Создание установки с высокой пропускной способностью для скрининга малых молекул, которые модулируют с-ди-GMP Передача сигналов в Синегнойной

Summary

В данной статье описывается анализ высокой пропускной способностью, которая была успешно создана для скрининга больших библиотек малых молекул для их потенциальной способности манипулировать клеточные уровни циклического ди-GMP в синегнойной палочки, обеспечивая новый мощный инструмент для антибактериальной обнаружения наркотиков и соединения тестирования.

Abstract

Устойчивость бактерий к традиционным антибиотикам привела исследовательские попытки определить новые цели наркотиков в недавно обнаруженных регуляторных путей. Регуляторные системы, которые используют внутриклеточного циклического ди-ГМФ (C-ди-ГМФ) в качестве вторичного мессенджера один такой класс цели. с-ди-GMP является сигнальной молекулой найти почти все бактерии, которая действует для регулирования широкий спектр процессов, в том числе устойчивость к антибиотикам, образование биопленки и вирулентность. Понимание того, как с-ди-ГМФ сигнализации средства управления аспекты антибактериальной развития устойчивостью биопленок предложил подходов, которые позволили изменение клеточных концентраций нуклеотида или нарушения этих сигнальных путей может привести к уменьшению образования биопленки или повышенной восприимчивости биопленок к антибиотикам. Мы опишем простой протокол с высокой пропускной способностью bioreporter, на основе зеленого флуоресцентного белка (GFP), экспрессия которого находится под контролем промотора отзывчивым с-ди-ГМФ CDRA, Чтобы быстро экранировать для малых молекул с потенциалом модулировать клеточные уровни с-ди-GMP в синегнойной палочки (синегнойной). Этот простой протокол может экранировать вверх 3500 соединений в течение 48 часов и имеет возможность быть адаптирован к нескольким микроорганизмам.

Introduction

Быстрое развитие бактериальной резистентности против клинически значимых антибиотиков является одной из основных проблем в настоящее время сталкивается специалистов в области здравоохранения во всем мире. Эта неудача традиционных антибиотиков привела новые поиски химического вещества , которые могут препятствовать бактериальных процессов , вовлеченных в вирулентности и прогрессирования заболевания ^1. Одним из таких регуляторная система , которая использует внутриклеточный вторичный мессенджер циклический ди-GMP (с-ди-GMP) в последнее время стали мишенью с многообещающей действия ^2-4. Установлено , что эта глобальная вторая молекула мессенджер сигнала регулирует многие функции , включая устойчивость к антибиотикам, адгезии, образования биопленки и болезнь ^2-4.

Теперь понял, что клеточный уровень с-ди-ГМФ в бактериальной клетке контролируется синтезом и деградацией в результате чего две молекулы ГТФ используются для синтеза с-ди-ГМФ по GGDEF домен-содержащих diguanylate циклаз (РСК), КНereas Деградация C-ди-ГМФ катализируется фосфодиэстеразы (ФДЭ-ферменты), которые имеют либо ОУД или домен HD-Gyp (обзор в (3, 5)). Белки , содержащие эти домены часто содержат другие сигнальные домены, предполагая , что их активность в обороте с-ди-GMP регулируется либо непосредственно , либо опосредованно с помощью окружающей среды или клеточных репликами ^3,5. Следовательно, с-ди-ГМФ сигнализации функций, чтобы связать зондирования различных экологических репликами с изменениями в бактериальной фенотипа. C-ди-ГМФ оказывает свое регулирующее действие на бактерии на уровне транскрипции, после транскрипции и посттрансляционной различными механизмами ^4.

Большое влияние с-ди-ГМФ во многих бактериальных клетках, в определении бактериальной "образу жизни" и, в частности, при контроле переходов между подвижными планктонных клеток и скального клеток, прикрепленных к поверхности или организованных в многоклеточных структурах биопленок ^3,5. В общем, высокий клеточныйуровни С-ди-GMP связаны с образованием биопленок и sessility, в то время как низкие клеточном уровнях стимулировать перистальтику и синтез фактора вирулентности во многих бактериальных патогенов ^3,5. Таким образом, более детальное знание выработок сигнализации с-ди-GMP может позволить стратегии для ингибирования образования биопленки и вирулентность в бактериальных патогенов. Это сложная задача , учитывая , что большинство бактериальных геномов кодируют многочисленные белки с GGDEF, EAL и / или HD-Gyp доменов (например , П. палочки имеет более 40 белков) и несколькими эффекторами ^6,7.

