Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Измерение выживания Время

7.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54126

⸱

22 июля 2016 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Aquatic Bioscience, Graduate School of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyo, 2School of Marine Biosciences, Department of Marine Biosciences, Kitasato University, 3Josephine Bay Paul Center for Comparative Molecular Biology and Evolution, Marine Biological Laboratory, 4School of Arts and Sciences, University of Houston-Victoria

В этой статье

Краткое содержание

Коловратки — это микроскопический зоопланктон, используемый в качестве моделей в экотоксикологических исследованиях и исследованиях старения. Здесь мы предоставляем протокол для мощного и воспроизводимого измерения времени выживания коловраток Brachionus. Синхронизация условий культивирования в нескольких поколениях имеет особое значение, так как состояние матери влияет на историю жизни потомства.

Аннотация

Коловратки — это микроскопический космополитический зоопланктон, используемый в качестве моделей в экотоксикологических исследованиях и исследованиях старения из-за их нескольких преимуществ, таких как короткая продолжительность жизни, простота культивирования и партеногенез, который позволяет клонировать культуру. Тем не менее, требуется осторожность при измерении времени их выживания, так как на него влияет возраст матери и условия кормления матери. Здесь мы предоставляем протокол для мощного и воспроизводимого измерения времени выживания коловраток Brachionus после тщательной синхронизации условий культивирования в течение нескольких поколений. Эмпирически плохая синхронизация приводит к ранней смертности и постепенному снижению выживаемости, что приводит к слабой статистической мощности. Действительно, в таких условиях ограничение калорий (CR) не смогло значительно продлить продолжительность жизни B. plicatilis, хотя индуцированное CR долголетие было продемонстрировано с хорошо синхронизированными образцами коловраток в прошлых и настоящих исследованиях. Этот протокол, вероятно, полезен для других моделей беспозвоночных, включая плодовую муху Drosophila melanogaster и нематоду Caenorhabditis elegans, поскольку у этих видов также сообщалось о влиянии материнского возраста.

Введение

Коловратки являются микроскопическими космополитичный зоопланктона (<1 мм) , которые составляют филюмом Rotifera 1. Они имеют простой план тело состоит из примерно 1000 соматических клеток, а также характерным реснитчатого аппарата колесного типа называют коронным, который используется для передвижения и кормления. Большинство коловраток принадлежат к классам Monogononta или Bdelloidea, которые содержат около 1600 и 500 видов, соответственно 2. Monogonont коловратки обычно имеют как половое и бесполое репродуктивные фазы (циклический партеногенез), в то время как bdelloid коловратки размножаются обязательным партеногенеза 3. Таким образом, можно получить генетически идентичных особей коловраток, что обеспечивает высокую воспроизводимость в экспериментах. Кроме того, у них есть ряд других преимуществ в качестве модельных организмов, таких как короткий срок жизни, простота культуры, доступность геномных и транскриптомных последовательности данных 4-7 и уникальной филогенетического позиции , удаленные отrthropods и нематоды 8. Rotifers поэтому перспективные модели беспозвоночными в экологические, токсикологические и старения исследований 9-12.

Время выживания под воздействием нагрузки на окружающую среду или химических веществ является часто измеряемым параметром в этих областях исследований 13-19. Тем не менее, необходимо соблюдать осторожность при измерении времени выживания коловраток, поскольку он чувствителен к условиям окружающей среды их матерей. А именно, в monogonont коловраток Brachionus manjavacas, женское потомство от матерей в возрасте имеют более короткую продолжительность жизни , чем те , от молодых матерей; Однако, ограничение материнской калорий (CR) частично компенсирует вредные эффекты передовой возраст матери 20. В B. plicatilis, материнская CR обеспечивает долговечность потомство, долгое время выживания в условиях голода , и высокой окислительной устойчивость к стрессу , связанный с повышенной экспрессии антиоксидантных ферментов 21,22. Возрастной эффект материнскойтакже наблюдается в bdelloid коловраток 23. Таким образом, условия эксперимента коловратках должны быть тщательно синхронизирована в течение нескольких поколений, прежде чем измерения времени выживания.

