Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Предотвращение теплового стресса побочные эффекты у крыс

7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54122

⸱

11 июля 2016 г.

 ,  ,  , 
1Department of Anatomy, Physiology and Pharmacology, Auburn University

В этой статье

Краткое содержание

Мы описали протокол предотвращения эффектов теплового стресса у крыс путем предварительной обработки полости рта полезными бактериями. Этот протокол может быть модифицирован и использован для различных путей введения и для анализа различных соединений.

Аннотация

Данное исследование было разработано для оценки защитного эффекта штамма Bacillus Сенная против осложнений , связанных с тепловому стрессу. Тридцать два крыс Sprague-Dawley были использованы в этом исследовании. Животных перорально два раза в день в течение двух дней с Б. Сенная штамм BSB3 или PBS. На следующий день после последней обработки, каждая группа была разделена и две экспериментальные группы (один обрабатывали PBS и один обрабатывали B. Сенная) помещали при 45 ° С в течение 25 мин. Две контрольные группы остались в течение 25 мин при комнатной температуре. Все крысы были умерщвлены, и различные параметры были проанализированы во всех группах. Побочные эффекты теплового стресса регистрируются уменьшением ворсинок высоты и общей толщины слизистой оболочки в кишечном эпителии; транслокации бактерий из просвета; увеличилась везикул эритроцитов и возвышение липополисахаридов (ЛПС), уровень в крови. Защитная эффективность лечения оценивали путем предварительнойщению этих побочных эффектов. Протокол был создан для перорального лечения крыс с бактериями для предотвращения теплового стресса осложнений, но этот протокол может быть модифицирован и использован для других путей введения и для анализа различных соединений.

Введение

Различные стрессоры влияют на здоровье человека и животных. Температура является одним из самых стрессовых факторов, вызывающих хронические, острые и даже смертельные заболевания1. Во многих случаях были зарегистрированы изменения в морфологии кишечника и потеря целостности кишечного барьера после теплового стресса2,3. Этот защитный барьер отвечает за защиту от перемещения кишечных бактерий и их токсинов, в частности липополисахаридов (ЛПС), из просвета во внутренний кровоток4,5. Стабильность кишечной микробиоты существенно влияет на барьерную функцию кишечника, иммунный ответ хозяина и толерантность к стрессовым условиям6. Таким образом, модуляция кишечной микробиоты может обеспечить новый подход к профилактике побочных эффектов, связанных со стрессом.

Полезные бактерии были использованы в качестве многообещающей стратегии для модификации микробиоты кишечника для успешного лечения различных клинических состояний, таких как диарея, воспалительные заболевания кишечника, атопический дерматит, метаболические нарушения7-10. Пробиотические эффекты полезных бактерий включают выработку необходимых метаболитов для поддержания здоровья кишечника, стимуляцию иммунной системы, повышение толерантности к лактозе, восстановление эпителиальной дисфункции. Пробиотики оказались эффективными в профилактике осложнений, связанных со стрессом, in vitro и на животных моделях11,12.

Исследователи уделили больше внимания бактериям Bacillus как пробиотикам, потому что эти бактерии поддерживают гомеостаз кишечника13 и оказывают благотворное влияние на хозяина14. Наши предыдущие данные продемонстрировали высокую эффективность пробиотиков Bacillus против патогенов in vitro15,16 и в клинических исследованиях17,18. В данной работе мы стремимся оценить профилактический эффект штамма B. subtilis BSB3 против осложнений после теплового стресса.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все экспериментальные процедуры были одобрены IACUC из Auburn University, Auburn, Алабама.

