Выделение и проточной цитометрии Характеристика мышиных лимфоцитах тонкого кишечника

Краткое содержание

Растет интерес к количественной характеристике кишечных лимфоцитов из-за растущего признания того, что эти клетки играют решающую роль в различных кишечных и системных заболеваниях. В этом протоколе мы описываем, как изолировать популяции отдельных клеток из различных компартментов тонкой кишки для последующей проточной цитометрической характеристики.

Аннотация

Кишечник - которые содержат наибольшее количество иммунных клеток любого органа в теле - постоянно подвергаются чужеродные антигены, как микробного и диетического. Принимая во внимание все большее понимание того, что эти антигены просветные помогают формировать иммунный ответ и что образование иммунных клеток в кишечнике имеет решающее значение для целого ряда системных заболеваний, наблюдается повышенный интерес к характеризующая кишечной иммунной системы. Тем не менее, многие опубликованные протоколы трудным и отнимает много времени. Мы представляем здесь упрощенный протокол для выделения лимфоцитов из тонкой кишки, собственной пластинке слизистой оболочки интраэпителиальной слоя и пейеровых бляшках, что является быстрым, воспроизводимым и не требует трудоемких градиенты перколлом. Хотя протокол фокусируется на тонком кишечнике, он также подходит для анализа толстой кишки. Кроме того, мы отмечаем некоторые аспекты, которые могут потребоваться дополнительные оптимизации в зависимости от конкретной научной Quesции. Такой подход приводит к выделению большого количества жизнеспособных лимфоцитов, которые впоследствии могут быть использованы для анализа потока цитометрии или альтернативные средства определения характеристик.

Введение

Основная задача тонкой кишки часто считается переваривание и всасывание питательных веществ ^1. В то время как эта метаболическая функция явно необходима, в тонкой кишке имеет столь же значительную роль в защите хозяина от постоянной шквал антигенов окружающей среды , найденных в просвете ^2. Кишечный тракт отделяет внешний мир (например., Просветные антигены) из внутренней среды организма хозяина с эпителиального слоя , который является только один слой клеток толщиной. Таким образом, малые кишечной иммунной системы имеет непростую задачу балансирования порог на реактивность, позволяя чужеродные антигены из рациона и синантропных микробов, чтобы войти в слизистую оболочку с минимальными, если таковые имеются, иммунный ответ, в то время как монтаж надежный ответ против вторгающихся патогенов и другие "вредные" антигены. Чрезмерное или неуместные иммунные ответы на эти антигены могут привести к патологическим заболеванием (например., Inflammaтори заболевания кишечника, сахарный диабет типа I, множественный склероз) , и его следует избегать ^3-6.

В целом, желудочно - кишечный тракт , как полагают, представляют собой самый большой иммунный орган в организме, содержащий более 70% всех секретирующих антитела клеток ^7. Тонкой кишки иммунная система состоит из 3 -х основных отсеков - собственная пластинка (LP), в интраэпителиальной слое и пейеровы бляшки (ПФС) - что каждая из них содержит характерную группу лимфоцитов ^2. ЛВ - лимфоциты (LPLs) являются в основном TCRαβ ⁺ Т - клеток с ~ 20% В - клеток; интраэпителиальной лимфоциты (IELS) содержат очень мало В - клеток с более TCRγδ ⁺ Т - клеток , чем TCRαβ ⁺ Т - клеток; и СПП, которые являются вторичными лимфоидные органы, встроенные в малой кишечной стенки, содержат ~ 80% В-клеток. Хотя каждая из этих анатомических областей имеет несколько различных функций и онтологические основания, они функционируют в ахarmonized способа, чтобы защитить хозяина от патогенных оскорблений.

Кроме того, растет понимание , что микрофлора является важным фактором , определяющим для развития кишечной иммунной системы, с увеличением признание родственной связи между конкретными микробами и онтогенезе отдельных клеточных клонов ^8,9. Кроме того, учитывая , что образование кишечной иммунной системы влияет на иммунную реакцию в анатомически удаленных сайтах (например., Артрит, рассеянный склероз, воспаление легких), стало ясно , что развитие кишечной иммунной системы имеет отношение к более болезненных процессов , чем считалось ранее ^{10 -12.} Таким образом, интерес к количественной оценке кишечной иммунной системы расширилась за пределы хозяин-патоген взаимодействий в настоящее время включают хост-синантропных взаимодействий и патогенеза многих системных заболеваний, а также.