Здесь мы приводим протокол для измерения времени выживания в Brachionus коловраток следующей синхронизации условий культивирования в течение нескольких поколений. Периодическое голодание (КРП), изменение CR , где коловратки подают периодически, наносили выявить эффект синхронизации из - за известных эффектов IF на продолжительность жизни 22,24.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка средств массовой информации

Примечание: Используйте половину разбавленный Brujewicz искусственную морскую воду с соленостью 16,5 п.п. (PSU). Другие искусственные морские воды также часто используются для культивирования Brachionus коловраток 25,26.

  1. Добавить 454 мМ NaCl, 26 мМ MgCl 2, 27 мМ MgSO 4, 10 мМ КСl, и 10 мМ CaCl 2 до 4,5 л дистиллированной воды (конечный объем будет 5 л). В качестве альтернативы, используйте деионизованной воды для разбавления вместо дистиллированной воды. Добавить CaCl 2 после растворения всех других солей.
  2. Приготовьте 0,48 М NaHCO 3 исходного раствора (200x концентрации). Добавить 25 мл нее к указанному выше раствору. Конечная концентрация NaHCO 3 составляет 2,4 мМ.
  3. Подготовить 0,4 М NaBr исходного раствора (500x концентрации). Добавьте 10 мл нее к указанному выше раствору. Конечная концентрация NaBr составляет 0,8 мМ. Изготавливают до 5 л дистиллированной водой.
  4. Фильтр решение с мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм.Разбавить его два раза стерильной водой перед использованием (об / об).
    Примечание: Можно сделать концентрацию 2x из Brujewicz искусственной морской воды в качестве исходного раствора.

2. Общие условия культивирования

  1. Культура лабораторно-поднятый или дикие захваченное коловраток в стерильной 100 мл стакане от 20 до 30 ° С. Более высокие температуры приводят к более коротким и продолжительности жизни ускоренного размножения. Используйте 25 ° C для удобства экспериментов. Плотность коловраток или объем искусственной морской воде не является большой проблемой здесь.
  2. Культура диетических видов микроводорослей в искусственной морской воде 11. См Снелл и др. (2014) для деталей 11. Как правило, используют Tetraselmis tetrathele (~ 2 х 10 5 клеток / мл 27,28), Т. Suecica (~ 6 × 10 5 клеток / мл 25,29) и Nannochloropsis oculata (~ 7 х 10 6 клеток / мл 30,31). Так как диета водорослей (виды, культура Кондитионы, биохимические композиции) существенно влияет на время выживания Brachionus коловраток, используют один и тот же много микроводоросли во всех экспериментальных группах.
  3. Держите запаса популяции коловраток в периодической культуре путем подачи и изменения средств массовой информации время от времени (например, кормить каждые 2 дня и прививать каждую неделю). Многие новорожденные и взрослые, имеющие 2-3 яйца можно наблюдать, когда коловратки находятся в оптимальных условиях.
    Примечание: альтернативный способ получения экспериментальных коловраток является люк покоящиеся яйца. Rotifers вылупившиеся из яйца покоящихся считаются хорошо синхронизированы, и их продолжительность жизни существенно не отличается от коловраток вылупились из яиц amictic 11. Тем не менее, коловратки из покоящихся яиц начинают воспроизведение раньше, чем те из amictic яиц. Таким образом, необходимо проявлять осторожность при измерении их репродуктивных признаков.

3. Синхронизация коловраток путем предварительной культуры

  1. Выберите один коловраток из стOck населения и культуры, как описано в 2.1-2.3 создать подгруппу, которая будет использоваться для экспериментов. Обычно культуру в течение двух недель.
  2. Собирают икряных коловраток из субпопуляции (собрать удвоенное количество лиц, которые будут использоваться для эксперимента). Культура их как одну когорту (плотность: ~ 50 особей / мл) в культуральной пластины 6-луночный , как описано в 2.1-2.3 в свежем средах при неограниченном кормлении. Контроль плотности населения имеет важное значение , так как кондиционированная среда влияет на репродуктивную физиологию Brachionus коловраток 32,33.
  3. Передача новорожденные вылупились из первых яиц для взрослых "вновь подготовленной культуральной среды. Повторите эту процедуру в течение 2-3 поколений.
  4. Используйте новорожденные , заштрихованные в течение определенного периода времени (например, <3 ч) для измерения времени выживания. Для того, чтобы избежать возможного смещения при выборе одного человека, хотя и очень маловероятно, проверить воспроизводимости с использованием нескольких незасвисающие субпопуляции.
    Примечание: Как правило, коловратки размножаются только бесполым при этом условии, гарантировать, что никакие мужчины не присутствуют на протяжении всего эксперимента. Самцы имеют меньшие размеры, чем у новорожденных и, как правило, движутся быстрее, чем у женщин. Mictic самки имеют различные продолжительность жизни от amictic самок при определенных условиях 29.

