Методическая статья

Визуализация поверхностного привязанным Большой Молекулы ДНК с флуоресцентной ДНК связыванием белков пептид

DOI:

10.3791/54141

⸱

23 июня 2016 г.

 , 
1Department of Chemistry and Interdisciplinary Program of Integrated Biotechnology, Sogang University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы представляем подход к визуализации окрашенных флуоресцентным белком ДНК-связывающего пептида (FP-DBP) больших молекул ДНК, привязанных к поверхности стекла с полиэтиленгликолем (ПЭГ) и покрытием авидин и растянутых микрофлюидными сдвиговыми потоками.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Большие молекулы ДНК, привязанные к функционализированной поверхности стекла, были использованы в физике полимеров и биохимии, в частности, для исследования взаимодействий между ДНК и связывающими ее белками. В этой статье мы расскажем о методе, который использует флуоресцентную микроскопию для визуализации больших молекул ДНК, привязанных к поверхности. Во-первых, стеклянные покровные стекла биотинилируются и пассивируются путем покрытия биотинилированным полиэтиленгликолем, который специфически связывает биотинилированную ДНК через белковые линкеры авидина и значительно снижает нежелательное связывание от неспецифических взаимодействий белков или молекул ДНК на поверхности. Во-вторых, молекулы ДНК биотинилируются двумя различными методами в зависимости от их окончаний. ДНК с тупым концом помечается биотинилированным dUTP на его 3'-гидроксильном конце с помощью терминальной трансферазы, в то время как ДНК с липким концом гибридизуется с биотинилированными комплементарными олигонуклеотидами с помощью ДНК-лигазы. Наконец, микрофлюидный сдвиговый поток заставляет отдельные молекулы ДНК растягиваться на всю длину контура после окрашивания флуоресцентным пептидом, связывающим белок-ДНК (ФП-ДБФ).

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Визуализация больших молекул ДНК привязанных на стеклянных или бусинки поверхностей была использована для исследования ДНК-белковых взаимодействий, динамика белка на подложке ДНК, 1,2 и физики полимеров. 3,4 Платформа для одной привязи больших молекул ДНК имеет несколько различны преимущества по сравнению с другими методами ДНК иммобилизации. 5 Во- первых, большая молекула ДНК , привязанным на поверхности имеет естественную конформацию случайной катушки без сдвигового потока, который является критически важным для белка ДНК-связывающим признать его сайт связывания. Во-вторых, это очень легко изменить химическую среду вокруг молекулы ДНК для серии ферментативных реакций в проточной камере. В- третьих, микрожидком поток сдвига вызывает молекулы ДНК растяжение до 100% от полной длины контура, который очень трудно достичь с помощью альтернативного удлинения ДНК подходов , таких как поверхности иммобилизации 6 и удержания наноканале. 7 Полностью stretched молекула ДНК также предоставляет позиционную информацию, которая может оказаться полезной для мониторинга ферментативные движения на геномной карте.

Тем не менее, ДНК привязывать подход имеет критический недостаток в том, что интеркалирующего красителя, такие как YOYO-1 обычно вызывает привязные молекулы ДНК, чтобы быть легко нарушена светом возбуждения флуоресценции. Как правило, крупные молекулы ДНК должны быть окрашены с флуоресцентным красителем для визуализации под флуоресцентным микроскопом. Для этой цели, YOYO-1 или другие ТОТО серии красители используются, главным образом, потому что эти красители флуоресцируют только тогда , когда они интеркаляции двухцепочечной ДНК. 8 Тем не менее, хорошо известно , что бис-интеркалирующие краситель вызывает Светоиндуцированное ДНК фото-расщеплению , так как из интеркаляции флуорофоров 9 . Кроме того, флуоресцентно окрашенные молекулы ДНК , привязанные на поверхности являются более хрупкими , так как сдвиговые потоки могут оказывать нарушая силы на свободно движущихся молекул ДНК. Поэтому мы разработали FP-DBP как роман DБелок краситель NA-окрашивание для визуализации больших молекул ДНК на привязи на поверхности. Преимущество использования FP-DBP является то , что он не вызывает фото-расщепление ДНК - молекул , к которым он связывается. 10 Кроме того, FP-ДАД не приводит к увеличению контурной длины ДНК, в то время как бис-интеркалирующие красители увеличивают длину контура примерно на 33%.