Тем не менее, даже с этой сложностью, последние данные свидетельствуют о том , что стратегии манипулирующих сигналов C-ди-ГМФ , могут быть разработаны , чтобы либо предотвратить резистентные к антибиотикам инфекции развивается или сделать их восприимчивыми к иммунной системе или эффективного лечения совместным введением классических антибиотиков ^2. В соответствии с этим, было экспериментально показано, что искусственное снижениевнутриклеточного с-ди-GMP в экстракорпорального -grown P. палочки приводит к уменьшению образования биопленки и повышенная восприимчивость к противомикробных, в то время как P. аеги -developed биопленок на силиконовых имплантатов, расположенных в брюшной полости мыши, могут быть рассредоточены подобным способом ^8-11.

Здесь мы описываем высокую пропускную способность , флуоресценция на основе анализа репортера для скрининга малых молекул , которые потенциально могут модулировать клеточные уровни C-ди-GMP в P. палочки (рис 1). Анализ основан на измерении C-ди-ГМФ клеточном уровнях с использованием ранее разработанной GFP репортер, экспрессия которого транскрипционно связана с C-ди-ГМФ реагирующих CDRA промотора ^12. Этот протокол описывает методику для экспрессии репортерной конструкции в P. штамм палочки интерес, соединение подготовка пластины, культуры прививка в 384-луночные планшеты, условия роста, как мыLL также подробную информацию в отношении сбора данных, управления и анализа (рисунок 1). В целом, этот протокол поможет исследователям определить потенциально новых соединений ориентации с-ди-ГМФ сигнализации бактерий, а также для использования в научных исследованиях целью понимания биологии P. палочки.

Protocol

Примечание: Процедуры клонирования и трансформации очищенного репортер плазмиды с-ди-GMP обсуждаются в другом месте ^12.

1. Генерация GFP с меткой с-ди-GMP Reporter P. Штамм палочки

1. Инокулируйте 5 мл лизогении бульона (LB) среду с одной колонии P. палочки и инкубировать в течение ночи при 37 ° C при встряхивании со скоростью 200 оборотов в минуту.
2. Передача 2 мл ночной культуры в 200 мл свежей среды LB в 1-литровую колбу и инкубировать при 37 ° C при встряхивании со скоростью 200 оборотов в минуту.
3. Монитор оптической плотности при длине волны 600 нм (OD ₆₀₀₎ каждые 30 мин путем отбора пробы 1 мл из колбы и исследовать с помощью спектрофотометра (как было описано ранее ^12).
4. Когда OD ₆₀₀ достигает от 0,3 - 0,5, место 40 мл культуры в 50 мл коническую центрифужную пробирку.
5. Гранул клетки центрифугированием при 8000 оборотах в минуту в течение 10 мин при температуре 4 ° С, отбросить супернатант и ге-суспендирования клеток в 40 мл охлажденного на льду, стерильный, 300 мМ раствор сахарозы.
6. В пробирке осадка клеток во второй раз с помощью центрифугирования, как описано на стадии 1.5, и вновь приостановить в 20 мл охлажденного на льду, стерильный, 300 мМ раствор сахарозы.
7. В пробирке осадка клеток в последний раз центрифугированием, как описано на стадии 1.5, и вновь приостановить в 400 мкл охлажденного на льду, стерильный, 300 мМ раствор сахарозы.
   Примечание: Плотность клеток в этой точке должно быть приблизительно 1 х 10 ¹¹ колониеобразующих единиц на миллилитр (КОЕ / мл).
8. Охладить клетки на льду в течение 30 мин, после чего они готовы к электропорации.
9. Добавить 1 мкл плазмиды ¹² раствора 0,2 мкг / мкл pCdrA :: GFP ^C до 40 мкл P. палочка электрооптические компетентные клетки , полученный выше в микроцентрифужных трубки 1,5 мл , который был предварительно охлажденным на льду. Смешайте суспензии и переносят в предварительно охлажденные, 2 мм расстояние между электродами, кювету для электропорации.
   Примечание: pCdrA :: GFP C: pUCP22Not-P _CDRA -RBSII- GFP (Mut3) -T ₀ -T _1, Amp ^г Gm ^г, что дает флуоресцентное считывание внутриклеточного уровня с-ди-GMP в P. штаммы палочка, была разработана и подтверждено Rybtke и др. ^12.
10. Удаления влаги с наружной стороны кювета с папиросной бумагой и поместить кювету в отборную камеру электропоратора. Импульсный с напряжением 2,5 кВ, емкости 25 мкФ и сопротивление 200 Ом.
11. Удалите кювету и добавляют 1 мл LB среды. Затем перенесите клетки в стерильном 1,5 мл микроцентрифужных трубки и инкубировать в течение 2 ч при 37 ° C при встряхивании со скоростью 200 оборотов в минуту.
12. Спред 10 мкл, 50 мкл и 100 мкл аликвоты культуры на стерильные LB-чашках с агаром, дополненной ампициллином (в концентрации 100 мкг / мл), и инкубировать пластин при 37 ° С в течение ночи.
13. Подтвердите выражение GFP (excitatiна при 485 нм, эмиссия при 520 нм), исследуя пластину под флуоресцентным микроскопом со стандартным каналом GFP и выбрать одну колонию для инокуляции 5 мл LB. Выдержите в течение ночи, как описано в пункте 1.1. Смешать 0,5 мл ночной культуры с 0,5 мл 50% глицерина в 2 мл с завинчивающейся крышкой трубки и хранят при -80 ° С.