1. Подготовка медиа-культуры, посуда и бактериальная культура

  1. Инокулируйте 10 мл питательного бульона в колбе с одной колонии Сенная палочка BSB3 культуры, выращенной в течение ночи на питательным агаром.
  2. Сделать 500 мл спорообразования среды 19 (на литр: Бакто питательном бульоне, 8 г; 10% (вес / объем) KCl, 10 мл; 1,2% (вес / объем) MgSO 4 х 7H 2 O, 10 мл, агар, 15 г) и автоклаве при 121 ° С в течение 20 мин. Дать остыть до 50 ° С и добавить следующие стерильные растворы: 1 М Са (NO 3) 2, 1 мл; 0,01 М MnCl 2, 1 мл; 1 мМ FeSO 4, 1 мл.
  3. Холодный Готовую среду до 40 ° С в течение 20 мин при комнатной температуре и заливают 25 мл в каждую из 20 стерильные чашки Петри в стерильной камере. Пусть среда затвердеть в течение ночи.
  4. Распространение 0,5 мл ночной культуры Bacillus зиЫШз BSB3 на поверхности среды в чашках Петри. Инкубируйте культуру при 37 ° С в течение 5 дней , пока 90% спорообразования. Reveal поэтапному яркие споры высокой разрешающей микроскопии.
  5. Урожай бактерии путем добавления 1 мл стерильного физиологического раствора с фосфатным буфером (PBS) к пластине и соскоб бактерий с поверхности, используя стерильный клеточный распределителю. Храните подвеску в холодильнике, пока не понадобится.
  6. Confirm жизнеспособность бактерий при посеве 0,1 мл соответствующего разведения (10 -5 до 10 -6) бактериальной суспензии на спорообразования средних пластин с последующей инкубацией в течение 18 - 24 ч при 37 о С.
  7. Количество бактериальных колоний на пластинах с использованием счетчика колоний и расчета титра бактерий в исследуемом суспензию. Готовят бактериальную суспензию с конечной концентрацией 1 × 10 8 КОЕ / мл в PBS.

2. Животные

  1. Используйте 32 самцов крыс Sprague-Dawley (250 - 300 г). Поддерживать животных под конкретного патогена условиях со свободным доступом к стандартному окатышей корму и воде. Установить среднюю температуру (21 ± 1 ° С), влажность (50 ± 5%) и 12 ч свет-темнота циклом.

3. Экспериментальный дизайн

  1. Начать лечение животных перорально через зонд 11, после 2 дней акклиматизации. Используйте шприц с иглой через желудочный зонд. Относитесь 16 крыс с B. Сенная BSB3 суспензии (1 мл на крысу) два раза в день в течение двух дней (B. Сенная группа). Относитесь 16 крыс с PBS (1 мл на крысу) два раза в день в течение двух дней (группа PBS) (рисунок 1).
  2. После обработки подразделяют каждую группу (8 крыс в каждой группе): Группа 1 контроля (PBS / без стресса), Группа 2 B. Сенная (B. Сенная / без стресса), группа 3 - стресс (PBS / тепловой стресс) и Группа B. 4- Сенная + стресс (B. Сенная / тепловой стресс).
  3. Измерьте ректальную температуру каждой крысы с использованием ElecTronic цифровой термометр. Хранить крыс групп 1 и 2 при комнатной температуре в течение 25 мин. Место животных групп 3 и 4 в климатической камере при 45 ° С и относительной влажности 55% в течение 25 мин.
  4. Затем измеряют ректальную температуру каждой крысы во всех группах с использованием электронно-цифровой термометр. Поместите всех животных при комнатной температуре в течение 4 часов.
  5. Обезболить крыс с изофлуран (2 - 4%) в герметичную банку анестезии и наблюдать, пока крысы не глубоко анестезию (отсутствие ответа на носок щепотку). Эвтаназии крыс быстрым обезглавливание с гильотиной.
  6. Сбор туловища кровь от каждой крысы 20 (15 - 16 мл) с апирогенной пипеток Into апирогенной пробирки , чтобы получить сыворотку , и сразу же берут образцы крови (7 мкл от каждой крысы) с пипеткой для микроскопического исследования.
  7. Помещенный пробирки с кровью в холодильнике в течение не менее 30 мин, чтобы позволить свертывание. Центрифуга трубки при температуре 20 ° С, 7000 мкг в течение 10 мин и быстроудалить сыворотку с помощью пипетки. Алиготе сыворотки , полученной от каждой крысы в 50 мкл объемы и хранить при температуре -20 ° С до анализа.

4. Хирургические процедуры

  1. Вырезать / обрезать весь мех от брюшной полости и грудной клетки нижней стороны каркаса с электрическими ножницами. Поместите тушку в стерильной камере и лечить бритую поверхность тушки с 70% -ным спиртом.
  2. Используйте стерильный скальпель, чтобы создать срединный разрез брюшной полости. Удалить печень, брыжеечные лимфатические узлы, селезенка и тонкой кишки у каждой крысы с использованием стерильного пинцета.

