Электрофизиологические Способ записи ответов внутриклеточный амперных Drosophila Фоторецепторов и Интернейроны к световой раздражитель В Vivo

Краткое содержание

Острые микроэлектроды позволяют точно определить электрофизиологические характеристики фоторецепторов и зрительных интернейронов у живых дрозофил. Здесь мы покажем, как использовать этот метод для регистрации высококачественных реакций напряжения отдельных клеток на контролируемую световую стимуляцию. Этот метод идеально подходит для изучения нейронной обработки информации в сложных глазах насекомых.

Аннотация

Реакция на напряжение фоторецепторов насекомых и зрительных интернейронов может быть точно зарегистрирована с помощью обычных острых микроэлектродов. Описанный здесь метод позволяет исследователю измерить длительные (от нескольких минут до нескольких часов) высококачественные внутриклеточные ответы одиночных фоторецепторов R1-R6 дрозофилы и больших монополярных клеток (БМК) на световые стимулы. Поскольку система записи имеет низкий уровень шума, ее можно использовать для изучения изменчивости отдельных клеток в глазу мухи и того, как их выходные данные отражают физические свойства визуальной среды. Мы опишем все ключевые шаги по выполнению этой техники. Описаны основные этапы создания подходящей электрофизиологической установки для регистрации, такие как проектирование и выбор экспериментального оборудования. Мы также объясним, как подготовиться к записи с помощью соответствующих (четких) записывающих и (тупых) электродов сравнения. Подробно рассказывается о том, как закрепить неповрежденную муху в сделанном на заказ держателе для мух, подготовить небольшое окошко в ее глазу и вставить через это отверстие записывающий электрод с минимальными повреждениями. Мы объясняем, как локализовать центр рецептивного поля клетки, адаптировать исследуемую клетку к темноте или свету, а также записать ее реакцию напряжения на динамические световые стимулы. Наконец, мы описываем критерии стабильных нормальных записей, показываем характерные высококачественные реакции напряжения отдельных клеток на различные световые стимулы и кратко определяем, как количественно оценить их сигнальные характеристики. Многие аспекты метода технически сложны и требуют практики и терпения для освоения. Но после того, как он изучен и оптимизирован для экспериментальных целей исследователя, он предоставляет выдающиеся нейрофизиологические данные in vivo.

Введение

Плодовой мушки (дрозофилы) соединение глаз является прекрасной модельной системой для изучения функциональной организации фоторецепторов и интернейронных массивов для нейронной выборки и обработки изображений, а также для животных видения. Система имеет наиболее полную электросхему ^1,2 и любезен с генетическими манипуляциями и точного мониторинга нейронной активности (высокого отношения сигнала к шуму и временным разрешением) ^3-10.

Глаз дрозофилы имеет модульную конструкцию, содержащий ~ 750 , казалось бы , обычные линзы шапками структуры , называемые омматидии, которые в совокупности обеспечивают весь панорамный поле зрения , которая охватывает практически все направления вокруг его головы. Первичная информация Оком выборки единиц являются его rhabdomeric фоторецепторы ^7,8,11. Каждый омматидий содержит восемь фоторецепторов (R1-R8), которые совместно используют один и тот же объектив, но фасетки выравниваются по семи различным направлениям. В то время как внешние фоторецепторов R1-R6 аре наиболее чувствительны к сине-зеленый свет, спектральные чувствительности внутренних клеток R7 и R8, которые лежат друг на друга и указывают на ту же сторону, демонстрируют три отличительные подтипы: бледный, желтый и спинные площадь обода (ДРА) ^{12- 15.}

Рисунок 1. Функциональная организация Drosophila Eye. (A) Два первых оптических ганглиев, сетчатка и пластинкой, выделены серым цветом внутри летучей глаз. Сетчатка R1-R6 фоторецепторы и ламинированным Большие Монополярные клетки (LMCS: L1-L3) легко доступны в естественных условиях с обычными острыми записи микроэлектродов. Схематическое электрод выдвигает на первый план нормальный путь для записи из R1-R6 в сетчатке. Один путь для записи с LMCS в листовых пластинок является смещение параллельно электрода налево. (В) Lamina представляет собой матрицу retinotopically органанализованных картриджи, каждый из которых упакован с нейронами, которая обрабатывает информацию от конкретной небольшой области в визуальном пространстве. Из-за нервного суперпозиции, шесть фоторецепторы из разных соседних омматидиев послать свои аксоны (R1-R6) к тому же пластинкой картриджа, образуя гистаминэргических выходные синапсы в L1-L3 и амакринных клетки (Am). (C) Распространение нейронной информации между R1-R6 аксонов и визуальных интернейронов (включая L4, L5, Lawf, C2, C3 и T1), внутри тонким слоем картриджа является сложным. (D) R1-R6 фоторецепторов аксоны получают синаптические обратные связи от L2 и L4 монополярных клеток. (В) и (С) редактировался Ривера-Альба и др ^2. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Глаз дрозофилы нервного типа суперпозиции ^16. Это означает, что тшляпа нервные сигналы восьми фоторецепторов, принадлежащих к семи соседних омматидиев, которые выглядят в той же точке в пространстве, объединены вместе в одной нейронной картриджа в течение следующих двух neuropils: листовой пластинки и костный мозг. В то время как шесть внешних фоторецепторы R1-R6 проекта их аксонов к нейронным колонн в листовых пластинок (рис 1), R7 и R8 клетки обходят этот слой и сделать синаптические контакты с их соответствующими продолговатый столбец ^17-19. Эти точные электропроводок производят нейронную субстрат для retinotopic отображения мух раннего видения, после чего каждую пластинку (рис 1A-C) и мозговое колонку (картридж) представляет собой единую точку в пространстве.