Учитывая изменчивость текущих методов ввыделение кишечных лимфоцитов, метод, который оптимизирован для доходности, жизнеспособности и последовательности, при этом балансируя время, необходимое приобретает все большее значение. Протоколы , которые включают перколлом градиенты по времени и трудоемкими и потенциально более склонны к человеческой ошибки, что приводит к переменной доходности и жизнеспособности ^13. При этом мы обеспечиваем оптимизированный протокол для выделения и характеризации лимфоцитов, полученных от всех 3-х небольших кишечных иммунных отсеках. Кроме того, учитывая возрастающий интерес к микробно-индуцированное изменений в иммунной системе слизистой оболочки, мы включаем шаги, которые могут быть использованы для обеспечения горизонтальной передачи микроорганизмов между мышами, чтобы оценить, как эти изменения количественно влияют на кишечную иммунную систему.

Протокол

Все исследования проводились под строгим обзора и руководящих принципов в соответствии с животных по уходу и использованию комитета (Institutional IACUC) в Гарвардской медицинской школе, которая отвечает ветеринарным стандартам, установленным Американской ассоциации лабораторных животных науки (AALAS).

1. Горизонтальная передача бактерий через Co-корпус (необязательно)

1. Для того, чтобы свести к минимуму экзогенное загрязнения (в частности, при использовании гнотобионтных мышей), в асептических условиях при сборке стерильные одноразовые клетки, используя пищу и воду, которые оба были автоклавного.
2. Используйте пуансоны уха или метки индивидуально отмечать в возрасте 6 недель мышей C57BL / 6, которые укрывают различные микробиот и их размещения в одной клетке. Учитывая, что мыши копрофаг и едят фекальные шарики из клетки пола, естественно, микробы будут передаваться горизонтально между мышами.
3. Co-домовые мыши для ≥1 недели, чтобы дать время для микробного передачи и иммунологической изменения перед анализом.

2. Получение суспензии отдельных клеток из тонкой кишки интраэпителиальной слоя и собственной пластинки