4. Измерения времени выживания

  1. Место новорожденные в пластиковых пластин (как правило, 24- или 48-луночные планшеты с каждой лунки, содержащих 1 мл искусственной морской воды).
  2. Через 24 ч интервалами, передают коловраток вновь подготовленных средств массовой культуры или на 12 интервалов час, если при более высокой температуре (30 ° C или выше). Запишите число потомков и будет ли каждый человек мертв или жив. Запись коловраток, как мертвый, когда реснички движение короны полностью прекратилось.
    Примечание: Коловратки часто прилипают к боковым стенкам лунки. Нежный пипеткой воды помогает найти их. Если коловратки не найдены или аре случайно повреждены пипеткой, записывать их как "цензуру", а не как "мертвые".
  3. Удалить новорожденные, когда экспериментальные коловратки активно воспроизведения. Новорожденные быстро растут, и это иногда трудно отличить их от экспериментальных коловраток.

5. Анализ данных

  1. Создать кривую выживаемости Каплана-Мейера (рисунки 1 и 2) путем построения кумулятивный показатель выживаемости по оси Y и времени на оси X. Это является наиболее распространенным представлением данных по выживаемости. С помощью непараметрического лог-рангового (также называемый тест Mantel-Cox) для статистического сравнения выживаемости 34. Лог-рангового также входит в других стандартных статистических пакетов, таких как JMP и R.
    Примечание: Не используйте Стьюдента или дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим параметрической множественного сравнения Стьюдента , так как нормальное распределение, как правило , не могут быть удовлетворены данными выживаемости 35. Кроме того, эти метоDS не принимают цензурированным лиц во внимание. тест Манна-Уитни U можно использовать, если нет цензурированных данных.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты


На рисунке 1 показаны типичные кривые выживаемости слабо синхронизированных популяций (из двух повторностей). В этом эксперименте, коловратки были либо кормили каждый день [вволю (AL) , группа] или через день (ЕСЛИ группа). Медиана выживаемости составила 13 и 18 дней в AL и IF групп соответственно. Несмотря на то, как хорошо известно, что если продлевает срок службы коловратки, этот эксперимент не удалось обнаружить статистически значимую разницу между про...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Текущий протокол описывает метод измерения времени выживания в Brachionus коловраток. Важным шагом является синхронизация условий коловраток в течение нескольких поколений. Когда экспериментальные коловратки хорошо синхронизированы, типичный тип кривой выживаемости я наблюдается с очень небольшим количеством ранней смертности , как сообщалось в ряде предыдущих исследований 18,24,37,38. Поэтому стандартные отклонения времени выживания становятся меньше по сравнению с плохо синхронизированных коловрато...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарны Джорджу Jarvis, Марта Бок и Бетт Hecox-Lea, морской биологической лаборатории, за помощь в съемках фильма.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Хлорид натрияWako190-13921
Хлорид магнияWako136-03995
Сульфат магнияWako131-00427
Хлорид калияWako168-22111
Хлорид кальцияWako035-00455
Бикарбонат натрияWako199-05985
Бромид натрияWako190-01515
Мембранный фильтр (0,45&м; m размер пор)МиллипорыHAWP04700
Культуральная пластина, 6-луночная, необработаннаяScientific6902D01Плоскодонная
культуральная пластина, 48-луночная, необработаннаяThomas Scientific6902D07Плоскодонная
тетрасельмис, живаяКаролина Биологическая компанияснабжения 152610
PRISM 6GraphPad Версия программного обеспечения6.0d
Thomas

