Предотвращение теплового стресса побочные эффекты у крыс Сенная палочка Штамм

Различные стрессоры влияют на здоровье человека и животных. Температура является одним из самых стрессовых факторов, вызывающих хронические, острые и даже смертельные заболевания¹. Во многих случаях были зарегистрированы изменения в морфологии кишечника и потеря целостности кишечного барьера после теплового стресса^2,3. Этот защитный барьер отвечает за защиту от перемещения кишечных бактерий и их токсинов, в частности липополисахаридов (ЛПС), из просвета во внутренний кровоток^4,5. Стабильность кишечной микробиоты существенно влияет на барьерную функцию кишечника, иммунный ответ хозяина и толерантность к стрессовым условиям⁶. Таким образом, модуляция кишечной микробиоты может обеспечить новый подход к профилактике побочных эффектов, связанных со стрессом.

Полезные бактерии были использованы в качестве многообещающей стратегии для модификации микробиоты кишечника для успешного лечения различных клинических состояний, таких как диарея, воспалительные заболевания кишечника, атопический дерматит, метаболические нарушения^7-10. Пробиотические эффекты полезных бактерий включают выработку необходимых метаболитов для поддержания здоровья кишечника, стимуляцию иммунной системы, повышение толерантности к лактозе, восстановление эпителиальной дисфункции. Пробиотики оказались эффективными в профилактике осложнений, связанных со стрессом, in vitro и на животных моделях^11,12.

Исследователи уделили больше внимания бактериям Bacillus как пробиотикам, потому что эти бактерии поддерживают гомеостаз кишечника¹³ и оказывают благотворное влияние на хозяина¹⁴. Наши предыдущие данные продемонстрировали высокую эффективность пробиотиков Bacillus против патогенов in vitro^15,16 и в клинических исследованиях^17,18. В данной работе мы стремимся оценить профилактический эффект штамма B. subtilis BSB3 против осложнений после теплового стресса.

Все экспериментальные процедуры были одобрены IACUC из Auburn University, Auburn, Алабама.

1. Подготовка медиа-культуры, посуда и бактериальная культура

1. Инокулируйте 10 мл питательного бульона в колбе с одной колонии Сенная палочка BSB3 культуры, выращенной в течение ночи на питательным агаром.
2. Сделать 500 мл спорообразования среды ¹⁹ (на литр: Бакто питательном бульоне, 8 г; 10% (вес / объем) KCl, 10 мл; 1,2% (вес / объем) MgSO ₄ х 7H ₂ O, 10 мл, агар, 15 г) и автоклаве при 121 ^° С в течение 20 мин. Дать остыть до 50 ^° С и добавить следующие стерильные растворы: 1 М Са (NO _{3) 2,} 1 мл; 0,01 М MnCl _2, 1 мл; 1 мМ FeSO _4, 1 мл.
3. Холодный Готовую среду до 40 ^° С в течение 20 мин при комнатной температуре и заливают 25 мл в каждую из 20 стерильные чашки Петри в стерильной камере. Пусть среда затвердеть в течение ночи.
4. Распространение 0,5 мл ночной культуры Bacillus зиЫШз BSB3 на поверхности среды в чашках Петри. Инкубируйте культуру при 37 ^° С в течение 5 дней , пока 90% спорообразования. Reveal поэтапному яркие споры высокой разрешающей микроскопии.
5. Урожай бактерии путем добавления 1 мл стерильного физиологического раствора с фосфатным буфером (PBS) к пластине и соскоб бактерий с поверхности, используя стерильный клеточный распределителю. Храните подвеску в холодильнике, пока не понадобится.
6. Confirm жизнеспособность бактерий при посеве 0,1 мл соответствующего разведения (10 ^-5 до 10 ^-6) бактериальной суспензии на спорообразования средних пластин с последующей инкубацией в течение 18 - 24 ч при 37 ^о С.
7. Количество бактериальных колоний на пластинах с использованием счетчика колоний и расчета титра бактерий в исследуемом суспензию. Готовят бактериальную суспензию с конечной концентрацией 1 × 10 ⁸ КОЕ / мл в PBS.