1. Приготовление растворов
   1. Готовят экстракционные средства массовой информации (в тонкой кишке): 30 мл RPMI + 93 мкл 5% (вес / объем) дитиотреитола (DTT) + 60 мкл 0,5 М ЭДТА + 500 мкл фетальной бычьей сыворотки (ФБС). Добавьте DTT непосредственно перед использованием.
   2. Подготовить пищеварение носителя (за тонкой кишки): 25 мл RPMI + 12,5 мг диспазу + 37,5 мг коллагеназы II + 300 мкл FBS. Добавьте диспазу и коллагеназу непосредственно перед использованием.
   3. Для всех инкубирования при 37 ° С, prewarm растворов до 37 ° С.
2. Эвтаназии мышь СО ₂ удушья с последующим смещением шейных позвонков.
3. Поместите мышь спинной стороной вниз и распылить живота с 70% этанола. Используйте ножницы, чтобы выполнить лапаротомии путем последовательного резки кожи и затем перитонеальный фасцию вдоль вентральной средней линии сюдам лобкового симфиза до мечевидного процесса, тем самым подвергая брюшную полость.
4. Используйте ножницы, чтобы отделить тонкую кишку из желудка с помощью пересекающих пилорический сфинктер. Аккуратно снимите тонкую кишку из брюшины, дразня прочь брыжеечной жир.
   1. Чтобы полностью удалить тонкий кишечник, сделать второй разрез на подвздошно-слепой кишки перехода. Поместите изолированный тонкий кишечник в холодный (то есть., 4 ° С) среды RPMI , содержащей 10% FBS , чтобы максимизировать жизнеспособность клеток.
5. Осторожно удалите большие куски жира с помощью изогнутых щипцов. Соблюдайте осторожность, чтобы избежать разрыва ткани кишечника сама при попытке удалить жир.
6. Для удаления содержимого кишечника, осторожно промойте кишечник с 15 - 20 мл холодного PBS с использованием подачи иглы 18 G, прикрепленную к шприцу.
7. Используйте ножницы, чтобы вырезать PPs, и поместить их в холодную среду RPMI, содержащей 5% FBS. PPs расположены на antimesenteric стороне тонкой кишки и появляются в виде мульти-дольчатую белыймасса. В зависимости от конкретного штамма, мыши, как правило, имеет 8 - 12 PPs.
8. Отрежьте тонкий кишечник в 3-х - 4-дюймовых сегментов.
9. Удалите остатки жира путем прокатки каждый маленький-кишечный сегмент на бумажное полотенце, смоченным RPMI, используя тупую скальпель, чтобы дразнить жир прочь из ткани.
10. Поверните ткань наизнанку cannulating кишечных сегментов с изогнутым пинцетом и захватывая дистальный конец ткани. Затем с помощью пары прямых щипцов, чтобы аккуратно удалить сегмент ткани из изогнутых щипцов (начиная с проксимального конца), в результате чего ткань инвертирования.
11. Поместите сегменты ткани в чашку, содержащую 30 мл экстракционного сред и мешалку. Закрепить крышку на чашку, и перемешивали при 500 оборотах в минуту в течение 15 мин при 37 ° С; Перемешивание должно быть энергичным, но не турбулентным.
12. После инкубации используют стальной сетчатый фильтр, чтобы отделить куски ткани от эпителий, содержащий супернатант, который должен появиться мутным. Этот супернатант содержит Intraepithelial лимфоциты, которые могут быть дополнительно проанализированы, если это желательно, путем проведения фильтрации образца с шагом 2,18 - 2,23.
13. Вручную перемешивать кусочки ткани в RPMI, чтобы смыть остаточных средств массовой экстракции.
14. Поместите ткань на сухое бумажное полотенце и перевернуть его конец над концом несколько раз, чтобы облегчить удаление остаточной слизи, которая не была освобождена экстракционной среды.
15. Поместите фрагменты ткани в 1,5 мл пробирку с 600 мкл среды сбраживания.
16. Используйте ножницы, чтобы пропустить через мясорубку ткани, пока куски больше не придерживаться ножниц и раствор кажется однородным. Этот шаг имеет решающее значение для обеспечения полного ферментативного расщепления ткани.
17. Добавьте рубленый тонкую кишку в чашку, содержащую 25 мл переваривания сред. Смесь перемешивают при 500 оборотах в минуту в течение 30 мин при 37 ° С. На полпути через переваривания (т.е.., Через 15 мин), пипеткой вверх и вниз с серологической пипеткой , чтобы помочь разрушить любые большие куски ткани.
18. Фильтр переваривают ткани (или epithelial слой с шага 2.12, если обработка IELS) через сито 100 клеток мкм в 50 мл пробирку. Промыть фильтр 20 мл среды RPMI, содержащей 10% FBS.
19. Центрифуга отфильтрованный раствор при 500g в течение 10 мин при 4 ° С.
20. Супернатант осторожно декантируют и ресуспендируют осадок в 1 мл среды RPMI, содержащей 10% FBS.
21. Фильтр ресуспендировали клеток через 40 мкм клеточный фильтр с в 50 мл пробирку. Промыть сетчатый фильтр с 20 мл среды RPMI, содержащей 10% FBS.
22. Центрифуга отфильтрованный раствор при 500g в течение 10 мин при температуре 4 ° С.
23. Супернатант осторожно декантируют, и ресуспендируют осадок в 1 мл среды RPMI, содержащей 2% FBS.

3. Получение суспензии отдельных клеток из пейеровых бляшках

1. Передача вырезают PPs в чашку с 25 мл пищеварением сред и мешалкой. Безопасная крышка, и отжим при 500 оборотах в минуту в течение 10 мин при 37 ° С.
2. Фильтр переваривается PPs через 40 мкм клеточный фильтр с в 50 мл пробирку. Если комков Ремав, нажмите их через сетчатый фильтр, используя плоский конец плунжера из шприца емкостью 1 мл.
3. Промыть фильтр 10 мл среды RPMI, содержащей 10% FBS.
4. Центрифуга отфильтрованный раствор при 500g в течение 10 мин при температуре 4 ° С.
5. Супернатант осторожно декантируют, и ресуспендируют осадок в 1 мл среды RPMI, содержащей 2% FBS.

