Протокол для функциональной оценки цельного белка Насыщенность мутагенеза библиотек Использование высокого секвенирования

Краткое содержание

Мы представляем протокол для функциональной оценки комплексных библиотек мутагенеза насыщения Одноузельная белков с использованием высокой пропускной последовательности. Важно отметить, что этот подход использует ортогональные пары праймеров мультиплекс библиотека строительства и последовательности. Представитель результаты с использованием TEM-1 бета-лактамазу, выбранный при клинически значимой дозы ампициллина предоставляются.

Аннотация

Сайт-направленный мутагенез уже давно используется в качестве метода изучения структуры, функции и эволюции белка. Последние достижения в технологии массивно-параллельного секвенирования открыли возможность оценки функциональных эффектов или эффектов приспособленности большого числа мутаций одновременно. В данной работе мы представляем протокол для экспериментального определения эффектов всех возможных мутаций одной аминокислоты в интересующем белке с использованием технологии высокопроизводительного секвенирования, используя в качестве примера фермент TEM-1 β-лактамазу с устойчивостью к антибиотикам из 263 аминокислот. В этом подходе с помощью сайт-направленной мутагенной ПЦР создается библиотека мутагенеза с насыщением всего белка, рандомизируя каждую позицию индивидуально по всем возможным аминокислотам. Затем библиотека преобразуется в бактерии и отбирается за способность придавать устойчивость к β-лактамным антибиотикам. Эффект приспособленности каждой мутации затем определяется путем глубокого секвенирования библиотеки до и после отбора. Важно отметить, что этот протокол вводит методы, которые максимизируют глубину чтения секвенирования и позволяют одновременно выбирать всю библиотеку мутаций путем смешивания смежных позиций в группы длины, рассчитанные на высокопроизводительную длину чтения секвенирования, и использования ортогональных праймеров для штрихкодирования каждой группы. Репрезентативные результаты с использованием этого протокола получены путем оценки эффектов приспособленности всех мутаций одной аминокислоты в TEM-1 при клинически значимой дозировке ампициллина. Метод должен быть легко распространен на другие белки, для которых используется высокопроизводительный отборочный анализ.

Введение

Мутагенеза уже давно используется в лаборатории для изучения свойств биологических систем и их эволюции, а также для создания мутантных белков или организмов с улучшенными или новыми функциями. В то время как ранние подходы опирались на методы , которые производят случайные мутации в организмах, появление технологии рекомбинантных ДНК позволило исследователям ввести выберите изменения ДНК в сайт-специфической манере, то есть., Сайт-направленный мутагенез ^1,2. С учетом современных методов, как правило , с использованием мутагенных олигонуклеотидов в полимеразной цепной реакции (ПЦР), он относительно легкий , чтобы создавать и оценивать небольшое число мутаций (например., Точечные мутации) в данном гене ^3,4. Это гораздо сложнее, однако, когда цель подходы, например, создание и оценка всех возможных одноузельных (или более высокого порядка) мутации.

В то время как многое узнали из ранних исследований, пытающихся оценить большое количество мutations в генах, методы , используемые часто трудоемкий, например , требующей оценки каждой мутации независимо друг от друга с помощью нонсенс - супрессоры штаммы ^5-7, или были ограничены в количественном способности из - за низкой глубины секвенирование Sanger секвенирования ^8. Методы , используемые в этих исследованиях , были в значительной степени вытеснен методами с использованием высокой пропускной способностью технологии секвенирования ^9-12. Эти концептуально простые подходы влекут за собой создание библиотеки , содержащей большое количество мутаций, подвергая библиотеку на экран или выбора для функции, а затем глубокого секвенирования (то есть., По порядку> 10 ⁶ секвенирования читает) библиотека , полученные до и после выбора. Таким образом, фенотипические или фитнес эффекты большого количества мутаций, представлен как изменение частоты популяции каждого мутанта, можно оценивать одновременно и более количественно.

Ранее мы ввели Simp(т. е, цельного белка мутагенеза насыщения библиотек) ле подход к оценке библиотек всех возможных мутаций отдельных аминокислот в белках, применимый к генам с длиной более , чем последовательности чтения длину ^11,13: Во- первых, каждая позиция аминокислота представляет собой рандомизированное сайт-направленного мутагенных PCR. В ходе этого процесса ген разделен на группы, состоящие из прилежащих позиций с общей длиной размещены путем секвенирования платформы. Мутагенные ПЦР-продукты для каждой группы затем объединяются, и каждая группа независимо друг от друга подвергают селекции и высокой пропускной последовательности. Поддерживая соответствие между расположением мутаций в последовательности и длины последовательности чтения, этот подход имеет преимущество максимизации глубины секвенирования: в то время как можно было бы просто последовательность таких библиотек в коротких окнах без разделения на группы (например, с помощью стандартного дробовика. секвенирование подход), наиболее чтения, полученные бы дикого типа и, следовательно, мajority секвенирования пропускной способности неиспользуемого (например, для целого белка мутагенеза насыщения библиотеки белка кислоты 500 аминокислоты секвенировали в 100 аминокислот (300 пар оснований ) окон, при минимальном 80% читает будет последовательность дикого типа).