2. Животные

1. Используйте 32 самцов крыс Sprague-Dawley (250 - 300 г). Поддерживать животных под конкретного патогена условиях со свободным доступом к стандартному окатышей корму и воде. Установить среднюю температуру (21 ± 1 ^° С), влажность (50 ± 5%) и 12 ч свет-темнота циклом.

3. Экспериментальный дизайн

1. Начать лечение животных перорально через зонд ^11, после 2 дней акклиматизации. Используйте шприц с иглой через желудочный зонд. Относитесь 16 крыс с B. Сенная BSB3 суспензии (1 мл на крысу) два раза в день в течение двух дней (B. Сенная группа). Относитесь 16 крыс с PBS (1 мл на крысу) два раза в день в течение двух дней (группа PBS) (рисунок 1).
2. После обработки подразделяют каждую группу (8 крыс в каждой группе): Группа 1 контроля (PBS / без стресса), Группа 2 B. Сенная (B. Сенная / без стресса), группа 3 - стресс (PBS / тепловой стресс) и Группа B. 4- Сенная + стресс (B. Сенная / тепловой стресс).
3. Измерьте ректальную температуру каждой крысы с использованием ElecTronic цифровой термометр. Хранить крыс групп 1 и 2 при комнатной температуре в течение 25 мин. Место животных групп 3 и 4 в климатической камере при 45 ^° С и относительной влажности 55% в течение 25 мин.
4. Затем измеряют ректальную температуру каждой крысы во всех группах с использованием электронно-цифровой термометр. Поместите всех животных при комнатной температуре в течение 4 часов.
5. Обезболить крыс с изофлуран (2 - 4%) в герметичную банку анестезии и наблюдать, пока крысы не глубоко анестезию (отсутствие ответа на носок щепотку). Эвтаназии крыс быстрым обезглавливание с гильотиной.
6. Сбор туловища кровь от каждой крысы ²⁰ (15 - 16 мл) с апирогенной пипеток Into апирогенной пробирки , чтобы получить сыворотку , и сразу же берут образцы крови (7 мкл от каждой крысы) с пипеткой для микроскопического исследования.
7. Помещенный пробирки с кровью в холодильнике в течение не менее 30 мин, чтобы позволить свертывание. Центрифуга трубки при температуре 20 ^° С, 7000 мкг в течение 10 мин и быстроудалить сыворотку с помощью пипетки. Алиготе сыворотки , полученной от каждой крысы в 50 мкл объемы и хранить при температуре -20 ^° С до анализа.

4. Хирургические процедуры

1. Вырезать / обрезать весь мех от брюшной полости и грудной клетки нижней стороны каркаса с электрическими ножницами. Поместите тушку в стерильной камере и лечить бритую поверхность тушки с 70% -ным спиртом.
2. Используйте стерильный скальпель, чтобы создать срединный разрез брюшной полости. Удалить печень, брыжеечные лимфатические узлы, селезенка и тонкой кишки у каждой крысы с использованием стерильного пинцета.

5. Анализ бактериальная транслокация

1. Поместите каждую пробу печени, брыжеечных лимфатических узлов и селезенки, в предварительно взвешенную стерильные пробирки и взвешивают. Рассчитывают вес образца как разницу между весом трубки с пробой и весом пустой трубы.
2. Добавить стерильной PBS к трубе, чтобы получить разведение 1:10 (вес / объем) образца и homogeределить каждого образца с помощью стерильной гомогенизатора стеклотканью для получения гомогенной суспензии ^21.
3. Сделать серийные разведения (10 ^-1 до 10 ^-4) каждого образца в стерильной PBS. Тарелка 0,1 мл всех разведений каждой ткани на поверхности МакКонки и в 5% кровяной агар и Brucella кровяной агар с гемина (0,005 г / л) и витамин К1 (0,01 г / л) пластин.
4. Выдержите МакКонки и в 5% кровяном агаре аэробно и пластины бруцеллы чашках с кровяным агаром в анаэробных условиях при 37 ^° С ^22.
5. Количество колоний аэробных бактерий после 24 часов, и колонии анаэробных бактерий после 48 ч инкубации с использованием счетчика колоний. Экспресс результаты в виде числа колониеобразующих единиц (КОЕ) в грамм ткани.