2. Подготовка закваски для инокуляции

1. За два дня до экрана, плиты П. палочки штамм (содержащий pCdrA :: GFP ^С плазмидой) , от -80 ° C на складе с LB-агаром (с добавлением ампициллина в концентрации 100 мкг / мл), осторожно распространяя бактерии на пластину с помощью стерильной прививка петля. Инкубируйте планшет в течение ночи при температуре 37 ° С.
2. Вечером перед показом, прививают одну колонию P. палочки от пластины в 10 мл LB - среды (с добавлением ампициллина в концентрации 100 мкг / мл) в Tuбыть и инкубировать предварительной культуры в течение ночи при 37 ° C при встряхивании со скоростью 200 оборотов в минуту.
3. В день экрана, подготовить субкультуру из ночной предварительной культуры путем разбавления его сначала со свежей средой LB к OD ₆₀₀ 1,0 , а затем дополнительно разбавляя 5% LB до OD ₆₀₀ 0,04 (1:25 соотношение) ,
   Примечание: Общий объем инокулированной среды зависит от количества пластин, подлежащего испытанию. 5% LB производится путем разбавления 100% LB с фосфатным буферным солевым раствором (PBS) до требуемой концентрации. Важно отметить, что средства массовой информации (5% LB) позволяет конститутивную активацию pCdrA :: Gfp ^C в P. палочки.
4. Добавьте стерильный стержнем магнитной мешалки в контейнер и перемешивать культуру при минимальной скорости на магнитной мешалке в течение 30 мин при комнатной температуре, что позволяет бактерии акклиматизироваться в средствах массовой информации, прежде чем они разливают в 384-луночные планшеты.

3. Посев и инкубация из 384-луночные планшеты, содержащиеМалые молекулы

Примечание: Стерильность и хорошие асептические методы имеют огромное значение для следующих шагов.

1. Для получения положительного контроля (100% ингибирования), добавьте 20 мкл тобрамицина сульфата (25 мг / мл) до 10 мл (адекватная до 12 пластин) субкультуры, полученного на стадии 2.3 и аккуратно перемешать. Внесите 40 мкл положительной контрольной культуры в лунки А23 - P23 (Рисунок 2).
2. Для получения отрицательного контроля (0% ингибирования), добавляют 30 мкл диметилсульфоксида (ДМСО) до 10 мл (адекватная до 12 пластин) субкультуры, полученного на стадии 2.3 и аккуратно перемешать. Пипетка 40 мкл негативной контрольной культуры в лунки А24 - Р24 (рисунок 2).
3. Для каждой из пластин штампованными с малыми молекулами, прививают объемом 40 мкл разбавленных ночных культур (описанных в пункте 2.3) в лунки А1 - Р22 (рисунок 2).
   Примечание: Это может быть достигнуто с помощью жидкостного обработчика разбойничатьВЗ. Из-за неоднородности свойств бактериальных культур, важно поддерживать постоянный и умеренное волнение, чтобы держать бактерии последовательно распределенные в средствах массовой информации во время отпуска. Для этого, продолжайте перемешивание акклиматизировались культуру со стадии 2.4 магнетически во время выдачи.
4. Уплотнение пластин со уплотнение крышки воздухопроницаемого и инкубировать в течение 6 ч при 37 ° С.
   Примечание: воздухопроницаемой уплотнение имеет решающее значение для поддержания неизменных условий во всех 384 скважин и обойти потенциальное развитие кислородных градиентов через пластину.