5. Анализ бактериальная транслокация

  1. Поместите каждую пробу печени, брыжеечных лимфатических узлов и селезенки, в предварительно взвешенную стерильные пробирки и взвешивают. Рассчитывают вес образца как разницу между весом трубки с пробой и весом пустой трубы.
  2. Добавить стерильной PBS к трубе, чтобы получить разведение 1:10 (вес / объем) образца и homogeределить каждого образца с помощью стерильной гомогенизатора стеклотканью для получения гомогенной суспензии 21.
  3. Сделать серийные разведения (10 -1 до 10 -4) каждого образца в стерильной PBS. Тарелка 0,1 мл всех разведений каждой ткани на поверхности МакКонки и в 5% кровяной агар и Brucella кровяной агар с гемина (0,005 г / л) и витамин К1 (0,01 г / л) пластин.
  4. Выдержите МакКонки и в 5% кровяном агаре аэробно и пластины бруцеллы чашках с кровяным агаром в анаэробных условиях при 37 ° С 22.
  5. Количество колоний аэробных бактерий после 24 часов, и колонии анаэробных бактерий после 48 ч инкубации с использованием счетчика колоний. Экспресс результаты в виде числа колониеобразующих единиц (КОЕ) в грамм ткани.

6. Гистологический анализ

  1. Удалите небольшие образцы кишечника у каждой крысы с помощью хирургической процедуры (шаги 4.1 - 4.2). Фикс образцы в Fixative Буэна, встраивать в парафин,подготовить 6 мкм секции и секции окрашиваются гематоксилином и эозином с использованием стандартных процедур 23.
  2. Используйте систему микроскопа высокого разрешения для измерения высоты ворсинок кишечника и общей толщины слизистой оболочки в каждом образце (увеличение 100X) 24. Анализ 4 образцов от каждой крысы и сделать по крайней мере двадцать измерений в каждом образце. Экспресс результаты в микронах.

7. Анализ цитокина

  1. Использование коммерческих наборов крысы ELISA для IL-1; IL-6; TNF-α; INF-γ и IL-10 для измерения уровней цитокинов в сыворотке крови в соответствии с протоколом производителя.
  2. Генерировать стандартные кривые для каждого набора проб, проанализированных с использованием стандартов для соответствующего комплекта. Определить уровень цитокинов в каждом образце путем сравнения экспериментальных данных с соответствующей стандартной кривой.

8. Анализ липополисахарида

  1. Анализ уровня LPS в сыворотке с помощью крысы LPS ELISA набор поПротокол производителя. Расчетный концентрацию LPS в образцах путем сравнения полученных значений со значениями стандартной кривой.

9. Высокое разрешение световой микроскопии крови

  1. Используйте систему микроскопа , описанного ранее 25,26. Используйте платформу виброизоляции в качестве основы для системы микроскопа и видеокамеры и компьютера 25 для записи изображения в реальном времени . Калибровка тестовых изображений с помощью слайд Ричардсон , как описано выше 27.
  2. Поместите 7 мкл свеженарисованного крови из каждой крысы на предметное стекло, покровное, фотографии и записывать десять кадры изображений 72 × 53,3 мкм 2 в каждом образце (увеличение 1,700X).
  3. Измерение концентрации везикул с использованием программного обеспечения, которое обеспечивает с высокой разрешающей способностью прямого просмотра оптических изображений в реальном масштабе времени. Проверьте как минимум 20 кадров изображения для каждого условия эксперимента 28.

10. Statisтики

  1. Экспресс все значения как среднее и стандартное отклонение. Провести статистический анализ и график зависимости. Анализ результатов с Т-тест два образца, установите уровень значимости 0,05 для определения статистической значимости.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Средняя температура тела животных до и сразу после теплового стресса был 36,7 ± 0,07 ° С и 40,3 ± 0,17 ° С, соответственно (р <0,05). Экспонирование крыс тепла (группа 3) привела к значительному ингибированию роста ворсинок и общей толщины слизистой оболочки (фиг.2, 3). Пероральное введение штамма BSB3, прежде чем стресс защищен кишечника от вредного воздействия тепла.

Транслокации бак...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Воздействие высоких температур приводит к серьезным состоянием здоровья 29. Профилактика и раннее выявление осложнений , связанных с тепловым стрессом имеют жизненно важное значение 30. Представленный протокол может быть использован для оценки эффективности различных подходов к профилактике теплового стресса побочных эффектов.