Ссылки

  1. Wallace, R. L., Snell, T. W., Ricci, C., Nogrady, T. Rotifera Vol.1: Biology, ecology and systematics. , 2nd edn, SPB Academic Publishing. (2006).
  2. Segers, H. Annotated checklist of the rotifers (Phylum Rotifera), with notes on nomenclature, taxonomy and distribution. , Magnolia Press. Auckland. (2007).
  3. Mark Welch, D. B., Meselson, M. Evidence for the evolution of bdelloid rotifers without sexual reproduction or genetic exchange. Science. 288 (5469), 1211-1215 (2000).
  4. Suga, K., Mark Welch, D., Tanaka, Y., Sakakura, Y., Hagiwara, A. Analysis of expressed sequence tags of the cyclically parthenogenetic rotifer Brachionus plicatilis. PLoS ONE. 2, e671(2007).
  5. Denekamp, N. Y., et al. Discovering genes associated with dormancy in the monogonont rotifer Brachionus plicatilis. BMC Genomics. 10, 108(2009).
  6. Lee, J. -S., et al. Sequence analysis of genomic DNA (680 Mb) by GS-FLX-Titanium sequencer in the monogonont rotifer, Brachionus ibericus. Hydrobiologia. 662 (1), 65-75 (2010).
  7. Flot, J. -F., et al. Genomic evidence for ameiotic evolution in the bdelloid rotifer Adineta vaga. Nature. 500 (7463), 453-457 (2013).
  8. Dunn, C. W., et al. Broad phylogenomic sampling improves resolution of the animal tree of life. Nature. 452 (7188), 745-749 (2008).
  9. Yoshinaga, T., Kaneko, G., Kinoshita, S., Tsukamoto, K., Watabe, S. The molecular mechanisms of life history alterations in a rotifer: a novel approach in population dynamics. Comp. Biochem. Physiol. B Biochem. Mol. Biol. 136 (4), 715-722 (2003).
  10. Dahms, H. -U., Hagiwara, A., Lee, J. -S. Ecotoxicology, ecophysiology, and mechanistic studies with rotifers. Aquat. Toxicol. 101 (1), 1-12 (2011).
  11. Snell, T. W. Rotifers as models for the biology of aging. Int. Rev. Hydrobiol. 99 (1-2), 84-95 (2014).
  12. Snell, T. W., Johnston, R. K., Gribble, K. E., Mark Welch, D. B. Rotifers as experimental tools for investigating aging. Invertebr. Reprod. Dev. 59, Suppl 1. 5-10 (2015).
  13. Kaneko, G., et al. Molecular characterization of Mn-superoxide dismutase and gene expression studies in dietary restricted Brachionus plicatilis rotifers. Hydrobiologia. 546, 117-123 (2005).
  14. Yoshinaga, T., et al. Insulin-like growth factor signaling pathway involved in regulating longevity of rotifers. Hydrobiologia. 546, 347-352 (2005).
  15. Ozaki, Y., Kaneko, G., Yanagawa, Y., Watabe, S. Calorie restriction in the rotifer Brachionus plicatilis enhances hypoxia tolerance in association with the increased mRNA levels of glycolytic enzymes. Hydrobiologia. 649 (1), 267-277 (2010).
  16. Kailasam, M., et al. Effects of calorie restriction on the expression of manganese superoxide dismutase and catalase under oxidative stress conditions in the rotifer Brachionus plicatilis. Fish. Sci. 77 (3), 403-409 (2011).
  17. Garcìa-Garcìa, G., Sarma, S., Núñez-Orti, A. R., Nandini, S. Effects of the mixture of two endocrine disruptors (ethinylestradiol and levonorgestrel) on selected ecological endpoints of Anuraeopsis fissa and Brachionus calyciflorus (Rotifera). Int. Rev. Hydrobiol. 99 (1-2), 166-172 (2014).
  18. Yang, J., Mu, Y., Dong, S., Jiang, Q., Yang, J. Changes in the expression of four heat shock proteins during the aging process in Brachionus calyciflorus (rotifera). Cell Stress Chaperones. 19 (1), 33-52 (2014).
  19. Han, J., et al. Sublethal gamma irradiation affects reproductive impairment and elevates antioxidant enzyme and DNA repair activities in the monogonont rotifer Brachionus koreanus. Aquat. Toxicol. 155, 101-109 (2014).
  20. Gribble, K. E., Jarvis, G., Bock, M., Mark Welch, D. B. Maternal caloric restriction partially rescues the deleterious effects of advanced maternal age on offspring. Aging Cell. 13 (4), 623-630 (2014).