Прямые входы из R1-R6 фоторецепторов получены крупными монополярной клеток (LMCS: L1, L2 и L3) и амакриновые клетки (Am) в пластинкой ^1,2,20. Из них, L1 и L2 являются крупнейшие клетки, опосредующие основные информационные пути (рис 1D), бееч реагируют на внебалансовой и перемещения краев, и , таким образом , образуют вычислительную основу детектора движения ^21,22. Поведенческие эксперименты показывают , что при промежуточном противоположность этому , эти два пути облегчения восприятия движения в противоположных направлениях: спина к передней в L1 и спереди-назад в клетках L2 ^23,24. Связь также подразумевает , что нейроны могут L4 играть решающую роль в боковой связи между соседними патронами ^25,26. Взаимные синапсы были обнаружены между клетками L2 и L4, расположенных в том же самом и двух соседних картриджей. Вниз по течению, каждая ячейка L2 и три ассоциированные клетки L4 проецировать свои аксоны к общей цели, нейрон Tm2 в мозговом веществе, где входы от соседних патронов , как полагают, быть интегрированы для обработки движения фронта к спине ^27. Хотя L1 нейроны получают входной сигнал от же картриджем L2S как через щелевые контакты и синапсов, они не связаны непосредственно с L4S и, следовательно, соседних листовых пластинок картриджей.

1,2 (рис 1D). В то время как соединения тот же Кассетноые выборочно из L2 в R1 и R2, и от L4 до R5, все фоторецепторов R1-R6 получают синаптические обратную связь от L4 любого или обоих соседних патронов. Кроме того, существуют сильные синаптические соединения от Am к R1, R2, R4 и R5, а также глиальные клетки , также синаптически подключены к сети , и таким образом , может принимать участие в нейронной обработки изображений ^6. Наконец, аксонов гэп-перекрестки, связывающие соседние R1-R6 и между R6 и R7 / R8 фоторецепторов в пластинкой, способствуют асимметричного представления информации и обработки в каждом картридже ^14,20,28.

Внутриклеточные записи напряжения от отдельных фоторецепторов и визуальных интернейронов в почти неповрежденном дрозофилы обеспечивают высокое отношение сигнал-шум гДанные ATIO при разрешении ^3,5,7-10,29 суб-миллисекунды, которая необходима для создания ощущения быстрых нейронных вычислений между связанных нейронов. Такой уровень точности невозможно по текущим оптических методов визуализации, которые значительно шумнее и, как правило, работают на 10 - 100 мс разрешением. Кроме того, поскольку электроды имеют очень маленькие и острые кончики, метод не ограничивается тела клеток, но может обеспечить прямые записи с небольших активных нервных структур; такие как дендритные деревьев LMCS 'или фоторецепторов аксонов, которые не могут быть доступны гораздо больших наконечников патч-зажим электродов. Важно отметить, что метод также структурно менее инвазивными и разрушительными, чем большинство приложений патч-зажим, и таким образом влияет меньше внутриклеточной среды и информационной выборки Исследуемый клеток. Таким образом, традиционные острые методы микроэлектродные способствовали и продолжают способствовать, фундаментальные открытия и оригинальные понимание нейронной инфоробработка формация в соответствующем масштабе времени; улучшение нашего понимания механистического видения ^3-10.

В данной статье описывается , как в естественных условиях внутриклеточных записей от дрозофилы R1-R6 фоторецепторов и LMCS выполняются в лаборатории Juusola. Этот протокол описывает, как построить подходящий электрофизиологии буровой установки, подготовить муху, а также выполнять записи. Некоторые представительные данные представлены и некоторые общие проблемы и возможные решения обсуждаются, которые могут возникнуть при использовании этого метода.

Протокол

Следующий протокол соответствует всем рекомендациям по уходу за животными Университета Шеффилда и Пекинского педагогического университета.