6. Гистологический анализ

1. Удалите небольшие образцы кишечника у каждой крысы с помощью хирургической процедуры (шаги 4.1 - 4.2). Фикс образцы в Fixative Буэна, встраивать в парафин,подготовить 6 мкм секции и секции окрашиваются гематоксилином и эозином с использованием стандартных процедур ^23.
2. Используйте систему микроскопа высокого разрешения для измерения высоты ворсинок кишечника и общей толщины слизистой оболочки в каждом образце (увеличение 100X) ^24. Анализ 4 образцов от каждой крысы и сделать по крайней мере двадцать измерений в каждом образце. Экспресс результаты в микронах.

7. Анализ цитокина

1. Использование коммерческих наборов крысы ELISA для IL-1; IL-6; TNF-α; INF-γ и IL-10 для измерения уровней цитокинов в сыворотке крови в соответствии с протоколом производителя.
2. Генерировать стандартные кривые для каждого набора проб, проанализированных с использованием стандартов для соответствующего комплекта. Определить уровень цитокинов в каждом образце путем сравнения экспериментальных данных с соответствующей стандартной кривой.

8. Анализ липополисахарида

1. Анализ уровня LPS в сыворотке с помощью крысы LPS ELISA набор поПротокол производителя. Расчетный концентрацию LPS в образцах путем сравнения полученных значений со значениями стандартной кривой.

9. Высокое разрешение световой микроскопии крови

1. Используйте систему микроскопа , описанного ранее ^25,26. Используйте платформу виброизоляции в качестве основы для системы микроскопа и видеокамеры и компьютера ²⁵ для записи изображения в реальном времени . Калибровка тестовых изображений с помощью слайд Ричардсон , как описано выше ^27.
2. Поместите 7 мкл свеженарисованного крови из каждой крысы на предметное стекло, покровное, фотографии и записывать десять кадры изображений 72 × 53,3 мкм ² в каждом образце (увеличение 1,700X).
3. Измерение концентрации везикул с использованием программного обеспечения, которое обеспечивает с высокой разрешающей способностью прямого просмотра оптических изображений в реальном масштабе времени. Проверьте как минимум 20 кадров изображения для каждого условия эксперимента ^28.

10. Statisтики

1. Экспресс все значения как среднее и стандартное отклонение. Провести статистический анализ и график зависимости. Анализ результатов с Т-тест два образца, установите уровень значимости 0,05 для определения статистической значимости.

Средняя температура тела животных до и сразу после теплового стресса был 36,7 ± 0,07 ° С и 40,3 ± 0,17 ° С, соответственно (р <0,05). Экспонирование крыс тепла (группа 3) привела к значительному ингибированию роста ворсинок и общей толщины слизистой оболочки (фиг.2, 3). Пероральное введение штамма BSB3, прежде чем стресс защищен кишечника от вредного воздействия тепла.

Транслокации бактерий из кишечника определяли с помощью бактериологического анализа брыжеечных лимфатических узлов (MLN), печени и селезенки каждой крысы. Бактериальные культуры в концентрации 1,7 · 10 3 ± 4,6 · 10 2 КОЕ / г ткани (рис 4) были выделены только из MLN и печени крыс , предварительно обработанных ПБС , а затем подвергается воздействию высокой температуры (группа 3). Все испытанные образцы от контрольных крыс (группы 1, 2) и от теплонапряженных животныхполучил штамм BSB3 (группа 4) были стерильны. Бактерии не были выделены из образцов селезенке.

Нет изменение IL-1; ИЛ-6, TNF-α, уровни ИНФ-Г цитокины были зарегистрированы в теплонапряженных крыс. В сыворотке животных , которым вводили PBS перед воздействием тепла значительное повышение уровней IL-10 и LPS было найдено (группа 3) - ( На рисунках 5, 6). Предварительная обработка с B. Сенная BSB3 (группа 4) предотвратить возникновение IL-10 и LPS в сыворотке теплонапряженных животных.