Здесь протокол представлен , который использует высокую пропускную способность секвенирования для функциональной оценки целого белка библиотек мутагенеза насыщения, с использованием вышеуказанного подхода (описанной на рисунке 1). Важно отметить, что мы вводим использование ортогональных праймеров в библиотеке процесса клонирования для штрих-кода каждой группы последовательности, которая позволяет им быть мультиплексированы в одну библиотеку, подвергаясь одновременно скрининга или отбора, а затем демультиплексируется для глубокого секвенирования. Так как группы последовательности не подвергаются отбору независимо друг от друга, это снижает нагрузку и гарантирует, что каждая мутация испытывает тот же уровень отбора. ТЕМ-1 β-лактамазы, фермента, который придает устойчивость на высоком уровне дляβ-лактамные антибиотики (например, ампициллин.) в бактерии используют в качестве модельной системы ^14-16. Протокол описан для оценки в целом белка насыщения мутагенеза библиотеки TEM-1 в Е. палочка при отборе на приближенном уровне сыворотки для клинической дозы ампициллин (50 мкг / мл) ^17,18.

Протокол

Примечание: На рисунке 1 контур протокола. Несколько шагов и реагенты в протоколе требуют меры безопасности (помеченные "ОСТОРОЖНО"). Обратитесь к Паспорта безопасности перед использованием. Все шаги протокола выполняются при комнатной температуре, если не указано другое.

1. Подготовить медиакультуры и планшеты

1. Подготовка и стерилизовать автоклавированием 1 л очищенной воды, 100 мл Супер Оптимальное Бульон (Соб; Таблица 1), 1 л Лурии-Бертани бульона (LB; Таблица 2) и 1 л LB-агар (таблица 3). Приготовьте отдельно и стерилизовать по три культуры колбах каждая из которых содержит 1 L LB.
   Примечание: В протокол "вода" относится к автоклава стерилизуют очищенной воды; SOB, LB и LB-агар относятся к автоклава стерилизуют растворами.
2. Приготовьте 12 мг / мл маточного ТЕТ путем растворения 0,12 г тетрациклина гидрохлорида в 10 мл 70% -ного этанола. Стерилизовать через фильтр 0,2 мкм и магазинпри 4 ° С в защищенном от света месте.
3. Прохладный LB-агар до 50 ° С, а затем добавляют 1 мл Tet складе (конечная концентрация 12 мкг / мл Tet). Разлить в чашки Петри и охлаждаться при комнатной температуре в защищенном от света месте. Хранить при температуре 4 ° С в защищенном от света месте.

2. Построение полного гена Насыщенность мутагенеза Library

Примечание: Грунтовки; законченные ДЗП, дайджесты ограничение и лигатуры; и очищенных ДНК-образцов можно хранить при -20 ° С.