Этот метод видео вводит экспериментальный подход для привязывания больших молекул ДНК к ПЭГ-биотин поверхности. На рисунке 1 показаны различные подходы привязывать ДНК с тупыми концами и липкими концами. Таким образом, этот способ окрашивания может быть применен к любому типу молекулы ДНК. 2 изображает схематическое представление сборки проточную камеру , которым можно управлять с помощью шприца насос для генерирования сдвиговых потоков для растягиваться молекулы ДНК, а также для загрузки химических и фермент решения. Рисунок 3 демонстрирует микрофотографии полностью растянутых молекул ДНК привязанных на PEGylatред поверхность 11 и окрашивали FP-DBP.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ДНК Биотинилирование

  1. Биотинилирование тупыми ДНК с использованием терминальная трансфераза (TdT)
    Примечание: Используйте T4 ДНК (166 т.п.н.), которая представляет собой ДНК с тупыми.
    1. Добавьте 5 мкл 2,5 мМ CoCl 2, 5 мкл 10 × реакционного буфера, 0,5 мкл 10 мМ биотин-11-дУТФ, 0,5 мкл концевой трансферазы (10 единиц), и 0,5 мкл Т4 - ДНК (0,5 мкг / мкл) к реакционной смеси. Сделать до конечного объема 50 мкл путем добавления 38,5 мкл воды.
    2. Инкубируют реакционную смесь при температуре 37 ° С в течение 1 часа.
      Примечание: Более продолжительное время реакции может дать двойной привязанные ДНК, то есть, возможно , что биотины помечены на обоих концах.
    3. Остановить реакцию добавлением 5 мкл 0,5 М ЭДТА, рН 8.
    4. Держите трубку при температуре 4 ° С.
  2. Биотинилирование липкого завершенного ДНК с помощью ДНК - лигазы
    Примечание: Используйте Х ДНК (48,5 т.п.н.), который представляет собой липкую конец ДНК. <ол>
  3. Добавить 1 мкл ДНК-лигазы Т4, 5 мкл 10 × буфера для лигирования 1 мкл 25 нг / мкл λ ДНК фага, и добавляют 43 мкл воды, чтобы конечный объем 50 мкл.
  4. Держите трубку при температуре 4 ° С.

2. функционализированных поверхности дериватизации

Примечание:. Чтобы привязанный конец молекулы ДНК на поверхности стекла, основная группа амина силанизированы на покровное с последующим биотин-ПЭГ - покрытием , как показано на рисунке 1 Этот процесс Пегилирование важен для визуализации ДНК одной молекулы , так как ему может значительно уменьшить случайный шум, создаваемый приложением нежелательных молекул на поверхности.