4. Поверхность Окрашивание для проточной цитометрии

1. Аликвоты соответствующий объем клеток (например., 200 мкл LPLs) в 96-луночного круглым дном тарелку.
2. Центрифуга при 500 мкг в течение 5 мин при температуре 4 ° С. Декантируют супернатант опрокидыванием планшета.
3. Ресуспендируют клеток в 90 мкл среды RPMI, содержащей 2% FBS и 1: 100 разбавление анти-CD16 / 32 (Fc блок). Инкубировать в течение 10 мин при температуре 4 ° С.
4. Добавляют 10 мкл PBS. Центрифуга при 500 мкг в течение 5 мин при температуре 4 ° С. Декантируют супернатант опрокидыванием планшета.
5. Ресуспендируют клеток в 250 мкл PBS. Центрифуга при 500 мкг в течение 5 мин при температуре 4 ° С. Слить супернатантопрокидыванием планшета.
6. (Необязательно) Пятно клетки с жизнеспособностью красителя, при желании, следуя протоколу производителя.
7. Ресуспендируют клеток в 100 мкл 1% -ного формалина, чтобы зафиксировать клетки. Инкубировать в течение 1 ч в темноте при температуре 4 ° С.
8. Добавить 200 мкл PBS. Центрифуга при 500 мкг в течение 5 мин при температуре 4 ° С. Декантируют супернатант опрокидыванием планшета.
9. Ресуспендируют клеток в 250 мкл PBS. Центрифуга при 500 мкг в течение 5 мин при температуре 4 ° С. Декантируют супернатант опрокидыванием планшета.
10. Ресуспендируют клеток в 200 мкл PBS. Анализ клеток с использованием проточного цитометра.

Результаты

Цитометрический анализ одноклеточных суспензий мелких-кишечных лимфоцитов должны давать дискретную популяцию клеток , которые имеют аналогичные вперед и боковое рассеивание характеристики , как и спленоцитов (фигуры 1А и 1В). Лимфоциты могут начинают умирать , если ткань не поддерживается при температуре 4 ° С в течение начальных стадий выделения, в результате чего в популяции лимфоцитов , имеющий более низкую рассеяния вперед и быть более трудно отделить от других эпите...

Обсуждение

Мы представляем протокол для выделения и проточной цитометрии характеристике небольших-кишечных лимфоцитов, в том числе LPLs, IELS и лимфоцитов в полипропиленов. Для тех, кто заинтересован в оценке того, как изменения в микробиоты влияют на тонкой кишки иммунную систему, мы детализируют простые шаги, вовлеченные в горизонтальной передачи организмов между мышей, несущих различные микробиот. Хотя этот протокол фокусируется на тонком кишечнике, процедура одинакова для анализа толстой кишки, с той лишь разницей, что не суще...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Стерильные перчатки	Kimberly-Clark	555092
стерильная клетка для мышей	Innovive	MS2-AD	содержит крышку, дно клетки и подстилку для альфа-дри
Металлическая кормушка	Innovive	M-FEED
Бутылка для воды	Innovive	M-WB-300
Держатель для карт	Innovive	CRD-HLD-H
Автоклавируемый грызун чоу (NIH-31M)	Zeigler	4131207530
RPMI medium 1640	Gibco	11875-119
Дитиотрейтол (DTT)	Sigma	D5545-5G
0,5 M EDTA (pH 8,0)	Ambion	AM9262
Фетальная бычья сыворотка (FBS)	GemBio	100-510
Dispase II	Invitrogen	17105-041	концентрация в протоколе основана на уровне активности 1,878 Ед/мг
коллагеназы, тип II	Инвитроген	17101-015	концентрация в протоколе основана на уровне активности 245 ЕД/мг
Ножницы для препарирования	Roboz	RS-5882
Игла для кормления (18 г, длина 2")	Roboz	FN-7905
10 мл Шприц	BD	305482
PBS	Gibco	14190-250
Одноразовый скальпель (15 лезвий)	Miltex	4-415
Изогнутые щипцы	Roboz	RS-5211
Прямые щипцы	Roboz	RS-5132
Многоцелевые чашечки, 120 мл	VWR	89009-662
Мешалка	VWR	58949-062
Многопозиционная мешалка, 9-позиционная	VWR	12621-048
Нержавеющая сталь коническая ситечко, 3 дюйма	RSVP
1,5 мл Туба	Eppendorf	0030 125.150
100 μ m Сетчатый фильтр	Falcon	08-771-19
40 μ m Клеточное ситечко	Falcon	08-771-1
50 мл Коническая трубка	Falcon	352098
1 мл Шприц	BD	309659
96-луночный планшет, круглое дно	Corning	3799
Anti-mouse CD16/32 (Fc блок)	Biolegend	101320
(опционально) Изменяемая жизнеспособность красителя eFluor 780	eBiosciences	65-0865-18
10% формалин, нейтральный буферизированный	Thermo Scientific	5725