки при 300 х г в течение 3 мин и удалить супернатант.
8. Аккуратно ресуспендируют осадок клеток в 1 мл стерилизованной PBS и подсчитать количество живых клеток с использованием стандартного трипанового синего метод исключения ^13.
   Примечание: Этот шаг взмучивания имеет решающее значение для подготовки хорошо диссоциирует одной клеточной суспензии для повышения эффективности изоляции одноклеточных.

4. Изоляция Одноклеточный и Клональный Культура

1. Нагрузка 50 мкл суспензии клеток в концентрации 2,2 - 2,5 х10 6 клеток / мл в микроканале устройства PDMS через выходное отверстие устройства с портативным пипеткой.
   Примечание: клеточная суспензия загрузки пипетка должна быть остановлена ​​и удерживается в первом положении остановки, чтобы избежать введения пузырьков воздуха в микроканале.
2. Загрузить еще 50 мкл клеточной суспензии через входное отверстие, чтобы равномерно заполнить весь микроканал с клетками.
3. Уплотнение выходное отверстие с пробкой (длинный 3 мм, 1 мм в диаметре вырезать нейлоновой леской), чтобы избежать потока, индуцированный гидростатическим давлением из капель на впускных и выпускных отверстий.
   Примечание: Пробки были УФ стерилизовать внутри тканевой культуры капот перед использованием.
4. Залить 1 мл стерильного шприца с культуральной средой, извлечь пузырьки воздуха из него, и установить его на шприцевой насос.
5. Подключение носителя загружен шприц к впускному отверстию устройства PDMS через 23 G тупой иглой и поли-tetrafluoroethene (PTFE) трубки.
6. Выньте вилку из выпускного отверстия и всевл интервал времени 2-мин, чтобы позволить клеткам оседать в одноклеточных захвата скважин под действием силы тяжести.
7. Смывают Неуловленные клетки с 300 мкл культуральной среды, при скорости потока 600 мкл / мин с приводом от шприцевой насос.
8. Подождите в течение 2 мин, чтобы стабилизировать устройство, и уплотнение впускного и выпускного отверстия с заглушками, чтобы сформировать замкнутую систему культуры.
9. Переверните устройство вручную, чтобы передать захваченные одиночные клетки в лунках культуры.
10. Поместите устройство PDMS в 100-мм блюдо культуры ткани в, и добавляют 10 мл стерильного PBS вокруг устройства, чтобы избежать культуральной среде испарения с микроканала.
11. Перемещение культуры блюдо с обычной клеточной культуры инкубатор (37 ° C, 5% CO ₂ и 95% влажности) для клональной культуры одноленточного клеток.

5. Культура Средняя Пополнение запасов

1. После того, как 1 г культуры, заменить культуральную среду, в устройстве PDMS со свежей средой для улучшения клеточной PRoliferation.
2. Место две капли культуральной среды на верхней части устройства PDMS вблизи впускного и выпускного отверстий областей, чтобы избежать введения пузырьков воздуха в микроканале при выполнении следующего шага.
3. Удар два отверстия из верхней части устройства PDMS вблизи двух концов микроканала в качестве впускного и выпускное отверстие для микроканала.
   Примечание: Не пробивать целых два слоя PDMS устройства; вместо этого, просто удар через верхний слой из PDMS.
4. Подключите пластиковый шприц, содержащий 1 мл свежей среды на входе через 23 G тупой иглой и PTFE трубки.
5. Поток 120 мкл свежей среды в устройство в течение 5 мин, чтобы заменить старый носитель.
6. Вставьте две заглушки для герметизации впускных и выпускных отверстий, и вернуть устройство в культуре клеток инкубатора.
7. Обновить культуральной среды каждые 2 D в течение периода культуры путем удаления заглушек, а затем, повторяя шаги 5.4 до 5.5.

Results

Микрожидкостных платформа для изоляции и культуры одноклеточной содержит микроканале (200 мкм в высоту) с двумя наборами микролуночные массивов (рис 2А). Два набора микролуночные массивов, называются захвата-луночные (25 мкм в диаметре и 27 мкм по глубине) и культуры-луночные (285 мкм в диаметре и в глубину 300 мкм) для выделения одной клетки и культуры, соответственно, и каждый захват-хорошо расположен в центре культуральную-хорошо , когда видно из виду сверху (...

Discussion

Системы устройств Микропланшетные на основе ^6,14 были использованы для манипулирования одноклеточных и анализа, такие как крупномасштабной одной клетки захвата ⁶ и пролиферации одного гемопоэтических стволовых клеток ^15. Несмотря на то, также размер, количество и форма могут быть приспособлены для конкретных применений, эффективность изоляции одноклеточного всегда под угрозу , когда размер скважины увеличивается. ^9,15

Чтобы преодолеть это ограничен...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Программное обеспечение AutoCAD	Autodesk	AutoCAD LT 2011	Артикул 057C1-74A111-1001
Кремниевая пластина	Корперация Eltech	SPE0039
Обычная печь	YEONG-SHIN компания	ovp45
Плазменный очиститель	Nordson	AP-300	Настольная система плазменной обработки
SU-8 50 негативный фоторезист	MicroChem	Y131269
SU-8 100 негативный фоторезист	MicroChem	Y131273
Spin Coater	Synrex Co., ООО.	SC-HMI 2" ~ 6"
Горячая плита	YOTEC компании	YS-300S
Msak aligner	Deya Optronic CO.	А1К-5-МДА
СУ-8 разработчик	Grand Chemical Companies	GP5002-000000-72GC	Пропиленгликоль монометиловый эфир ацетат
Сканирующий лазерный профилометр	KEYENCE	VK-X 100
Трихлорсилан	Gelest, Inc	SIT8174.0	Тридекафтор-1,1,2,2-тетрагидрооктил. Рискованный. Разъедает дыхательные пути, бурно реагирует с водой.
Эксикатор	Bel-Art Products	F42020-0000	Компактный вакуумный эксикатор 190  мм белая основа
Полидиметилсилоксан (PDMS) набор	Dow corning	Sylgard 184
Harris Uni-Core	Puncher Ted Pella Inc.	15072	с внутренним диаметром 0,75 мм
Съемная лента	3M Company	Scotch съемная лента 811
Стереомикроскоп	Leica Microsystems Leica	E24
Бычья сыворотка альбумин (BSA)	Bersing Technology	ALB001.500
DMEM базальная среда	Gibco	12800-017
Фетальная бычья сыворотка	Thermo Hyclone	SH30071.03HI
Антибиотики	Biowest	L0014-100	Глутамин-пенициллин-стрептомицин
Рекомбинантная смесь ферментов	Инновационная клеточная технология	AM-105	Accumax
DiIC12(3) краситель клеточной мембраны	BD Biosciences	354218	Используется в качестве клеточного трекера
Шприцевой насос	Гарвардский аппарат	703007
пластика шприц (1 мл)	BD Biosciences	309659
тупые иглы 23 калибра	Ever Sharp Technology, Inc.	Трубка TD21
из политетрафторэтенового (ПТФЭ)	Ever Sharp Technology, Inc.	Внутренний диаметр ТФТ-23Т	, 0,51  миллиметр; наружный диаметр, 0,82  миллиметр