Значительное увеличение концентрации свободных везикул (1,4 ± 0,2) × 10 6 (3,8 ± 0,3) × 10 6 везикулы мкл -1 (р <0,001) было найдено в крови крыс, получавших PBS до того теплового стресса (рис 7 , 8). В группе животных, предварительно обработанных с BSB3 никаких изменений в количестве свободных пузырьках не был найден на кормеэр воздействие тепла (Рисунок 7).

Рисунок 1. Схема исследования. Две группы крыс (16 крыс в каждой группе) обрабатывали перорально через зонд с B. Сенная BSB3 (B. Сенная группа) или PBS (группа PBS) дважды в день. На 3-й день каждая группа была разделена на 8 крыс в каждой группе. Крысы из группы 3 и 4 помещали при 45 ° С в течение 25 мин. Контрольные животные (группы 1 и 2) выдерживали при комнатной температуре. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2. Измерение кишечных ворсинок Высота (A) через слизистые и толщина (В) у крыс. Крыс предварительно обработанных PBS илиB. Сенная BSB3 подвергали воздействию 45 о С (стресс) или до комнатной температуры (контроль). Каждая группа состояла из 8 крыс. были взяты двадцать измерения каждого параметра в каждом образце. Значения представлены в виде среднего значения и стандартного отклонения. Полученные результаты были проанализированы с Т-тест два образца на уровне значимости 0,05 для определения статистической значимости. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3. Гистологические Изображения слизистая оболочка кишечника окрашивали гематоксилином и эозином. Крысы были предварительно обработаны PBS или B. Сенная BSB3 и экспонировали до 45 о С (стресс) или до комнатной температуры (контроль) A. PBS / отсутствие стресса;. B. PBS / тепловой стресс; C. Б. Сенная / отсутствие стресса; Д. В. Сенная / тепловой стресс. Вили высота обозначена стрелками. Bar 200 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4. Общее количество бактерий в тканях крыс. Крыс предварительно обрабатывали PBS или B. Сенная BSB3 подвергали воздействию 45 о С (стресс) или до комнатной температуры (контроль). Каждая группа состояла из 8 крыс. Брыжеечные лимфатические узлы, печень и селезенка были асептически удалена от каждой крысы, гомогенизируют и высевали на чашки с агаровой среде для восстановления аэробных и анаэробных бактерий. Общее кол-транслоцированы бактерий (аэробных и анаэробных) представлена ​​в виде колониеобразующих единиц (КОЕ) на грамм ткани. Значения представлены в виде среднее значение и стандартное отклонение. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5. Уровень IL-10 в сыворотке крыс. Крысы , предварительно обработанных PBS или B. Сенная BSB3 подвергали воздействию 45 о С (стресс) или до комнатной температуры (контроль). Каждая группа состояла из 8 крыс. Сыворотка крови получали от каждой крысы и анализировали с помощью ELISA набор для коммерческой крысы. Значения представлены в виде среднего значения и стандартного отклонения. Полученные результаты были проанализированы с Т-тест два образца на уровне значимости 0,05 для определения статистической значимости. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 7. Количество везикул в крови крыс. Крыс предварительно обработанныхс PBS или B. Сенная BSB3 подвергали воздействию 45 о С (стресс) или до комнатной температуры (контроль). Маленькую капельку (7 мкл) свеженарисованного крови помещали на предметное стекло, покрывали, фотографировали и записал десять кадров изображения в каждом образце (увеличение 1,700X). Концентрация везикул измеряют с использованием программного обеспечения, которое обеспечивает высокое разрешение прямого видения оптических изображений в реальном масштабе времени. Двадцать кадров изображений были рассмотрены для каждого условия эксперимента. Значения представлены в виде среднего значения и стандартного отклонения. Полученные результаты были проанализированы с Т-тест два образца на уровне значимости 0,05 для определения статистической значимости. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 8. Увеличение Veсиклей Концентрация в крови после теплового стресса. Видеоизображение крови крыс , предварительно обработанных с PBS до воздействия комнатной температуры (А) или до 45 ° С (В). Маленькую капельку (7 мкл) свеженарисованного крови помещали на предметное стекло, покрывали, фотографировали и записал десять кадров изображения в каждом образце (увеличение 1,700X). Пузырек обозначается как В. Bar 6 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.