  21. Yoshinaga, T., Hagiwara, A., Tsukamoto, K. Effect of periodical starvation on the survival of offspring in the rotifer Brachionus plicatilis. Fish. Sci. 67 (2), 373-374 (2001).
  22. Kaneko, G., et al. Calorie restriction-induced maternal longevity is transmitted to their daughters in a rotifer. Funct. Ecol. 25 (1), 209-216 (2011).
  23. Lansing, A. I. A transmissible, cumulative, and reversible factor in aging. J. Gerontol. 2 (3), 228-239 (1947).
  24. Yoshinaga, T., Hagiwara, A., Tsukamoto, K. Effect of periodical starvation on the life history of Brachionus plicatilis O. F. Müller (Rotifera): a possible strategy for population stability. J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 253 (2), 253-260 (2000).
  25. Gribble, K. E., Kaido, O., Jarvis, G., Mark Welch, D. B. Patterns of intraspecific variability in the response to caloric restriction. Exp. Gerontol. 51, 28-37 (2014).
  26. Snell, T. W., Johnston, R. K. Glycerol extends lifespan of Brachionus manjavacas (Rotifera) and protects against stressors. Exp. Gerontol. 57, 47-56 (2014).
  27. Kim, H. -J., Hagiwara, A. Effect of female aging on the morphology and hatchability of resting eggs in the rotifer Brachionus plicatilis Müller. Hydrobiologia. 662 (1), 107-111 (2011).
  28. Kim, H. -J., et al. Light-dependent transcriptional events during resting egg hatching of the rotifer Brachionus manjavacas. Mar. Genomics. 20, 25-31 (2015).
  29. Gribble, K. E., Welch, D. B. M. Life-span extension by caloric restriction is determined by type and level of food reduction and by reproductive mode in Brachionus manjavacas (Rotifera). J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 68 (4), 349-358 (2013).
  30. Kaneko, G., Kinoshita, S., Yoshinaga, T., Tsukamoto, K., Watabe, S. Changes in expression patterns of stress protein genes during population growth of the rotifer Brachionus plicatilis. Fish. Sci. 68 (6), 1317-1323 (2002).
  31. Kim, H. J., Sawada, C., Hagiwara, A. Behavior and reproduction of the rotifer Brachionus plicatilis species complex under different light wavelengths and intensities. Int. Rev. Hydrobiol. 99 (1-2), 151-156 (2014).
  32. Yoshinaga, T., Hagiwara, A., Tsukamoto, K. Effect of conditioned media on the asexual reproduction of the monogonont rotifer Brachionus plicatilis O. F. Müller. Hydrobiologia. 412, 103-110 (1999).
  33. Ohmori, F., Kaneko, G., Saito, T., Watabe, S. A novel growth-promoting protein in the conditioned media from the rotifer Brachionus plicatilis at an early exponential growth phase. Hydrobiologia. 667 (1), 101-117 (2011).
  34. GraphPad Statistics Guide. , Available from: http://www.graphpad.com/guides/prism/6/statistics/ (2015).
  35. Collet, D. Modelling Survival Data in Medical Research. , 2nd edn, Chapman & Hall/CRC. 151-193 (1993).
  36. Bouliotis, G., Billingham, L. Crossing survival curves: alternatives to the log-rank test. Trials. 12, Suppl 1. A137(2011).
  37. Yang, J., et al. Changes in expression of manganese superoxide dismutase, copper and zinc superoxide dismutase and catalase in Brachionus calyciflorus during the aging process. PloS ONE. 8 (2), e57186(2013).
  38. Snell, T. W., Johnston, R. K., Rabeneck, B., Zipperer, C., Teat, S. Joint inhibition of TOR and JNK pathways interacts to extend the lifespan of Brachionus manjavacas (Rotifera). Exp. Gerontol. 52, 55-69 (2014).
  39. Klass, M. R. Aging in nematode Caenorhabditis-elegans - major biological and environmental-factors influencing life-span. Mech. Ageing Dev. 6 (6), 413-429 (1977).
  40. Priest, N. K., Mackowiak, B., Promislow, D. E. L. The role of parental age effects on the evolution of aging. Evolution. 56 (5), 927-935 (2002).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Brachionus plicatilis
Измерение выживания Время
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.