1. Реагенты и оборудование Подготовка

1. Запись и настройка светостимуляции оборудование
   1. Выберите по крайней мере область записи 2,5 х 2,5 м для проведения электрофизиологических экспериментов в комнате с кондиционером с регулируемой влажностью и средства для обеспечения темных условий съемки. Убедитесь в том, что эта область является достаточно большим, чтобы удобно соответствовать: (I) 1 х 1 м таблицу вибрационной изоляции, где находится буровая установка [муха стимуляции и устройство записи], стереомикроскопа и источник холодного света с двумя гусиными шеями, все приложенные в пределах большой> 180 см высотой клетки Фарадея; (Б) а 38U оборудование стойки для размещения персонального компьютера с плоским ЖК-монитор, усилитель микроэлектродов, светодиодные драйверы, фильтры, блоки управления температурой, осциллографов и других необходимых электрических приборов; и (III) анебольшой письменный стол и стул для исследователя.
   2. Поместите вышке вдали от электрических и механических источников шума, таких как холодильники, центрифуг и лифтов. Используйте отдельные устройства защиты от перенапряжений для защиты электрических устройств буровой установки от скачков напряжения, возникающих в питающей сети. В идеале подключить буровой установки к собственному источнику бесперебойного питания (ИБП) батареи для минимизации шума.
   3. Построить коническую флай-держатель из латуни и черного пластика (рисунок 2). Дрель небольшое отверстие заострения через блок из латуни с его внешним ободом сужением до ~ диаметром 0,8 мм (соответствие ширины грудной клетки типичного мухи).
      Примечание: Это отверстие должно сужаться в направлении кончика муху держателя так , что больше , чем в среднем у дрозофилы, который проецируется снизу воздушным потоком, застревали плечом глубоко в верхнем ободе.
   4. Проектирование и строительство механически прочной, но точный, муха стимуляции и устройство записи (рисунок 3). Построить из Oе алюминий или латунь (высокая проводимость металлов) муха подготовка площадки полюса и вокруг него система Кардан рычага с внедренными шарикоподшипников, чтобы обеспечить плавное и точное х, у-позиционирования и фиксации светового стимула.
      Примечание: Эта интегрированная композитная конструкция сводит к минимуму механические вибрации, которые в противном случае могут сместить кончик электрода записи из исследуемой клетки. Он может дополнительно включать в себя на основе Пельтье-элемента системы контроля температуры замкнутого контура, что позволяет исследователям использовать чувствительные к температуре генетические конструкции, такие как shibire ^TS, для оценки синаптических расчетов схемы ^9,30. Anodize аппарат или краски его черным, чтобы минимизировать разброс светового стимула.
      1. Закрепить стимуляцию летать и устройство записи на макете таблицы безвибрационными в; например, M6-болтами, используя свои метрические резьбовые отверстия. Используйте черный макет или покрыть ее черной тканью, чтобы свести к минимуму рассеяния света в ходе экспериментов.
      2. Положения ип и блокировка (с помощью стопорного винта) регулируемое по вертикали подготовки муха платформы полюс в центре системы карданного руки. Поместите маховое препарат (в пределах муху держателя, см шаг 2) на платформе полюса так, чтобы источник света прикреплен к карданным руки в радиальном направлении указывает на голову мухи. Убедитесь в том, что центр летучей глаз точно в точке пересечения (0, 0) х- карданного-Arm и у-осей, так как это позволяет точно х, у-позиционирование светового стимула к любой точке в пределах мухи поле зрения.
         Примечание: Эта функция необходима для отображения свойств отклика отдельных клеток в определенных местах для глаз, например, при поиске электрофизиологических доказательств для структурных приспособлений, таких как яркие или острых зон, которые показали бы более глубоком осознании или разрешение, соответственно ^31.
   5. Установить стереомикроскопа позади стимуляции лету и устройство записи на столе антивибрационной такчто она обеспечивает удобный просмотр с высоким увеличением мух глаза.
   6. Установите холодный источник света на верхней части микроскопа с полужесткие моноблочная световоды со сдвоенной головкой источника света, указывая вниз по направлению к держателю препарата муха. Свободно перемещающийся два луча подсветки облегчает визуализировать записи Верх электрода при движении его через небольшое отверстие в лету глаз.
   7. Прикрепите соответствующий х, у, г-Микроманипулятор набор (грубой и тонкой) для записи электрода и головной ступени на столе антивибрационные, на правой стороне муха стимуляции и записи устройства, с помощью M6-болтов или магнитной стоит.
      Примечание: В лаборатории Juusola различные буровые установки оснащены различными манипуляторами; Для получения дополнительной информации смотри таблицу материалов и реагентов. Все они обеспечивают высокое качество внутриклеточные записи.
   8. Смонтировать небольшой ручной 3-осевой микроманипулятора для держателя электрода сравнения на вертикально регулируемой FLY подготовка площадки полюс. Сориентируйте эталонный электрод так, чтобы он направлен в сторону подготовки мух.
   9. Построить свободно стоящую светозащищенные клетку Фарадея из стальных панелей вокруг стола антивибрационные, окружающая муха стимуляции и устройство записи, чтобы предотвратить внешнее электромагнитных помех. Оставьте переднюю часть клетки открытым, обеспечивая доступ к транспорту подготовки лету для экспериментов. Приложить черные шторы из ткани (имеющие медь- или алюминиевой сетки, имплантированных в них для заземления) на передней панели, чтобы оградить от шума и света. Краска интерьер клетки черного цвета, чтобы свести к минимуму рассеяния света и болт ноги клетки на полу, чтобы предотвратить вибрации.
   10. Подключение напряжения и тока выходы высокого импеданса усилителя внутриклеточная микроэлектродов на входы двух отдельных фильтров нижних частот (Бесселя или аналогичный) с помощью BNC-кабелей. Точно так же, соедините выходы фильтра в соответствующие каналы AD-разъем БлоCKS / платы системы сбора данных (DA / AD карт). Подключите / AD карту (ы) DA в персональный компьютер с помощью специализированных кабелей, в соответствии с руководствами поставщика.
   11. Установите соответствующее программное обеспечение сбора данных для системы сбора данных выбора на персональном компьютере. Убедитесь в том, что драйверы сбора данных совместимы с операционной системой на персональном компьютере.
   12. Цокольный электрически стимуляция муха и устройство записи, клетка Фарадея, медная сетка (в пределах шторы), микроскоп, микроманипуляторы, холодный источник света, 38U оборудование стойки со всеми своими инструментами (внутриклеточный усилитель, фильтры, блок контроля температуры, ПК и ЖК-монитор и т.д.) к одной центральной точке заземления, используя провод заземления оборудования и M6 обжимного кольца заземления концы. Используйте электрический мультиметр для проверки, что все части находятся в одном месте.
       Примечание: Для достижения наилучших условий съемки с низким уровнем шума, конфигурации заземления обычно изменяются сюдам один комплект-до другой.
       1. При необходимости, подключить центральную точку заземления дополнительно к строительной площадке, и / или центральная площадка микроэлектрода усилителя. После тестирования полностью функционирующей системы во время реальных электрофизиологических экспериментов, должны быть готовы изменить конфигурацию заземления в случае необходимости, чтобы минимизировать шум в записях.
   13. Настройка программного обеспечения усиления (1 - 10X), фильтрацию сигналов (обычно ФНЧ при 500 Гц, которая подходит как для данных R1-R6 и LMC), а также частоты дискретизации (по крайней мере, 1 кГц). Убедитесь , что параметры подчиняются Теорема Котельникова ^32; например, при получении данных, которые нижних частот фильтруют при 500 Гц, используют частоту дискретизации 1 кГц или выше, чтобы свести к минимуму эффект наложения спектров.
       1. Поскольку характерные реакции напряжения R1-R6 фоторецепторов являются 40 - 65 мВ, а те из LMCS 20 - 45 мВ, установите усиление и отображение шкалы соответственно для включения высокого разрешения sampliнг и данные визуализации.

