Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

Summary

We present an approach for visualizing fluorescent protein DNA binding peptide (FP-DBP)-stained large DNA molecules tethered on the polyethylene glycol (PEG) and avidin-coated glass surface and stretched with microfluidic shear flows.

Abstract

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating interactions between DNA and its binding proteins. Here, we report a method that uses fluorescent microscopy for visualizing large DNA molecules tethered on the surface. First, glass coverslips are biotinylated and passivated by coating with biotinylated polyethylene glycol, which specifically binds biotinylated DNA via avidin protein linkers and significantly reduces undesirable binding from non-specific interactions of proteins or DNA molecules on the surface. Second, the DNA molecules are biotinylated by two different methods depending on their terminals. The blunt ended DNA is tagged with biotinylated dUTP at its 3′ hydroxyl terminus, by terminal transferase, while the sticky ended DNA is hybridized with biotinylated complimentary oligonucleotides by DNA ligase. Finally, a microfluidic shear flow makes single DNA molecules stretch to their full contour lengths after being stained with fluorescent protein-DNA binding peptide (FP-DBP).

Introduction

Визуализация больших молекул ДНК привязанных на стеклянных или бусинки поверхностей была использована для исследования ДНК-белковых взаимодействий, динамика белка на подложке ДНК, ^1,2 и физики полимеров. ^3,4 Платформа для одной привязи больших молекул ДНК имеет несколько различны преимущества по сравнению с другими методами ДНК иммобилизации. ⁵ Во- первых, большая молекула ДНК , привязанным на поверхности имеет естественную конформацию случайной катушки без сдвигового потока, который является критически важным для белка ДНК-связывающим признать его сайт связывания. Во-вторых, это очень легко изменить химическую среду вокруг молекулы ДНК для серии ферментативных реакций в проточной камере. В- третьих, микрожидком поток сдвига вызывает молекулы ДНК растяжение до 100% от полной длины контура, который очень трудно достичь с помощью альтернативного удлинения ДНК подходов , таких как поверхности иммобилизации ⁶ и удержания наноканале. ⁷ Полностью stretched молекула ДНК также предоставляет позиционную информацию, которая может оказаться полезной для мониторинга ферментативные движения на геномной карте.

Тем не менее, ДНК привязывать подход имеет критический недостаток в том, что интеркалирующего красителя, такие как YOYO-1 обычно вызывает привязные молекулы ДНК, чтобы быть легко нарушена светом возбуждения флуоресценции. Как правило, крупные молекулы ДНК должны быть окрашены с флуоресцентным красителем для визуализации под флуоресцентным микроскопом. Для этой цели, YOYO-1 или другие ТОТО серии красители используются, главным образом, потому что эти красители флуоресцируют только тогда , когда они интеркаляции двухцепочечной ДНК. ⁸ Тем не менее, хорошо известно , что бис-интеркалирующие краситель вызывает Светоиндуцированное ДНК фото-расщеплению , так как из интеркаляции флуорофоров ⁹ . Кроме того, флуоресцентно окрашенные молекулы ДНК , привязанные на поверхности являются более хрупкими , так как сдвиговые потоки могут оказывать нарушая силы на свободно движущихся молекул ДНК. Поэтому мы разработали FP-DBP как роман DБелок краситель NA-окрашивание для визуализации больших молекул ДНК на привязи на поверхности. Преимущество использования FP-DBP является то , что он не вызывает фото-расщепление ДНК – молекул , к которым он связывается. ¹⁰ Кроме того, FP-ДАД не приводит к увеличению контурной длины ДНК, в то время как бис-интеркалирующие красители увеличивают длину контура примерно на 33%.

Этот метод видео вводит экспериментальный подход для привязывания больших молекул ДНК к ПЭГ-биотин поверхности. На рисунке 1 показаны различные подходы привязывать ДНК с тупыми концами и липкими концами. Таким образом, этот способ окрашивания может быть применен к любому типу молекулы ДНК. 2 изображает схематическое представление сборки проточную камеру , которым можно управлять с помощью шприца насос для генерирования сдвиговых потоков для растягиваться молекулы ДНК, а также для загрузки химических и фермент решения. Рисунок 3 демонстрирует микрофотографии полностью растянутых молекул ДНК привязанных на PEGylatред поверхность ¹¹ и окрашивали FP-DBP.