4. Измерение роста (OD ₆₀₀₎ и внутриклеточного с-ди-GMP уровня (GFP)

1. Приблизительно за 30 минут до спектрофотометрических измерений, предварительно подогреть ридере до 37 ° С, чтобы избежать конденсации влаги.
2. Осторожно удалите воздухопроницаемый уплотнение крышки перед чтением. Измеряют оптическую плотность при длине волны 600 нм с установкой 10 вспышек на лунку иосадительную время 0,2 сек.
3. До начала измерения флуоресценции, сделать автоматический коэффициент усиления и регулировки фокусного на основе хорошо A24 (отрицательный контроль) и установите целевое значение коэффициента усиления на уровне 75% (рисунок 2).
   1. От управляющего программного обеспечения для считывания планшетов, нажмите на измерения начальной и нажать на '' Фокус и регулировки усиления / Пластинчатые идентификаторы 'Вкладка'.
   2. Выберите '' Регулировка фокуса '' и '' Channel A '' справа на окне.
   3. Выберите '' настройки усиления '' и '' Selected хорошо '' и введите '' 75 '' как '' Целевое значение ''. И, наконец, выбрать хорошо A24 в макете пластины, прежде чем нажать на '' Пуск Настройка ''. После того, как регулировка осуществляется, нажмите на '' Start измерения ''.
   4. Измерьте флуоресценции от GFP репортера на максимумами возбуждения / испускания 485/520 нм с установкой 10 вспышек на лунку и settliнг время 0,2 сек.
4. Сбор данных из всех исследованных пластин. Примечание: чтения данных автоматически сохраняются по умолчанию в программном обеспечении пластины управления читателем.
   1. Просмотр показаний, нажав на иконку "Марс" в программном обеспечении управления, чтобы открыть пакет статистического анализа.
   2. Получить данные по "двойным щелчком" на пластине № интереса для доступа к данным для анализа.

5. Анализ данных

1. Оценка однородности и воспроизводимости анализа с использованием анализа Robust Z ', которая является наиболее распространенной метрики качества представленные для экранов с высокой пропускной способностью. Вычислить надежную г ', используя формулу:
   
   Где MAD (медианное абсолютное отклонение) является оценкой стандартного отклонения, р положительный контроль (100% ингибирования) и п отрицательный контроль (0% ингибирования) для обоих OD ₆₀₀ и GFP Values. Примечание: анализ с прочном значение Z (рассчитано как для OD ₆₀₀ и GFP необработанных данных) больше или равно 0,5, считается отличным анализом.
2. Подсчитайте% -ное ингибирование роста по формуле:
   
   Где Xi _OD600 является итерированным значение OD ₆₀₀ каждого образца хорошо. % Ингибирования _OD600> 0, ингибитор роста; % Ингибирования _OD600 <0, стимулятора роста.
3. Оценка% ингибирование внутриклеточного уровня с-ди-ГМФ с использованием формулы (изменение в единицах интенсивности флуоресценции произвольной корректируются для изменения плотности клеток):
   
   Где Xi _GFP является итерированным значение GFP каждого образца хорошо. % Ингибирования _GFP> 0, ингибитор с-ди-GMP; % &# 160; ингибирование _GFP <0, с-ди-GMP промотор.
4. Установить порог для обнаружения попадания в 3 Обезумевший от медианы (медиана ± 3 MAD), рассчитано из образца хорошо для чтения минусами каждой пластины, предполагая нормальное распределение данных точек. Примечание: Тем не менее, ± 50% ингибирование отсечка могут быть выбраны для более точных и воспроизводимых анализов ответа на дозы при необходимости.