Критические шаги в рамках этого протокола включают: процедуру термообработки (45 ° С, 25 мин); использование апирог...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана фондом Обернского университета FOP 101002-139294-2050.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Фосфатно-солевой буфер (PBS)Sigma-Aldrich, Сент-Луис, MOP4417
Этиловый спирт Pharmco products Inc. Брукфилд, Коннектикут, США 64-17-5
АгарVWR97064-334
Агаровые пластины MacConkeyVWR470180-742
5% кровяные агаровые пластиныVWR89405-024
Бруцелла кровяной агар с гемином и витамином KVWR89405-032
Буин sFixative Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, США15990
IL-10 Rat ELISA kitInvitrogen, Camarillo, CA, СШАKRC0101
IL-1beta Rat ELISA KitInvitrogen, Camarillo, CA, СШАKRC0011
IL-6 Rat ELISA KitInvitrogen, Camarillo, CA, СШАKRC0061
INF-gamma Rat ELISA KitInvitrogen, Camarillo, CA, США
TNF-alpha Rat ELISA KitInvitrogen, Camarillo, CA, СШАKRC3011
Rat LPS ELISA KitNeoBioLab, MA, СШАRL0275
Environmental Chamber 6020-1Caron, Marietta, OH, США6020-1
Centrifuge Beckman Coulter, Индианаполис, Индиана, СШАOptima L-90K
Ultra Centrifuge
Light микроскоп оптическая системаCitoViva Technology Inc., Оберн, Алабама
Колония счетчикFisher Scientific, Питтсбург, Пенсильвания, СШАRE-3325
Морозильная камераHaier, Бруклин, Нью-Йорк, СШАмикропланшет HCMO50LA
Ultra читательBio-Tek Instrument, Winooski, VT, СШАELx 808
Автоматическая шайба для полосBio-Tek Instrument, Winooski, VT, СШАПипетки ELx50
Gilson, Pipetman, ФранцияP100, P200, P1000
C24 Инкубатор ШейкерNew Brunswick Scientific, Энфилд, Коннектикут, СШАClassic C24
Качающийся шейкерReliable Scientific, Inc., Несбит, штат Массачусетс, США55
чашекПетри Fisher Scientific, Питтсбург, Пенсильвания, США 875713100 мм x 15 мм
SterilGard III AdvanceThe Baker Company, Сэнфорд, штат Массачусетс, СШАSG403
Колбы для выращивания культурCorning Incorporated, Corning, Нью-Йорк, США4995PYREX 250 мл Колбы Эрленмейера
Оптический спектрометр Genesys 20Thermo Scientific, Уолтем, Массачусетс, США.4001
Sony DXC-33 ВидеокамераSony
Richardson тестовое стеклоЭлектронная микроскопия Science, Хатфилд, Пенсильвания, США80303
Многопоровая система очистки водыMilliporeDirect-Q
Image-Pro Plus программное обеспечениеMedia Cybernetics, MD, США
Тройной лучевой балансOHAUS Corporation, Парсиппани, Нью-Джерси, США
Гомогенизатор тканей, DounceVWR71000-518
KRC4021