Protocol

1. ДНК Биотинилирование Биотинилирование тупыми ДНК с использованием терминальная трансфераза (TdT) Примечание: Используйте T4 ДНК (166 т.п.н.), которая представляет собой ДНК с тупыми. Добавьте 5 мкл 2,5 мМ CoCl 2, 5 мкл 10 × реакционного буфера, 0,5 мкл 10 мМ биотин-11-дУТФ, 0,5 мкл концевой трансферазы (10 единиц), и 0,5 мкл Т4 – ДНК (0,5 мкг / мкл) к реакционной смеси. Сделать до конечного объема 50 мкл путем добавления 38,5 мкл воды. Инкубируют реакционную смесь при температуре 37 ° С в течение 1 часа. Примечание: Более продолжительное время реакции может дать двойной привязанные ДНК, то есть, возможно , что биотины помечены на обоих концах. Остановить реакцию добавлением 5 мкл 0,5 М ЭДТА, рН 8. Держите трубку при температуре 4 ° С. Биотинилирование липкого завершенного ДНК с помощью ДНК – лигазы Примечание: Используйте Х ДНК (48,5 т.п.н.), который представляет собой липкую конец ДНК. <ол> Добавить 1 мкл ДНК-лигазы Т4, 5 мкл 10 × буфера для лигирования 1 мкл 25 нг / мкл λ ДНК фага, и добавляют 43 мкл воды, чтобы конечный объем 50 мкл. Держите трубку при температуре 4 ° С. 2. функционализированных поверхности дериватизации Примечание:. Чтобы привязанный конец молекулы ДНК на поверхности стекла, основная группа амина силанизированы на покровное с последующим биотин-ПЭГ – покрытием , как показано на рисунке 1 Этот процесс Пегилирование важен для визуализации ДНК одной молекулы , так как ему может значительно уменьшить случайный шум, создаваемый приложением нежелательных молекул на поверхности. Piranha Очистка Примечание: Решения Piranha энергично реагирует с органическими материалами, поэтому с ним следует обращаться с осторожностью, в соответствии с надлежащими правил техники безопасности. Место покровные на политетрафторэтилена (PTFE) стойку, и держать их бу PTFE Резьбовое уплотнение ленты в продольном направлении, половина на краю поверхностей и половина на стойке. После того, как обертку, оставить длинный кусок (~ 5 см) ленты для обработки стойки во время процедуры очистки. Заполните стеклянный стакан объемом 1 л 350 мл H 2 SO 4 и 150 мл H 2 O 2 , чтобы сделать пиранья решение в вытяжном шкафу. Поместите стойку в пираньи растворе в течение 2 часов. Пустой раствор пиранья из стакана, и покровные тщательно промыть деионизированной водой до рН воды в химическом стакане достигает нейтральной. Используйте рН полоски бумаги. Разрушать ультразвуком стойки покровных стеклах в химический стакан, содержащий воду, в течение 30 мин. Пустые воды из стакана непосредственно перед амино- силанизацией. Используйте 75 Вт озвучивания мощности для очистки и дериватизации стеклянных подложек. Aminosilanization на поверхности стекла Добавить 2 мл N – [3- (триметоксисилил) пропил] этилендиамина и 10 мл ледяной уксусной кислоты , 200 млметилового спирта в чистом полипропиленовый контейнер для приготовления раствора aminosilanization. Поместите очищенные покровные в полипропиленовый контейнер. Встряхнуть их при 100 оборотах в минуту и ​​комнатной температуре в течение 30 мин. Разрушать ультразвуком химический стакан с дериватизированных промахов покрова в течение 15 мин при 75 Вт Встряхнуть их при 100 оборотах в минуту и ​​комнатной температуре в течение по крайней мере 30 мин. Очищать раствор из стакана, и тщательно споласкивать покровные, один раз с метиловым спиртом, и в два раза этиловым спиртом. Храните покровные в этиловом спирте и использовать их в течение двух недель. Пегилирование покровного Сделать 10 мл 0,1 М раствором бикарбоната натрия (NaHCO 3). Фильтр решение с шприцевой фильтр 0,22 мкм. Растворите 2 мг карбоната биотин-ПЭГ-сукцинимидил (биотин-ПЭГ-SC) и 80 мг ПЭГ-сукцинимидил валерат (мПЭГ-SVG) в 350 мкл раствора NaHCO 3. Используйте легкую защитную трубку. Вихре трубки энергично в течение 10 сек, и центрифуга это при 10000 х г в течение 