Results

Описанный здесь подход позволяет одному исследователю эффективно и успешно экранировать в среднем 3500 соединений в течение 48-часового периода. Обзор протокола высокопроизводительного скрининга проиллюстрирован как блок - схемы на рисунке 1. Для данной статье, мы протестировали правило, из пяти совместимых библиотеки соединений для потенциальных модулирующих соединений с-ди-ГМФ в конечной концентрации 600 мкМ , Тем не менее, существует много коммерчески доступных наркотиков, как и немедикаментозных как составные наборы, которые могут быть использованы в анализе. Эти наборы могут быть бактерии, ориентированные соединения или случайные объединенные соединения, но каждая библиотека бы основывается физико-химические свойства и характеристики, присвоенные такие как набор экранированных здесь, которые имели полярные функциональные группы и несколько стереогенных центров. В этом протоколе бактерии инокулируют в пластину вместе с соединениями, антибиотик и положительный контроль ДМСО автомобиляуправления, в соответствии со схемой , показанной на рисунке 2. На рисунке 3 приведены результаты первичного скрининга на примере одной библиотеке пластины. Представитель OD ₆₀₀ и GFP необработанные данные представлены на фигуре 3А и 3В соответственно. Градиент цвета тепловой карты, с горячей (красный) для охлаждения (зеленый) цвета , указывающие на низкой до высокой OD ₆₀₀ значений / GFP, был применен к значениям а. Тепловые карты были созданы в программном обеспечении электронных таблиц путем применения 3-цветовой гаммы условного форматирования , охватывающую от самого низкого OD ₆₀₀ / GFP считывания до самого высокого OD ₆₀₀ / GFP считывание. Низкая OD ₆₀₀ и GFP значения относительно отрицательного контроля ДМСО соответствуют торможению роста и уровня C-ди-ГМФ , соответственно, в то время как высокие значения относительно отрицательного контроля ДМСО соответствуют повышение в росте и уровней С-ди-ГМФ соответственно , Значения робастном Z 'для OD ₆₀₀ и GFP аре рассчитывается по формуле, приведенной в протоколе (5.1). Поскольку они оба выше 0,5 (0,694 и 0,761 соответственно), качество анализа было признано надежным и данные были проанализированы далее. % Ингибирование роста (OD ₆₀₀₎ и внутриклеточного уровня с-ди-GMP (GFP) рассчитываются по формулам , предусмотренных в протоколе (5.2, 5.3). Типичные данные представлены на рисунке 4A и 4B соответственно. Градиент цвета тепловой карты, с горячей (красный) для охлаждения (зеленый) цвета, указывающие на низкой к высокой% ингибирования, был применен к значениям а. График рассеяния% ингибирования _{(OD600 / GFP)} из отдельных скважин , основанных на первичном экране показана на рисунке 5А и 5В для OD ₆₀₀ и данных GFP соответственно. А ± 50% отсечка (обозначены пунктирными линиями) выбирается для обнаружения попадания. Потенциальные хиты, основанные на этом отсечкой обозначены красными точками. Два типа соединений, представляющих интерес может быть discerned из анализа. Удар , идентифицированные на фиг.5А представляют собой соединения , которые ингибируют рост бактерий, в то время как удары , обозначенных на рисунке 5В представляют собой соединения , которые потенциально обладают способностью модулировать внутриклеточные уровни с-ди-ГМФ. Два соединения были идентифицированы в качестве репрезентативных совпадений для данного анализа. Это соединение А, потенциальный ингибитор роста и соединение В, потенциальный ингибитор с-ди-ГМФ. Соединение А соответствует хорошо Р8 на рисунках 3 и 4 , и имел 72,5% -ное ингибирование роста. Был ожидаемый соответствующее торможение в циклических уровней ди-GMP. Соединение B соответствует хорошо К3 на рисунках 3 и 4 , и имел 61% -ное ингибирование в циклических уровней ди-ГМФ без изменения роста. Выбор хит соединения были дополнительно протестированы с помощью анализа доза-реакция 10-балльной системе с максимальной концентрации 2 мМ и двукратным серии разведений. Значения IC ₅₀ рассчитываются на основе доза-ответКривые (рис 6A и В).