Ссылки

  1. Crandall, C. G., Gonzalez-Alonso, J. Cardiovascular function in the heat-stressed human. Acta Physiol. 199, 407-423 (2010).
  2. Lambert, G. P. Role of gastrointestinal permeability in exertional heatstroke. Exerc. Sport Sci. Rev. 32, 185-190 (2004).
  3. Yu, J., et al. Effect of heat stress on the porcine small intestine: A morphological and gene expression study. Comp. Biochem. Physiol. A-Mol. Integr. Physiol. 156, 119-128 (2010).
  4. Moseley, P. L., Gisolfi, C. V. New Frontiers in Thermoregulation and Exercise. Sports Med. 16, 163-167 (1993).
  5. Lambert, G. P. Stress-induced gastrointestinal barrier dysfunction and its inflammatory effects. J. Anim. Sci. 87, 101-108 (2009).
  6. Berg, A., Muller, H. M., Rathmann, S., Deibert, P. The gastrointestinal system - An essential target organ of the athlete's health and physical performance. Exerc. Immunol. Rev. 5, 78-95 (1999).
  7. Khan, M. W., et al. Microbes, intestinal inflammation and probiotics. Expert Rev Gastroent. 6, 81-94 (2012).
  8. Quigley, E. M. M. Prebiotics and Probiotics: Their Role in the Management of Gastrointestinal Disorders in Adults. Nutr Clin Pract. 27, 195-200 (2012).
  9. Gore, C., et al. Treatment and secondary prevention effects of the probiotics Lactobacillus paracasei or Bifidobacterium lactis on early infant eczema: randomized controlled trial with follow-up until age 3 years. Clin Exp Allergy. 42, 112-122 (2012).
  10. Gomes, A. C., Bueno, A. A., de Souza, R. G. M., Mota, J. F. Gut microbiota, probiotics and diabetes. Nutr. J. 13, (2014).
  11. Eutamene, H., et al. Synergy between Lactobacillus paracasei and its bacterial products to counteract stress-induced gut permeability and sensitivity increase in rats. J. Nutr. 137, 1901-1907 (2007).
  12. Ait-Belgnaoui, A., et al. Lactobacillus farciminis treatment attenuates stress-induced overexpression of Fos protein in spinal and supraspinal sites after colorectal distension in rats. Neurogastroenterol. Motil. 21, 585-593 (2009).
  13. Fujiya, M., et al. The Bacillus subtilis quorum-sensing molecule CSF contributes to intestinal Homeostasis via OCTN2, a host cell membrane transporter. Cell Host Microbe. 1, 299-308 (2007).
  14. Cutting, S. M. Bacillus probiotics. Food Microbiol. 28, 214-220 (2011).
  15. Pinchuk, I. V., et al. In vitro anti-Helicobacter pylori activity of the probiotic strain Bacillus subtilis 3 is due to secretion of antibiotics. Antimicrob Agents Ch. 45, 3156-3161 (2001).
  16. Sorokulova, I. B., Kirik, D. L., Pinchuk, I. V. Probiotics against Campylobacter pathogens. J. Travel Med. 4, 167-170 (1997).
  17. Gracheva, N. M., et al. The efficacy of the new bacterial preparation biosporin in treating acute intestinal infections. Zh Mikrobiol Epidemiol Immunobiol. , 75-77 (1996).
  18. Horosheva, T. V., Vodyanoy, V., Sorokulova, I. Efficacy of Bacillus probiotics in prevention of antibiotic-associated diarrhoea: a randomized, double-blind, placebo-controlled clinical trial. JMM Case Report. 1, (2014).
  19. Sorokulova, I. B., Krumnow, A. A., Pathirana, S., Mandell, A. J., Vodyanoy, V. Novel Methods for Storage Stability and Release of Bacillus Spores. Biotechnol. Prog. 24, 1147-1153 (2008).
  20. Vogel, H. G., Vogel, W. H. Drug Discovery and Evaluation: Pharmacological Assays. eds H.G. Vogel & W.H. Vogel. Vogel, H. G., Vogel, W. H. , 658-659 (1997).
  21. Bailey, M. T., Engler, H., Sheridan, J. F. Stress induces the translocation of cutaneous and gastrointestinal microflora to secondary lymphoid organs of C57BL/6 mice. J. Neuroimmunol. 171, 29-37 (2006).
  22. Rakoff-Nahoum, S., Paglino, J., Eslami-Varzaneh, F., Edberg, S., Medzhitov, R. Recognition of commensal microflora by toll-like receptors is required for intestinal homeostasis. Cell. 118, 229-241 (2004).
  23. Leon, L. R., Blaha, M. D., DuBose, D. A. Time course of cytokine, corticosterone, and tissue injury responses in mice during heat strain recovery. J. Appl. Physiol. 100, 1400-1409 (2006).
  24. Ribeiro, S. R., et al. Weight loss and morphometric study of intestinal mucosa in rats after massive intestinal resection. Influence of a glutamine-enriched diet. Rev. Hosp. Clìn. Fac. Med. S. Paulo. 59, 349-356 (2004).
  25. Vainrub, A., Pustovyy, O., Vodyanoy, V. Resolution of 90 nm (lambda/5) in an optical transmission microscope with an annular condenser. Opt Lett. 31, 2855-2857 (2006).
  26. Moore, T., Globa, L., Pustovyy, O., Vodyanoy, V., Sorokulova, I. Oral administration of Bacillus subtilis strain BSB3 can prevent heat stress-related adverse effects in rats. J Appl Microbiol. 117, 1463-1471 (2014).
  27. Richardson, T. M. Test slides: Diatoms to divisions-What are you looking at. Proc Roy Microsc Soc. 22, 3-9 (1988).
  28. Moore, T., Sorokulova, I., Pustovyy, O., Globa, L., Vodyanoy, V. Microscopic evaluation of vesicles shed by rat erythrocytes at elevated temperatures. J Therm Biol. 38, 487-492 (2013).
  29. Leon, L. R., Helwig, B. G. Heat stroke: Role of the systemic inflammatory response. J. Appl. Physiol. 109, 1980-1988 (2010).
  30. Kumar, Y., Chawla, A., Tatu, U. Heat Shock Protein 70 as a Biomarker of Heat Stress in a Simulated Hot Cockpit. Aviat Space Env Med. 74 (7), 711-716 (2007).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Предотвращение теплового стресса побочные эффекты у крыс
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.