1. Проектирование мутагенеза праймеров
   1. Для mutagenize каждой позиции аминокислоты для всех возможных аминокислот, разработать пару комплементарных мутагенных праймеров (смысл / вперед и антисмысловой / назад) для каждой позиции аминокислоты со следующими принципами:
      1. Замены кодон, соответствующий аминокислоте быть мутагенезу путем NNS (где N представляет собой смесь всех четырех нуклеотидных оснований и S представляет собой смесь цитозина (С) и гуанин (G)), и центр в чопорнаяэр, по бокам приблизительно на 15 нуклеотидов с каждой стороны.
      2. Убедитесь , что 5 'и 3' концы заканчиваются в C или G , и что температура плавления _(Тпл) составляет приблизительно 70 ° С ^3. С помощью вычислительной NNS_PrimerDesign.m сценария (см Дополнительный файл кода) для разработки NNS мутагенеза праймеров в соответствии с этими рекомендациями.
   2. Заказать праймеры из коммерческого источника. Для удобства использования, которые их синтезируют в формате 96-луночного планшета и предварительно разведенные в воде до 50 мкм, с одним набором пластин, содержащих смысл мутагенеза праймеров и еще антисмысловой праймеры.
   3. Наполните пипетку резервуар с водой и использовать многоканальную пипетку для переноса 95 мкл до 263 скважин в течение трех 96-луночных планшетах. Развести Праймеры в 20 раз до 2,5 мкм с помощью многоканальной пипетки для передачи по 5 мкл из 96-луночные планшеты, содержащие смысловой мутагенеза праймеров к родственным лунки планшетов, содержащих воду.
   4. Повторениешаг протокола 2.1.3 для разбавления антисмысловой мутагенеза праймеров.
2. Синтез НМВ подбиблиотек для каждой позиции аминокислотной последовательности с двухстадийной ПЦР сайт-направленного мутагенеза
   1. Выполните первом раунде мутагенные МКП. Для каждого праймера мутагенеза, готовят 25 мкл ПЦР-реакции с использованием pBR322_AvrII плазмиды в качестве матрицы и праймеров AatII_F или AvrII_R (смысловой мутагенеза праймеров в паре с праймером AvrII_R и антисмысловых праймеров мутагенеза спаренными с праймером AatII_F; в общей сложности 526 ДЗП). Таблицу материалов для AatII_F и AvrII_R последовательностей.
      1. Подготовка ПЦР "мастер - микс" путем добавления реагентов из таблицы 4 в конической трубе 15 мл. Переложить в пипетку бассейна. Используйте многоканальную пипетку для переноса 15 мкл до 263 скважин в течение трех 96-луночных ПЦР планшет. С помощью многоканальной пипетки для передачи по 10 мкл из 96-луночные планшеты, содержащие разбавленные смысл мутагенеза праймеров к родственным скважин Iп планшеты ПЦР.
      2. Накройте каждую пластину ПЦР с уплотнительной пластины 96-луночного. Центрифуга при 200 х г в течение 2 мин.
      3. Передача пластин ПЦР в амплификатор и запустить следующую программу: 98 ° C в течение 30 секунд; 20 циклов: 98 ° C в течение 10 сек, 55 ° С в течение 20 сек, 72 ° С в течение 1 мин; 72 ° С в течение 2 мин; держать при температуре 4 ° С.
      4. Повторите шаги протокола 2.2.1.1 - 2.2.1.3 для 96-луночные планшеты, содержащие разбавленные антисмысловых праймеров мутагенеза.
   2. Выполнение второго круга мутагенные МКП. Для каждой позиции аминокислоты, готовят 25 мкл ПЦР-реакции с использованием праймеров AatII_F и AvrII_R, а также смешанный и разводили в первом раунде мутагенных продуктов ПЦР в качестве матрицы (всего 263 ДЗП).
      1. Наполните пипетку резервуар с водой и использовать многоканальную пипетку для передачи 198 мкл до 263 скважин в течение трех 96-луночных планшетах.
      2. Комбинирование и разбавить в 100 раз мутагенных PCR продукты для каждой позиции аминокислотной последовательности с использованием многоканальной пипеткиПервая передача 1 мкл из 96-луночных ПЦР-планшеты, содержащие ПЦР-продуктов в результате смысле мутагенеза праймеров к родственным лунки планшетов, содержащих воду. Затем повторите передачу для ПЦР-продуктов в результате антисмысловых праймеров мутагенеза.
      3. Подготовка ПЦР "мастер - микс" путем добавления реагентов из Таблицы 5 к конической трубе 15 мл. Переложить в пипетку бассейна. С помощью многоканальной пипетки для передачи 24 мкл до 263 скважин в течение трех 96-луночных ПЦР планшет. С помощью многоканальной пипетки для передачи 1 мкл из 96-луночные планшеты, содержащие смешанный и разводили в первом раунде мутагенных продуктов ПЦР с родственными лунки в пластинах ПЦР.
      4. Накройте каждую пластину ПЦР с уплотнительной пластины 96-луночного. Центрифуга при приблизительно 200 мкг в течение 2 мин. Передача пластин Термоциклеры и запустить ту же программу, как на стадии протокола 2.2.1.3.
   3. Анализ результатов второго круга мутагенных ДЗП методом гель-электрофореза.Убедитесь в том, что все продукты нужного размера и отсутствия загрязняющих продуктов.
      1. Добавить 2 мл 2Х геля красителем в пипетку бассейна, а затем использовать многоканальную пипетку для переноса 6 мкл до 263 скважин в течение трех 96-луночных планшетах. Используйте многоканальную пипетку для переноса 6 мкл из 96-луночные ПЦР планшеты, содержащие второго круга мутагенных продуктов ПЦР к родственными лунки 96-луночных планшетов, содержащих краситель.
      2. Готовят гель 1,5% агарозном с 0,2 мкг / мл этидий-бромида (ВНИМАНИЕ).
      3. Нагрузка ДНК лестница в первой и последней полос движения каждой строки. Затем с помощью многоканальной пипетки, чтобы загрузить 10 мкл образцов из стадии протокола 2.2.3.1.
      4. Запуск геля при 100 V в течение 40 мин и изображения на УФ-просвечивания.
      5. Повторите шаги протокола 2.2.3.2 - 2.2.3.4, пока не будут проанализированы все образцы.
   4. Точное измерение концентрации каждого NNS подбиблиотеки продукта ПЦР с использованием реагента дц количественный.
      1. Переводприблизительно 15 мл буфера EB в пипетку бассейна. Используйте многоканальную пипетку для переноса 49 мкл до 263 скважин в течение трех 96-луночных плотными стенками, прозрачным дном планшеты для анализа.
      2. Используйте многоканальную пипетку для передачи по 1 мкл каждого второго этапа ПЦР-продукта (этап протокола 2.2.2) к родственным лунки планшеты для анализа 96-луночные.