Рисунок 1. Обзор: Высокая пропускная способность установки для скрининга малых молекул на предмет их способности модулировать клеточном уровнях с-ди-GMP в P. палочки. Этот краткий обзор показывает , шаг за шагом представление протокола , используемого в данном анализе. Бактериальная колония P. палочки выращивают в течение ночи в LB закваски. С помощью дозатора реагента, клетки высевали в 384-луночные планшеты, содержащие выбранные соединения. Планшеты инкубируют в течение 6 часов, после чего значения OD ₆₀₀ и GFP измеряются. Используя эти чтения аутов, соединения , которые влияют на клеточные уровни с-ди-GMP могут быть идентифицированы. Пожалуйста , нажмите здесь для просмотраБольшая версия этой фигуры.

. Рисунок 2. 384-луночного планшета Карта Используется для низкомолекулярное Screening Assay Соединения из библиотеки (светло - синий) аликвоты в лунки А1 - Р22. "Положительный контроль" (красный), состоящий из конечной концентрации 50 мкг / мл тобрамицина сульфата добавляется в лунки А23 - P23 и "отрицательного контроля" (зеленый), содержащий конечную концентрацию ДМСО добавляется в лунки А24 - 1% P24. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3. Представитель Результаты для одного 384-луночного скрининга пластины. Representative исходные данные для OD ₆₀₀ (А) и GFP (В). Градиент цвета тепловой карты, с горячей (красный: OD ₆₀₀ = 0,65 или GFP = 250000) для охлаждения (зеленый: OD ₆₀₀ = 0,10 или GFP = 40000) цвета , указывающие на низких до высоких значений, был применен к значениям а. Скважины , которые имеют более низкую OD ₆₀₀ / GFP показаний относительно отрицательного контроля ДМСО будет иметь тенденцию быть в красном цвете в то время как скважины , которые имеют более высокие OD чтениях ₆₀₀ / GFP относительно контроля ДМСО будет иметь тенденцию быть зеленым. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы увидеть увеличенную версия этой фигуры.

Рисунок 4. Представитель Результаты поиска по запросу Процент ингибирования Рассчитано для 384-луночного планшета. Анализируемые данные% ингибирования представлены для обоих ОП ₆₀0 (А) и GFP (B) для чтения выходов. Градиент цвета Теплокарта, с горячей (красный: OD ₆₀₀ = -150% или GFP = -20%) для охлаждения (зеленый: OD ₆₀₀ = 100% или GFP = 100%) цвета указывает на низких до высоких значений ингибирования, было применяется к значениям а. Малые молекулы, которые потенциально препятствуют росту и внутриклеточного с-ди-GMP будет иметь тенденцию быть зеленым цветом то время как малые молекулы , которые потенциально способствуют росту и внутриклеточные уровни с-ди-GMP будет иметь тенденцию быть красным. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5. Представитель Scatter участки для% ингибирования _{(OD600 / GFP)} , полученные от каждого протестированного малого молекулы. Каждая малая молекула представлена ​​точкой и распределения% ингибированиядля каждого из OD ₆₀₀ (A) и GFP (B) для чтения выходов показан. А ± 50% отсечки выбран для идентификации хит. Потенциальные хиты выделены красным цветом. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 6. Представитель Результаты от дозы. - Ответ Пробирной Два соединения (потенциальный ингибитор роста А и потенциал с-ди-GMP ингибитор B) , идентифицированные из предыдущих экранов дополнительно испытаны в анализе доза-реакция 10 точки с максимальной концентрацией 2 мМ и двукратное разведение серии. Установка четырех параметров логистической функции с данным IC ₅₀ дали значения 158 мкМ и 193 мкМ соответственно. Плеаза нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Discussion