1 мин для удаления пузырьков. Промыть стекло с ацетоном, затем промывали этиловым спиртом. Разрешить слайд высохнуть на воздухе полностью. Поместите каплю (50 мкл) раствора PEG на чистую предметное стекло. Накройте капельку мягко с аминокислотой силанизированы покровным, без создания каких-либо пузырьков. Место слайды в течение 3 ч, чтобы в течение ночи в темноте, хорошо выровнена влажной камере при комнатной температуре. Используйте пустой держатель наконечника пипетки в камере, с водой на дне. Уплотнение остаточного раствора ПЭГ в трубке и держать его при температуре 4 ° С. Промыть покровное Pegylated тщательно деионизированной водой. Храните его в темном и сухом месте до использования. 3. Сборка проточной камерой Изготовить пробивки акриловый держатель, как показано на рисунке 2. Убедитесь , что диаметр трубки вставки составляет 0,762 мм, и обозначают одно отверстие впускной и другойвыпускное отверстие (рисунок 2). Поместите двухсторонние липкой лентой полоски (шириной 5-6 мм) на держателе акриловой (рисунок 2), совместив перпендикулярно к входным и выходным отверстием, не пошевелив каких – либо отверстий каналов. Используйте эти ленты полосы, как стены многоканальные сделать камеры. Скраб ленту, используя наконечник пипетки. Поместите покровное Pegylated на вершине, чтобы сделать камеры потока, со стороной пегилированного лицом вниз. Для того, чтобы предотвратить какое-либо решение от утечки, нажмите на верхнюю часть покровное над областью, где двухсторонние ленты размещены. Добавить быстрый сухой эпоксидный клей , чтобы закрыть края камеры в верхней и в нижней части (желтый цвет на рисунке 2). Подключение короткий кусок (2,5 см) из трубки (внешний диаметр, OD, 0,042 ") к герметичного шприца и герметизировать стык с эпоксидным клеем. Подключение длинные гибкие трубки (OD: 0,03 ") к трубопроводу, связанного с шприцем и герметизировать стык с эпоксидным клеем. Заполните TUBIнг связан с шприца с деионизированной водой. Убедитесь, что нет воздушных пузырьков. Вставьте трубку в отверстие проточной камеры запечатанный с эпоксидным клеем. Поместите желтый наконечник (200 мкл наконечника) на другое отверстие в резервуаре. 4. Пример Загрузка в поток палаты Примечание: Neutravidin могут быть заменены другими авидин белками, такими как стрептавидин. Все реакции могут быть выполнены при комнатной температуре, если это не упоминается. Возьмем раствор образца в виде желтого наконечника, и установить наконечник с раствором на отверстие акрилового держателя (рисунок 2b). Установить расход шприцевой насос со скоростью 50 мкл / мин. Нагрузка 20 мкл авидин белка (25 мкг / мл в растворе Т50, трис 10 мМ, NaCl, 50 мМ, рН 8), и держать его в течение 10 мин. Нагрузка 20 мкл биотинилированных олигонуклеотидами (100 мкМ в 1 × ТЕ), и держать его в течение 10 мин. Если терминал трансферазы используется, пропустите загрузкуолигодезоксирибонуклеотидов. Нагрузка 20 мкл раствора ДНК из стадии 1 в проточную камеру при скорости потока 10 мкл / мин, и держать его в течение 30 мин. Промойте проточную камеру с 1 × TE, и загружают 40 мкл FP-ДАД 10 (~ 80 нм). Соблюдайте ДНК под флуоресцентным микроскопом с непрерывным потоком окрашивающих молекул в 1 × TE на 60X объектива. Использование 488 нм твердотельный лазер для возбуждения FP (EGFP) -DBP. Для полного участка молекулы ДНК, применяют различные скорости потока в соответствии с длиной ДНК, используемых. Например, применить 50 мкл / мин 48,5 т.п.н. Х ДНК, и 100 мкл / мин в течение 166 т.п.н. Т4 ДНК. Для повторного использования держателя акриловой, замочить собранные камеры потока в бытовой растворе моющего средства 12. Удалите ленты и эпоксидной смолы с бритвенным лезвием и втирают с руками, чтобы полностью снять их. Прочистить отверстия шприца иглы. Хранить держатели в деионизированной воде до дальнейшего использования.