      3. Приготовьте стандартную кривую концентрации ДНК путем разбавления ДНК фага лямбда до 2 нг / мкл в 300 мкл EB буфера, а затем сделать десять двукратных разведений (для общей сложности 11 концентраций). Передача 50 мкл в первых одиннадцати столбцах строки одного из анализа 96-луночные планшеты из предыдущего шага, который не содержит образца; к двенадцатой колонке добавить 50 мкл буфера EB (реагент пустой).
      4. Готовят реагент дц количественный путем добавления 75 мкл реагента (см Таблицу материалов) , 15 мл коническую пробирку, а затем добавляют 15 мл буфера EB. Взболтайте трубки, а затем передать в пипетку бассейна. Защита от света реагент,
      5. С помощью многоканальной пипетки для передачи 50 мкл приготовленного реагента дцДНК количественного в каждую лунку планшеты для анализа. Смешайте с помощью пипетки вверх и вниз. Инкубируйте пластин при комнатной температуре в течение 5 мин в защищенном от света.
      6. Измеряют флуоресценцию каждого образца с использованием микропланшет-ридера и стандартные флуоресцеина длины волн (возбуждение 485 нм, излучение 520 нм, 0,1 сек).
      7. Вычитание значения флуоресценции реагента бланка из всех образцов. Генерация стандартной кривой из измерений флуоресценции образцов фага лямбда. Вычислить концентрацию каждого образца с использованием их соответствующего измерения флуоресценции и стандартной кривой.
3. Клонирование НМВ суб-библиотек в векторы выбора
   1. Смешайте 100 нг каждого NNS подбиблиотеки продукта ПЦР на пять НМВ подбиблиотека групп. Следуя инструкциям производителя, очистка образцов с использованием набора для очистки ДНК, а затем измеряют концентрацию с помощью ДСДНК Количественное реагента.
      Примечание: Каждая группа состоит примерно из 53 позиций смежных аминокислот, расположенных вдоль последовательности TEM-1 (НМВ подбиблиотека группы 1 - 5 состоят из позиций 26 - 78, 79 - 132, 133 - 183, 184 - 236, и 237 - 290, соответственно; нумерация в соответствии с Ambler и др ^19)..
   2. Создание клонировании векторов для каждой NNS подбиблиотека группы.
      1. Подготовьте пять 100 мкл МКП в соответствии с таблицей 6, с использованием праймеров AvrII_F и AatII_OP1_R - AatII_OP5_R, и плазмидами pBR322_OP1-5 в качестве матрицы (AatII_OP1_R сопряженным с pBR322_OP1 и т.д.).
      2. Переезд в Термоциклеры и запустить следующую программу: 98 ° C в течение 30 секунд; 25 циклов: 98 ° C в течение 10 сек, 55 ° С в течение 20 сек, 72 ° С в течение 1,5 мин; 72 ° С в течение 2 мин; держать при температуре 4 ° С. См T в состоянии материалов для последовательностей AatII_R и AvrII_F.
      3. Готовят гель 1% -ном агарозном с 0,2 мкг / мл этидий-бромида (ВНИМАНИЕ).
      4. Добавьте 20 мкл 6х геля красителем для каждого образца ПЦР. Загрузите первую полосу геля с лестницы ДНК; загружать весь объем каждого образца, пропуская по меньшей мере, одной скважины между образцами.
      5. Выполнить гель при 100 В в течение 50 мин.
      6. Визуализируйте гель с помощью УФ-осветитель длинноволновое (Предупреждение). Акцизные срезы, содержащие продукт ПЦР при температуре ~ 3500 пар оснований; передавать отдельные микроцентрифуге трубки. Гелевые срезы, можно хранить при температуре -20 ° C.
      7. Следуя инструкциям производителя, очищают образцы с использованием набора для экстракции из геля и мера концентрации с использованием реагента дц количественный.
   3. Для обоих подбиблиотека групп НМВ (шаг протокол 2.3.1) и клонированию векторов (этап протокола 2.3.2), установленных ограничение дайджесты с AatII и AvrII ферментами в соответствии с Т умелым 7. Инкубировать при температуре 37 ° С в течение 1 часа. Следуя инструкциям производителя, очистка образцов с использованием набора для очистки ДНК, а затем измеряют концентрацию с помощью дц количественно онции реагента.
   4. Настройка реакции лигирования следующей таблице 8 для каждого ограничения переваренной NNS подбиблиотека группы с родственными рестрикции-перевариваются клонировании вектор (NNS подбиблиотека 1 -й группы с pBR322_OP1 и т.д.). Инкубируют при комнатной температуре в течение 1 часа. Очистка реакции с использованием набора для очистки ДНК в соответствии с инструкциями изготовителя; элюции ДНК с 20 мкл воды.
   5. Transform полноту очищенных реакций лигирования в библиотеку эффективных Е. палочки клетки с помощью электропорации.
      1. Оттепель Электрокомпетентные Е. клетки палочки , а затем поместить клетки и очищают реакции лигирования на льду.
      2. Передача 10 мкл оттаивают клеток к каждой очищенной реакции лигирования, а затем передать в кювету для электропорации. Электропорации 1,8 кВ.
      3. Восстановление клеток путем ресуспендирования в 1 мл рыдать. Инкубировать в течение 1 часа при 37 ° С.
      4. Ресуспендируют 10 мкл каждой культуры восстановления в 990 мкл LB; распространить 100 мкл на LB-чашки с агаром Containing 12 мкг / мл Tet. Инкубируйте пластины O / N (~ 16 ч) при 37 ° С.
      5. Для каждой культуры восстановления, подготовить культуры колбу 250 мл с 50 мл LB и 50 мкл Tet запаса. Перенести в колбу оставшиеся ~ 1 мл восстановления культуры. Выдержите O / N (~ 16 ч) при температуре 37 ° С при интенсивном помешивании (~ 200 оборотов в минуту).
   6. Подсчитать количество колоний на каждой пластине. Подсчитать количество успешных трансформантов как , где это количество колоний, является объем восстановления культуры (1000 мкл) и является объем культуры высевают восстановления (1 мкл).
      Примечание: Для того, чтобы обеспечить полный охват всех мутаций, как правило число успешных трансформантов должно быть ≥100 раз по сравнению число ожидаемых мутаций. Каждый NNS подбиблиотека имеет 53 позиции ~, так что ожидаемое количество мутаций составляет 53 × 32 позиции кодона / позиция ≈ 1,7 × 10 ^3; чтобы дать библиотека размер ≥100 раз (≥1.7 × 10 ⁵⁾ должны быть ≥170 колоний на каждой пластине.
   7. В соответствии с инструкциями производителя, выделения плазмидной ДНК из культур с использованием набора для очистки плазмиды и затем измеряют концентрацию с использованием реагента дц количественный. Смешайте 100 нг каждой плазмиды. Это создает окончательный целого белка библиотеки мутагенеза насыщения.