  1. Piranha Очистка
    Примечание: Решения Piranha энергично реагирует с органическими материалами, поэтому с ним следует обращаться с осторожностью, в соответствии с надлежащими правил техники безопасности.
    1. Место покровные на политетрафторэтилена (PTFE) стойку, и держать их бу PTFE Резьбовое уплотнение ленты в продольном направлении, половина на краю поверхностей и половина на стойке. После того, как обертку, оставить длинный кусок (~ 5 см) ленты для обработки стойки во время процедуры очистки.
    2. Заполните стеклянный стакан объемом 1 л 350 мл H 2 SO 4 и 150 мл H 2 O 2 , чтобы сделать пиранья решение в вытяжном шкафу. Поместите стойку в пираньи растворе в течение 2 часов.
    3. Пустой раствор пиранья из стакана, и покровные тщательно промыть деионизированной водой до рН воды в химическом стакане достигает нейтральной. Используйте рН полоски бумаги.
    4. Разрушать ультразвуком стойки покровных стеклах в химический стакан, содержащий воду, в течение 30 мин. Пустые воды из стакана непосредственно перед амино- силанизацией. Используйте 75 Вт озвучивания мощности для очистки и дериватизации стеклянных подложек.
  2. Aminosilanization на поверхности стекла
    1. Добавить 2 мл N - [3- (триметоксисилил) пропил] этилендиамина и 10 мл ледяной уксусной кислоты , 200 млметилового спирта в чистом полипропиленовый контейнер для приготовления раствора aminosilanization.
    2. Поместите очищенные покровные в полипропиленовый контейнер. Встряхнуть их при 100 оборотах в минуту и ​​комнатной температуре в течение 30 мин.
    3. Разрушать ультразвуком химический стакан с дериватизированных промахов покрова в течение 15 мин при 75 Вт Встряхнуть их при 100 оборотах в минуту и ​​комнатной температуре в течение по крайней мере 30 мин.
    4. Очищать раствор из стакана, и тщательно споласкивать покровные, один раз с метиловым спиртом, и в два раза этиловым спиртом. Храните покровные в этиловом спирте и использовать их в течение двух недель.
  3. Пегилирование покровного
    1. Сделать 10 мл 0,1 М раствором бикарбоната натрия (NaHCO 3). Фильтр решение с шприцевой фильтр 0,22 мкм.
    2. Растворите 2 мг карбоната биотин-ПЭГ-сукцинимидил (биотин-ПЭГ-SC) и 80 мг ПЭГ-сукцинимидил валерат (мПЭГ-SVG) в 350 мкл раствора NaHCO 3. Используйте легкую защитную трубку.
    3. Вихре трубки энергично в течение 10 сек, и центрифуга это при 10000 х г в течение 1 мин для удаления пузырьков.
    4. Промыть стекло с ацетоном, затем промывали этиловым спиртом. Разрешить слайд высохнуть на воздухе полностью.
    5. Поместите каплю (50 мкл) раствора PEG на чистую предметное стекло. Накройте капельку мягко с аминокислотой силанизированы покровным, без создания каких-либо пузырьков.
    6. Место слайды в течение 3 ч, чтобы в течение ночи в темноте, хорошо выровнена влажной камере при комнатной температуре. Используйте пустой держатель наконечника пипетки в камере, с водой на дне. Уплотнение остаточного раствора ПЭГ в трубке и держать его при температуре 4 ° С.
    7. Промыть покровное Pegylated тщательно деионизированной водой. Храните его в темном и сухом месте до использования.

3. Сборка проточной камерой

  1. Изготовить пробивки акриловый держатель, как показано на рисунке 2. Убедитесь , что диаметр трубки вставки составляет 0,762 мм, и обозначают одно отверстие впускной и другойвыпускное отверстие (рисунок 2).
  2. Поместите двухсторонние липкой лентой полоски (шириной 5-6 мм) на держателе акриловой (рисунок 2), совместив перпендикулярно к входным и выходным отверстием, не пошевелив каких - либо отверстий каналов. Используйте эти ленты полосы, как стены многоканальные сделать камеры. Скраб ленту, используя наконечник пипетки.
  3. Поместите покровное Pegylated на вершине, чтобы сделать камеры потока, со стороной пегилированного лицом вниз.
  4. Для того, чтобы предотвратить какое-либо решение от утечки, нажмите на верхнюю часть покровное над областью, где двухсторонние ленты размещены. Добавить быстрый сухой эпоксидный клей , чтобы закрыть края камеры в верхней и в нижней части (желтый цвет на рисунке 2).
  5. Подключение короткий кусок (2,5 см) из трубки (внешний диаметр, OD, 0,042 ") к герметичного шприца и герметизировать стык с эпоксидным клеем.
  6. Подключение длинные гибкие трубки (OD: 0,03 ") к трубопроводу, связанного с шприцем и герметизировать стык с эпоксидным клеем.
  7. Заполните TUBIнг связан с шприца с деионизированной водой. Убедитесь, что нет воздушных пузырьков.
  8. Вставьте трубку в отверстие проточной камеры запечатанный с эпоксидным клеем.
  9. Поместите желтый наконечник (200 мкл наконечника) на другое отверстие в резервуаре.