Representative Results

На рисунке 1 показаны два различных метода ДНК привязывание в зависимости от концевых структур молекулы ДНК. На рисунке 1а показано , как липкие законченные молекулы ДНК гибридизовали с комплементарными биотинилированных олигонуклеотидов, которые ?…

Discussion

Здесь мы представляем платформу для визуализации длинных молекул ДНК биотинилированного для закрепления на поверхностях. Мы сообщали подход к молекулам ДНК , привязанных на авидин белковой поверхности , покрытой с биотинилированного бычьего сывороточного альбумина. ⁶ В более р?…

Materials

1. DNA Biotinylation
1.1) Biotinylation of blunt-end DNA using Terminal Transferase (TdT)
Terminal Transferase	New England Biolabs	M0315S	Provided with 10x reaction buffer, 2.5 mM Cobalt chloride
Biotin-11-dUTP	Invitrogen	R0081	Biotin-ddNTP is also available
T4GT7 Phage DNA	Nippon Gene	318-03971
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma-Aldrich	E6758	EDTA
1.2) Biotinylation of sticky end DNA Using DNA Ligase
T4 DNA Ligase	New England Biolabs	M0202S	Provided with 10x reaction buffer
Lambda Phage DNA	Bioneer	D-2510	Also available at New England Biolabs
2. Functionalized Surface Derivatization
2.1) Piranha Cleaning
Coverslip	Marienfeld-Superior	0101050	22×22 mm, No. 1 Thickness
Teflon rack			Custom Fabrication
PTFE Thread Seal Tape	Han Yang Chemical Co. Ltd.	3032292	Teflon™ tape
Sulferic acid	Jin Chemical Co. Ltd.	S280823	H2SO4, 95 % Purity
Hydrogen peroxide	Jin Chemical Co. Ltd.	H290423	H2O2, 35 % in water
Sonicator	Daihan Scientific Co. Ltd.	WUC-A02H	Table-top Ultrasonic Cleaner
2.2) Aminosilanization on Glass Surface
N-[3-(Trimethoxysilyl)propyl] ethylenediamine	Sigma-Aldrich	104884
Glacial Acetic Acid	Duksan Chemicals	414	99 % Purity
Methyl Alcohol	Jin Chemical Co. Ltd.	M300318	99.9 % Purity
Polypropylene Container	Qorpak	PLC-04907
Ethyl Alcohol	Jin Chemical Co. Ltd.	A300202	99.9 % Purity
2.3) PEGylation of the coverslip
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
Syringe Filter	Sartorius	16534———-K
Biotin-PEG-SC	Laysan Bio	Biotin-PEG-SC-5000
mPEG-SVG	Laysan Bio	MPEG-SVA-5000
Acetone	Jin Chemical Co. Ltd.	A300129	99 % Purity
Microscope Slides	Marienfeld-Superior	1000612	~76x26x1 mm
3. Assembling a Flow Chamber
Acrylic Support			Custom Fabrication
Double-sided Tape	3M		Transparent type
Quick-dry Epoxy	3M
Polyethylene Tubing	Cole-Parmer	06417-11, 06417-21
Gas Tight 250 µl Syringe	Hamilton	81165
Syringe Pump	New Era Pump Systems Inc.	NE-1000
4. Sample Loading into Flow Chamber
Neutravidin	Thermo Scientific	31000
Tris base	Sigma-Aldrich	T1503-5KG	Trizma base
Microscope	Olympus	IX70
EMCCD Camera	Q Imaging	Rolera EM-C2
Solid-state Laser (488 nm)	Oxxius	LBX488
Alconox	Alconox Inc.