3. Выбор TEM-1 цельного белка Насыщенность мутагенеза Библиотека для антибиотикорезистентности

1. Подготовка культуры предварительного отбора.
   1. Развести плазмиды, полученной на стадии протокола 2.3.7 до 0,5 нг / мкл в воде и переносят 20 мкл в микроцентрифужных трубки. Выполните преобразование, повторнотерпимого отношения к просрочен-, металлизированный и O / N роста, как описано выше на стадии протокола 2.3.5, за исключением передачи по 1 мкл культуры восстановления SOB до 999 мкл LB.
   2. Подсчитайте количество колоний. Для того, чтобы обеспечить полный охват всех мутаций должен быть ≥100 колонии, указывающие на ≥10 ⁶ успешных трансформантов (100 × 263 × 32 позиции кодонов / положение ≈ 10 ^6).
   3. Измерьте концентрацию 50 мл O / N культуры.
      1. Подготовьте заготовку LB путем добавления 1 мл LB в спектрофотометре кювете. Мера OD600 на спектрофотометре.
      2. Развести O / N культуры в 10 раз путем ресуспендирования 100 мкл в 900 мкл LB. Измерьте OD600. Вычтите чтение OD600 заготовки и умножить на 10, чтобы дать OD600 от O / N культуры.
   4. Предварительно нагреть три колбах с культурой с шага протокола 1.1 в течение ~ 30 мин при 37 ° С. Развести O / N культуру OD600 = 0,1 и добавляют 1 мл в одну колбу (конечная OD600 = 0,001). Tего есть "предварительный отбор культуры".
   5. Выдержите "культуру предварительного отбора" при 37 ° С при интенсивном встряхивании (200 оборотов в минуту). Периодически контролировать рост путем измерения OD600, как на стадии протокола 3.1.3 (нет необходимости, чтобы разбавить культуру в 10 раз) до OD600 = 0,1 (~ 2,5 ч).
   6. Перенести 100 мл культуры предварительного отбора к двум 50 мл конические пробирки. Центрифуга при 4000 х г в течение 6 мин при температуре 4 ° С. Удалить большую часть надосадочной жидкости и объединить в единый 15 коническую трубку. Повторите центрифугирования и удалить все супернатант. Хранить при -20 ° C.
2. Селекцией на устойчивость к ампициллину.
   1. В то время как культура предварительного выбора инкубирования, готовят 50 мг / мл маточного АМФ в воде путем растворения 0,5 г ампициллина натриевую в 10 мл воды. Стерилизуют с использованием фильтра и хранят 0,2 мкм при 4 ° С.
   2. Для остальных двух колб, добавляют Tet до конечной концентрации 12 мкг / мл и объемом предварительного отбора культуры, таких тха т окончательный OD600 = 0,001. К одной колбе, добавляют 1 мл Amp для конечной концентрации 50 мкг / мл - это "выбор культуры".
   3. Инкубируйте культур при температуре 37 ° С при интенсивном помешивании (200 оборотов в минуту). Мониторинг роста культуры, для которых не ампициллин не добавляли в предыдущем шаге, пока OD600 = 0,1 (~ 2,5 ч). В это время, также измеряют OD600 культуры селекции.
   4. Разделить OD600 культуры селекции в 0,1 и умножить на 100 мл. Передача этого объема (~ 400 мл) до 50 мл конические пробирки и центрифугируют при 4000 х г в течение 6 мин при температуре 4 ° С. Удалить большую часть надосадочной жидкости и объединить в единый 15 коническую трубку. Повторите центрифугирования и удалить все супернатант.
   5. В соответствии с инструкциями производителя, выделения плазмидной ДНК из предварительного отбора (этап протокола 3.1.6) и выбора (этап протокола 3.2.4) культуры клеток гранул, а затем измеряют концентрацию с использованием реагента дц количественный.