4. Пример Загрузка в поток палаты

Примечание: Neutravidin могут быть заменены другими авидин белками, такими как стрептавидин. Все реакции могут быть выполнены при комнатной температуре, если это не упоминается. Возьмем раствор образца в виде желтого наконечника, и установить наконечник с раствором на отверстие акрилового держателя (рисунок 2b).

  1. Установить расход шприцевой насос со скоростью 50 мкл / мин. Нагрузка 20 мкл авидин белка (25 мкг / мл в растворе Т50, трис 10 мМ, NaCl, 50 мМ, рН 8), и держать его в течение 10 мин.
  2. Нагрузка 20 мкл биотинилированных олигонуклеотидами (100 мкМ в 1 × ТЕ), и держать его в течение 10 мин. Если терминал трансферазы используется, пропустите загрузкуолигодезоксирибонуклеотидов.
  3. Нагрузка 20 мкл раствора ДНК из стадии 1 в проточную камеру при скорости потока 10 мкл / мин, и держать его в течение 30 мин.
  4. Промойте проточную камеру с 1 × TE, и загружают 40 мкл FP-ДАД 10 (~ 80 нм).
  5. Соблюдайте ДНК под флуоресцентным микроскопом с непрерывным потоком окрашивающих молекул в 1 × TE на 60X объектива. Использование 488 нм твердотельный лазер для возбуждения FP (EGFP) -DBP. Для полного участка молекулы ДНК, применяют различные скорости потока в соответствии с длиной ДНК, используемых. Например, применить 50 мкл / мин 48,5 т.п.н. Х ДНК, и 100 мкл / мин в течение 166 т.п.н. Т4 ДНК.
    1. Для повторного использования держателя акриловой, замочить собранные камеры потока в бытовой растворе моющего средства 12. Удалите ленты и эпоксидной смолы с бритвенным лезвием и втирают с руками, чтобы полностью снять их. Прочистить отверстия шприца иглы. Хранить держатели в деионизированной воде до дальнейшего использования.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

На рисунке 1 показаны два различных метода ДНК привязывание в зависимости от концевых структур молекулы ДНК. На рисунке 1а показано , как липкие законченные молекулы ДНК гибридизовали с комплементарными биотинилированных олигонуклеотидов, которые иммобилизованы на покрытые авидином PEG поверхности. На рисунке 1б показано добавление биотинилированный ддНТФ или дНТФ к гидроксильной группе 3'с тупыми ДНК с помощью терминальной трансферазы. ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем платформу для визуализации длинных молекул ДНК биотинилированного для закрепления на поверхностях. Мы сообщали подход к молекулам ДНК , привязанных на авидин белковой поверхности , покрытой с биотинилированного бычьего сывороточного альбумина. 6 В более раннем подходе, мы обнаружили , важнейший вопрос ДНК фото-расщепления , вызванного бис-интеркаляционных красителей , которые Stain молекулы ДНК привязанную на поверхность. Поскольку эти постоянно возбужденные флуорофоры имеют высокую веро...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана исследовательским грантом Университета Соган от 201410036.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1. ДНК Biotinylation
1.1) Биотинилирование тупой ДНК с использованием терминальной трансферазы (TdT)
Terminal TransferaseNew England BiolabsM0315SПредоставлен 10x реакционный буфер, 2,5 мМ хлорида кобальта
Biotin-11-dUTPInvitrogenR0081Biotin-ddNTP также доступен
T4GT7 Phage DNANippon Gene318-03971
Этилендиаминтетрауксусная кислотаSigma-AldrichE6758EDTA
1.2) Биотинилирование липкого конца ДНК с использованием ДНК-лигазы
T4 ДНК-лигазыNew England BiolabsM0202SПредоставлен 10-кратный реакционный буфер
Лямбда-фаг ДНКBioneerD-2510Также доступно в New England Biolabs
<сильный>2. Функционализированная дериватизация поверхности
2.1) Чистка
CoverslipPiranha Marienfeld-Superior010105022 мм x 22 мм, No 1 Толщина
тефлоновой стойкиCustom Fabrication
PTFE Thread Seal TapeHan Yang Chemical Co. Ltd.3032292Тефлоновая&торговая лента
Серная кислотаJin Chemical Co. Ltd.S280823H2SO4,
перекись водородаJin Chemical Co. Ltd.H290423H2O2, 35% в воде
DaihanScientific Co. Ltd.WUC-A02HНастольный ультразвуковой очиститель
2.2) Аминосиланизация на поверхности стекла
>N-[3-(Trimethoxysilyl)propyl]
этилендиамин		Sigma-Aldrich104884
ледяная уксусная кислотаDuksan Chemicals41499% чистота
метилового спиртаJin Chemical Co. Ltd.M30031899,9% чистоты
QorpakPLC-04907
Этиловый спиртJin Chemical Co. Ltd.A30020299,9% Чистота
2.3) PEGилирование покровного стекла
Бикарбонат натрияSigma-AldrichS5761
Шприц-фильтрSartorius16534----------K
Biotin-PEG-SCLaysan BioBiotin-PEG-SC-5000
mPEG-SVGLaysan BioMPEG-SVA-5000
АцетонДжин Кемикал Ко. Лтд.A300129Предметные
стекла для микроскопаMarienfeld-Superior1000612~76 мм x 26 мм x 1  mm
3. Сборка проточной камеры
акриловая опораИзготовление на заказ
Двусторонняя лента3Мпрозрачного типа
Быстросохнущая эпоксидная смола3М
Полиэтиленовая трубкаCole-Parmer06417-11, 06417-21
Газонепроницаемая 250 &микро; l ШприцHamilton81165
Шприцевой насосNew Era Pump Systems Inc.NE-1000
4. Загрузка образца в проточную камеру
НейтравидинThermo Scientific31000
Трис базаSigma-AldrichT1503-5KGТризма База
Микроскоп OlympusIX70
EMCCD КамераQ ImagingRolera EM-C2
Твердотельный лазер (488  nm)OxxiusLBX488
AlconoxAlconox Inc.
95% чистоты Контейнер из полипропилена 99% чистоты