С целью улучшения лечения бактериальных инфекций, то ясно, что лучшее понимание бактериального поведения на молекулярном уровне регулирования требуется. Процедура, описанная здесь, будет полезно для микробиологов, биохимиков и врачей, которые хотят раскрыть маленькие молекулы, которые имеют потенциал, чтобы манипулировать или препятствовать клеточных концентраций с-ди-GMP у бактерий. Метод использует недавно разработанный GFP bioreporter для мониторинга клеточных уровней с-ди-ГМФ в P. ¹² палочки. Это bioreporter было подтверждено и показано, главное, чтобы не влиять на рост штамма, используемого при культивировании в 5% LB в PBS. Использование экрана цельноклеточной , чтобы идентифицировать небольшие молекулы , которые изменяют уровни C-ди-ГМФ в естественных условиях позволяет преодолеть серьезные трудности обнаружения лекарств целевой основе с точки зрения молекулы проникновения через бактериальные мембраны, в частности , через те из грамотрицательных бактерий , Важно отметить, что тон анализ оказывается очень надежен, как надежный г 'значения стабильно выше 0,5 наблюдалось во всех экранах на сегодняшний день. Скрининг с использованием этого протокола позволит выявить ряд небольших молекул , которые ингибируют и / или способствуют внутриклеточные уровни с-ди-GMP в P. палочки. Кроме того, этот анализ также имеет потенциал для выявления бактерицидными или бактериостатическими соединений приводит к уменьшению в OD ₆₀₀ считывания.

Хотя это и не обсуждается в разделе протокола, существует несколько важных соображений для подготовки эксперимента. Очень важно иметь в виду, что GFP bioreporter основано на плазмиде. Несмотря на то, плазмида репортера , как известно, очень стабильна в P. палочки, она может быть потеряна после непрерывного повторного посева, поэтому необходимость в использовании свеже плакированные штаммов от -80 ° C раствора в глицерине, и проверка выражения флуоресценции имеет решающее значение. Кроме того, очень ценно для поддержания одинаковых условий роста по всему экранупоскольку любые колебания в этих условиях может иметь эффект домино на экране. Это будет включать в себя убедившись, что средства массовой информации и антибиотики Premade в пакетном режиме и используется на протяжении всего экрана. Бактериальные культуры не растут ( на основе OD ₆₀₀ для чтения макроизгибом) единообразно является общей проблемой для большинства высокопроизводительных экранов такого рода. Это может быть из-за краевых эффектов и отпуску неоднородную бактериальной культуры в планшеты. Для первых, убедившись, что газ проницаемым для уплотнения используется во время инкубации имеет жизненно важное значение. В то время как для последнего, грунтовки жидкости трубки обработчика с объемом культуры, по крайней мере в три раза рекомендуется мертвый объем самой трубки. Крайне важно, чтобы держать магнитной мешалки при минимальной скорости во время дозирования. В процессе мониторинга и хранения 384-луночные планшеты для последовательного роста в ходе экспериментов имеет первостепенное значение, ситуация, чтобы избежать является укладывание пластинок в процессе инкубации, поскольку это может привести к ООНхотел кислородные градиенты, приводящие к перекосу в структуре роста. Важно также, чтобы гарантировать, что транспортное средство ДМСО использовали в качестве отрицательного контроля не негативного влияния роста штамма интереса. Многие из этих проблем, связанных с ростом можно избежать, выполняя имитацию экран с бактериальным штаммом процентов до скрининга. Интерпретация данных также заслуживает внимания, учитывая, что результаты по ингибированию с-ди-ГМФ вычисляются по изменению в произвольных единицах интенсивности флуоресценции, которые должны быть исправлены для изменения плотности клеток. Имея это в виду различные математические формулы для оценки вывода данных из этих экспериментов, также следует учитывать. Например, соединение может выступать в качестве ингибитора с-ди-ГМФ, но на самом деле является ингибитором роста, или наоборот, что требует осторожную интерпретацию выявленных попаданий.

Есть несколько недостатков и ограничений, которые необходимо учитывать при разработке и выполнении этогос высокой пропускной способностью на основе клеток экран. Например, био-репортер функции на косвенной мерой клеточных уровней С-ди-ГМФ с использованием флуоресцентного зонда, чьи свойства обнаружения потенциально могут оказывать влияние малых молекул, используемых в экране. Тангенциальный проблема заключается в том, что анализ на основе клеток не дает никакой информации о механизме за изменений в уровне внутриклеточного с-ди-ГМФ. Поэтому важные наблюдения из экспериментов должны быть подтверждены с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии подход, который считается метод "золотым стандартом" для измерения внутриклеточных колебаний с-ди-GMP бактерий. Кроме того, наша процедура может предоставить только информацию о поведении бактерий , выращенных в лабораторных условиях , как бактериальные клетки , выращенные в контексте хозяина (в естественных условиях) быстро изменять свою деятельность в связи с этой средой. Кроме того, процесс использования GFP bioreporter означает, что экран не принимаетво внимание физиологическое состояние бактериальных клеток. Тем не менее, этот протокол может быть адаптирован для микроскопического наблюдения отдельных скважин в процессе экрана.