TLE "> 4. Высокая пропускная способность секвенирования Определить Фитнес влияние мутаций

1. Подготовка проб для высокой пропускной последовательности
   1. Готовят 25 мкл в МКП де-мультиплексирование NNS подбиблиотека группы с ортогональным праймеров
      1. Подготовка мастер смеси ПЦР в соответствии с таблицей 9; передать 23 мкл десяти ПЦР пробирки.
      2. Добавляют 1 мкл 0,5 нг мкл очищенной ДНК плазмиды / из культуры предварительного отбора ПЦР пробирки 1 - 5 и от культуры выбора для труб 6 - 10.
      3. Смешайте 50 мкл 50 мкМ вперед ортогональных праймеров OP1_F - OP5_F с соответствующей обратной ортогональные праймеров OP1_R - OP5_R. В том же порядке, передача 1 мкл в ПЦР - пробирки 1 - 5 и 6 - 10. См Таблица материалов для последовательностей OP1_F - OP5_F и OP1_R - OP5_R.
      4. Передача ПЦР пробирки в амплификатор. Выполните следующую программу: 98 ° C в течение 30 секунд; 20 циклов: 98 ° C в течение 10 сек, 55 °С в течение 20 сек, 72 ° С в течение 1,5 мин; 72 ° С в течение 2 мин; держать при температуре 4 ° С.
   2. Подготовить 25 мкл МКП для выделения каждой из подбиблиотека групп НМВ
      1. Развести в 100 раз десять с шага МКП протокола 4.1.1.4 путем передачи по 1 мкл каждого ПЦР для разделения трубок и добавления 99 мкл воды. Mix, затем пипеткой из 99 мкл и выбросить.
      2. Смешайте 50 мкл 50 мкМ праймеры Group1_F - Group5_F с соответствующим обратным праймерами Group1_R - Group5_R. В том же порядке, передача 1 мкл ПЦР пробирки 1 - 5 и 6 - 10. См Таблица материалов для последовательностей Group1_F - Group5_F и Group1_R - Group5_R.
      3. Подготовка мастер смеси ПЦР в соответствии с таблицей 9, передать 23 мкл в каждую пробирку PCR. Передача ПЦР пробирки в амплификатор; запустить ту же программу, что и в шаге протокола 2.2.1.3.
   3. Провести финальные 25 мкл, чтобы добавить МКП индексации последовательностей
      1. дилютня в 100 раз десять с шага МКП протокола 4.1.2.3 путем передачи по 1 мкл каждого ПЦР для разделения трубок и добавления 99 мкл воды. Mix, затем пипеткой из 99 мкл и выбросить.
      2. Подготовка мастер смеси ПЦР в соответствии с таблицей 9, передать 23 мкл в каждую пробирку PCR.
      3. Для труб с шаблоном, происходящих из НМВ подбиблиотека групп 1-5, передать 0,5 мкл на пробирку прямых праймеров 501_F - 505_F соответственно. Для труб с шаблоном в результате предварительного отбора и селекции культур, переноса 0,5 мкл на пробирку обратного праймеров 701_R и 702_R соответственно. Таблицу материалов для последовательностей 501_F - 505_F и 701_R и 702_R.
      4. Передача ПЦР пробирки в амплификатор и запустить программу с шага 2.2.1.3.
   4. Смешайте и очистить образцы
      1. Концентрации Измерение с использованием реагента согласно дц количественный с инструкциями производителя. Смешайте 100 нг каждого продукта Int PCRоа сингл микроцентрифужных трубки.
      2. Готовят гель 2% -ном агарозном с 0,2 мкг / мл этидий-бромида (ВНИМАНИЕ).
      3. Добавить 6х гель красителем смешанному продуктов ПЦР образца. Загрузите первую полосу геля с лестницы ДНК; загружать весь объем образца.
      4. Выполнить гель при 100 В в течение 50 мин. Визуализируйте гель с помощью УФ-осветитель длинноволновое (Предупреждение). Акцизный срез, содержащий продукт ПЦР при ~ 360 пар оснований; передать в пробирке. ломтик Гель можно хранить при -20 ° С.
      5. Следуя инструкциям производителей, очищают образец с использованием набора для экстракции из геля и измеряют концентрацию с использованием реагента дц количественный. Это последний образец для высокой пропускной последовательности.
   5. Последовательность на секвенирования платформы с высокой пропускной способностью (см таблицу материалов для платформы , используемых в данном протоколе).
      1. Вычислить концентрацию образца в нМ, как концентрация образца в нг / мкл и длина последовательности ДНК образца (~ 360 п.н.). Разбавьте образец до 4 нМ в буфере EB.
      2. Следуйте инструкциям производителя для денатурации образца и разбавить до 9 часов в буфере для гибридизации.
      3. Нагрузка 600 мкл образца в картридже реагента. Последовательность в соответствии с инструкциями изготовителя и подсказкам на экране.
2. Анализ данных секвенирования
   1. Скачать Flash (быстрый длина настройка коротких прочтений) ^20, поместить в папку вместе с fastq.gz файлов , полученных в результате секвенирования.
   2. Используйте вспышку, чтобы присоединиться к fastq.gz файлы, соответствующие парного считывает для каждой пары индексов (вперед и назад считывает для каждой NNS подбиблиотека группы для предварительного отбора и селекции культур). Откройте командную строку и перейдите в папку на шаге протокола 4.2.1. Присоединяйтесь к каждой паре чтений с помощью команды: вспышки , где mates1.fastq.gz и mates2.fastq.gz являются файлы, содержащие в прямом и обратном читает, соответственно.
3. После присоединения к каждой паре читает, поместите выходной файл out.extendedFrags.fastq в отдельные папки для результатов предварительного отбора или отбора культур. Переименовать выходной файл out.extendedFrags.fastq в соответствии с подбиблиотека группы NNS, которому оно соответствует (то есть., 1.fastq, 2.fastq и т.д.).
4. Запуск вычислений NNS_DataAnalyzer.m скрипт (см символы дополнительного файла) из каждой папки для вычисления отсчетов для каждой мутации одной аминокислоты, а отсчеты для дикого типа, для каждого NNS подбиблиотека группы.
5. Вычислить фитнес-эффект каждой мутации как десятичное логарифму отношения отсчетов, полученных в отборе ( ) По сравнению с предварительного отбора ( ) Состояние, по сравнению с дикого типа:
   ,