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. Direct Mechanical Measurements of the Elasticity of Single DNA-Molecules by Using Magnetic Beads. Science. 258 (5085), 1122-1126 (1992).
  2. Finkelstein, I. J., Visnapuu, M. -L., Greene, E. C. Single-molecule imaging reveals mechanisms of protein disruption by a DNA translocase. Nature. 468 (7326), 983-987 (2010).
  3. Doyle, P. S., Ladoux, B., Viovy, J. L. Dynamics of a tethered polymer in shear flow. Phys. Rev. Lett. 84 (20), 4769-4772 (2000).
  4. Perkins, T. T., Quake, S. R., Smith, D. E., Chu, S. Relaxation of a Single DNA Molecule Observed by Optical Microscopy. Science. 264 (5160), 822-826 (1994).
  5. Cai, W., et al. Ordered restriction endonuclease maps of yeast artificial chromosomes created by optical mapping on surfaces. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (11), 5164-5168 (1995).
  6. Kim, Y., Jo, K. Neutravidin coated surfaces for single DNA molecule analysis. Chem. Comm. 47 (22), 6248-6250 (2011).
  7. Kim, Y., et al. Nanochannel confinement: DNA stretch approaching full contour length. Lab on a Chip. 11 (10), 1721-1729 (2011).
  8. Glazer, A. N., Rye, H. S. Stable dye-DNA intercalation complexes as reagents for high-sensitivity fluorescence detection. Nature. 359 (6398), 859-861 (1992).
  9. Graneli, A., Yeykal, C. C., Prasad, T. K., Greene, E. C. Organized arrays of individual DNA molecules tethered to supported lipid bilayers. Langmuir. 22 (1), 292-299 (2006).
  10. Lee, S., et al. DNA binding fluorescent proteins for the direct visualization of large DNA molecules. Nucleic Acids Res. , (2015).
  11. Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nat Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
  12. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. J. Vis. Exp. (86), e50549(2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

DNA VisualizationSurface tethered DNA MoleculesBiotinylated DNAAvidin Protein LinkersPolyethylene Glycol CoatingMicrofluidic Shear FlowFluorescent MicroscopyDNA StretchingFlow Chamber Assembly

Похожие статьи