Даже с этими соображениями и ограничениями, это с высокой пропускной способностью анализа по-прежнему надежный экран для небольших молекул, способных мешать внутриклеточных уровней с-ди-GMP. Поскольку многие виды микроорганизмов, включая многих бактериальных патогенов были изучены для того, чтобы охарактеризовать модуляции внутриклеточных уровней с-ди-GMP, наш протокол может быть применен к различным видам бактерий и расширили к изучению более сложных моделей многовидовые бактерий. Анализ может быть легко оптимизирована для других видов бактерий путем изменения использованы условия роста, или может быть выполнен с возможностью считывания других выходов с использованием различных bioreporters. Различные периоды инкубации могут быть применены в зависимости от фазы роста интереса. Тем не менее, при расширении или увеличении сквозной говоря, это importan т иметь в виду, что бактерии будут по-прежнему будет расти в процессе подготовки пластин и измерений считыванием. Поэтому рекомендуется экранировать максимум 15 пластин в то время, используя этот протокол. Кроме того, с помощью пластин с более чем 384 скважин не может позволить равномерный рост, что требует дальнейшей оптимизации. При сворачивают количество пластин, может быть более целесообразным, чтобы вручную прививают с помощью электронного пипетку вместо робота обработки жидкости. Понятно, что этот протокол может быть использован для исследования малых молекул, которые диспергируют биопленок, при условии, что анти-биопленки соединений вмешиваться сигнализации с-ди-ГМФ. Протокол также может быть переработана, чтобы понять различные аспекты бактериальной физиологии. Принимая во внимание, что передача сигналов с-ди-GMP преобладает в большинстве бактерий, изучая физиологиях этих организмов с помощью этого протокола мы можем идентифицировать различные химические стимулы, чтобы определить, требуется ли их рабочие механизмы сигнализации с-ди-GMP.

_content "> Таким образом, надежность и универсальность подхода, представленного в данном протоколе будет способствовать идентификации химических модуляторов передачи сигналов с-ди-ГМФ во многих биологических системах.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Лизогенный бульон (Леннокс)	Сигма Олдрич	L3022-1КГ
сахароза	Сигма Олдрич	S0389-1КГ
Лизогенный бульон с агаром (Леннокс)	Сигма Олдрич	L2897-1КГ
Ампициллин натрия	Сигма Олдрич	A0166-25G
Глицерин	Сигма Олдрич	G5516-1Л
Фосфат буферизованный Физиологический раствор, pH 7,4	Life technologies	10010-056
Тобрамицина сульфат	Sigma Aldrich	T1783-100MG
Диметилсульфоксид (ДМСО)	Sigma Aldrich	276855-250ML
Genesys 10S UV-Vis спектрофотометр	Термонаучный	840-208100
Электропоратор с зазором 2 мм Кювета	Bio-Rad	1652092
Электропоратор BioRad GenePulser XCell	Bio-Rad	1652662
Флуоресцентный стереомикроскоп Leica	Microsystems	MZ16FA
BRAND магнитная мешалка, ПТФЭ, цилиндрическая с шарнирным кольцом (стерилизовать автоклавированием перед использованием)	Sigma Aldrich	Z328952-10EA
384-луночная, белостенная, пластины с прозрачным дном	Greiner	781098
Multidrop Combi дозатор реагентов	Thermo Scientific	5840300
Multidrop Combi трубка	Thermo Scientific	24073290
VIAFLO II 16-канальная электронная пипетка	Integra Biosciences	4642
100 мл стерильные одноразовые резервуары для реагентов	Fisher Scientific	12399175
AeraSeal воздухопроницаемые мембраны	Sigma Aldrich
Считыватель пластин Pherastar (Версия ПО: 4.00 R4, Версия прошивки: 1.13)	BMG Labtech	Pherastar FS