Результаты

Карта плазмиды для пяти модифицированных плазмид pBR322 , содержащих ортогональные заливке сайты (pBR322_OP1 - pBR322_OP5) показана на рисунке 2А. Для того, чтобы проверить, является ли ортогональные Праймеры специфичны, ПЦР проводили с использованием каждой пары ортогональных праймеров по отдельности, вместе со всеми пятью pBR322_OP1-5 плазмид, или со всеми плазмид минус плазмиде, соответствующей пары ортогональных праймера. Правильный продукт был получен только тогда ,...

Обсуждение

Здесь протокол описан для проведения функциональной оценки целого белка библиотек мутагенеза насыщения, используя высокую пропускную способность технологии секвенирования. Важным аспектом способа является использование ортогональных праймеров во время процесса клонирования. Если коротко, то каждая позиция аминокислоты рандомизированы по мутагенной ПЦР, и смешивают вместе в группы позиций, совокупная длина последовательности размещается высокой пропускной последовательности. Эти группы клонированы в плазмидные векторы, с...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Typtone	Research Products Intl. Corp.	T60060-1000.0
Дрожжевой экстракт	Research Products Intl. Corp.	Y20020-500.0
Хлорид натрия	Fisher Scientific	BP358-212
Хлорид калия	Sigma-Aldrich	P9333-500G
Сульфат магния	Sigma-Aldrich	M7506-500G
Агар	Fisher Scientific	BP1423-500
Тетрациклина гидрохлорид	Sigma-Aldrich	T7660-5G
Пластины	Петри Corning	351029
MATLAB	Mathworks	http://www.mathworks.com/products/matlab/
Олигонуклеотидные праймеры	Integrated DNA Technologies	https://www.idtdna.com/pages/products/dna-rna/custom-dna-oligos	масштабе 25 нмоль, стандартные pBR322_AvrII обессоливания
	доступны по запросу		плазмиды pBR322, модифицированной для содержания сайта рестрикции AvrII после гена TEM-1
pBR322_OP1 – pBR322_OP5	доступны по запросу		пять модифицированных плазмид pBR322, каждая из которых содержит пару ортогональных прайминг-сайтов
Q5 высокоточной ДНК-полимеразы New	England Biolabs	M0491L	включает 5x ПЦР-буфер и добавку ПЦР (энхансер GC)
15 мл коническая пробирка	Corning	430025
многоканальные пипетки (Eppendorf ResearchPlus)	Eppendorf
ПЦР-планшет, 96 лунок	Fisher Scientific	14230232
96 луночный уплотнитель пластины	Excel Scientific	F-96-100
Veriti 96-луночный термоамплификатор	Applied Biosystems	4375786
6x гелевый краситель	New England Biolabs	B7024S
Agarose	Research Products Intl. Corp.	20090-500.0
Бромид этидия	Bio-Rad	161-0433
УФ-трансиллюминатор (FOTO/Analyst ImageTech)	Fotodyne Inc.
EB буфер	Qiagen	19086
96-луночные черностенные, прозрачные донные тестовые пластины	Corning	3651
Лямбда фаг ДНК	New England Biolabs	N3011S
PicoGreen dsDNA реагент	Invitrogen	P7581	dsDNA quantitation, используемый на этапе протокола 2.2.4
Виктор 3 В Микропланшетный ридер	PerkinElmer
Набор для очистки ДНК	Zymo Research	D4003
Микроцентрифужные пробирки	Corning	3621
Длинноволновый УФ-осветитель	Fisher Scientific	FBUVLS-80
Агарозный гель Буфер для экстракции ДНК	Zymo Research	D4001-1-100
AatII	New England Biolabs	R0117S
AvrII	New England Biolabs	R0174L
T4 ДНК-лигаза	New England Biolabs	M0202S
EVB100 электрокомпетентный электропоратор E. coli	Avidity	EVB100
(E. coli Pulser)	Bio-Rad	1652102
Кюветы для электропорации	Bio-Rad	165-2089
Спектрофотометр (Ultrospec 3100 pro)	Amersham Biosciences	80211237
50 мл конические пробирки	Corning	430828
набор для очистки плазмид	Macherey-Nagel	740588.25
8 лунок стрип-пробирки для ПЦР	Axygen	321-10-551
Набор для анализа Qubit dsDNA HS	Invitrogen	Q32854	dsDNA реактив для количественного определения
Пробирки для анализа	Qubit Invitrogen	Q32856
Флуориметр Qubit	Invitrogen	Q32866
Ампициллин натриевая соль	Akron	Biotechnology 50824296
набор реактивов MiSeq v2 (500 циклов)	Illumina	MS-102-2003
Настольный секвенатор MiSeq	Illumina	http://www.illumina.com/systems/miseq.html	в качестве альтернативы, можно было бы секвенировать на платформе Illumina HiSeq
программное обеспечение FLASh	Университета Джона Хопкинса -	http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/	для объединения парных прочтений из данных секвенирования следующего поколения
AatII_F			GATAATAATGGTTTCTTAGACG TCAGGTGGC
AvrII_R			CTTCACCTAGGTCCTTTTAAAT TAAAAATGAAG
AvrII_F			CTTCATTTAATTTAAAAGGA CCTAGGTGAAG
AatII_OP1_R			ACCTGACGTCCGTATTTCAAC TGTCCGGTCTAAGAAACCATT ATTATCATGACATTAAC
AatII_OP2_R			ACCTGACGTCCGCTCACGGA GTGTACTAATTAAGAAACCATT ATTATCATGACATTAAC
AatII_OP3_R			ACCTGACGTCGTACGTCTGA ACTTGGGACTTAAGAAACCA TTATTATCATGACATTAAC
AatII_OP4_R			ACCTGACGTCCCGTTCTCGAT ACCAAGTGATAAGAAACCATT ATTATCATGACATTAAC
AatII_OP5_R			ACCTGACGTCGTCCGTCGGA GTAACAATCTTAAGAAACCAT TATTATCATGACATTAAC
OP1_F			GACCGGACAGTTGAAATACG
OP1_R			CGACGTACGAGACAATTTCC
OP2_F			ATTAGTACACTCCGTGAGCG
OP2_R			AGTATTAGGCGTCAAGGTCC
OP3_F			AGTCCCAAGTTCAGACGTAC
OP3_R			GAAAAGTCCCAATGAGTGCC
			TCACTTGGTATCGAGAACGG
OP4_R			TATCACGGAAGGACTCAACG
OP5_F			AGATTTACTCCGACGGAC
OP5_R			TATAACAGGCTGCTGAGACC
Group1_F			ACACTCTTTCCCTACACGAC GCTCTTCCGATCTNNNNNGC ATTTTGCCTACCGGTTTTTGC
Group1_R			GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTCTCCGATCTNNNNNTC TTGCCCGGCGTCAAC
Group2_F			ACACTCTTTCCCTACACGAC GCTCTTCCGATCTNNNNNGA ACGTTTTCCAATGATGAGCAC
Group2_R			GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATCTNNNNNGT CCTCCGATCGTTGTCAGAAG
Group3_F			ACACTCTTTCCCTACACGAC GCTCTTCCGATCTNNNNNAG TAAGAGAATTATGCAGTGCTGCC
Group3_R			GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTCTCCGATCTNNNNNTC GCCAGTTAATAGTTTGCGC
Group4_F			ACACTCTTTCCCTACACGAC GCTCTTCCGATCTNNNNNCC AAACGACGAGCGTGACAC
Group4_R			GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCGATCTNNNNNGC AATGATACCGCGAGACCC
Group5_F			ACACTCTTTCCCTACACGAC GCTCTTCCGATCTNNNNNCG GCTGGCTGGTTTATTGC
Group5_R			GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATCTNNNNNTAT ATGAGTAAACTTGGTCTGACAG
501_F			AATGATACGGCGACCACCGA GATCTACACTATAGCCTACAC TCTTTCCCTACACGAC
502_F			AATGATACGGCGACCACCGA ГАТКТАКАКАТАГАГГКАКА<бр/> CTCTTTCCCTACACGAC
503_F			AATGATACGGCGACCGA GATCTACACCCTATCCTACAC TCTTTCCCTACACGAC
504_F			AATGATACGGCGACCACCGA GATCTACACGGCTCTGAACA CTCTTTCCCTACACGAC
505_F			AATGATACGGCGACCGA GATCTACACAGGCGAAGACA CTCTTTCCCTACACGAC
701_R			CAAGCAGAAGACGGCATAC GAGATCGAGTAATGTGACTG GAGTTCAGACGTG
702_R			CAAGCAGAAGACGGCATAC GAGATTCTCCGGAGTGACTG GAGTTCAGACGTG