Рисунок 2. Коническая Fly-держатель Муха-держатель выполнен из двух частей:. Центральный блок из латуни и его конической формы из черного пластика пальто. Центральное отверстие внутри блока латунной суживается до небольшого диаметра , который едва позволяет летать через. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3. Обзор электрофизиологических Рог. Настроечный содержит свободно стоящую светозащищенные клетку Фарадея, таблицу антивибрационный, муха стимуляции и устройство записи и черной ткани шторы с медь- или алюминиевой сетки внутри для заземления. Входыtrument стойка электрически соединена с той же центральной земли со всем оборудованием внутри клетки Фарадея. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

2. Перерабатывающие микроэлектродов
   1. Потяните опорный микроэлектрода от филаментированных боросиликатного (наружный диаметр: 1,0 мм; внутренний диаметр 0,6 мм) или из кварцевого стекла (наружный диаметр: 1,0 мм; внутренний диаметр 0,5, 0,6 или 0,7 мм) трубки с помощью пипетки съемник инструмента. Постарайтесь добиться короткий постепенное сужение.
      Примечание: Точные настройки программы пипетка съемника варьируются от прибора к прибору; Более подробную информацию в таблице материалов и регентов. Размер пор в наконечнике не имеет решающего значения, так как кончик электрода будет сломана перед вставкой в ​​подготовке мух.
   2. Потянуть микроэлектрода записи от филаментированных боросиликатного (наружный диаметр: 1,0 мм; внутренний диаметр 0,6 мм) или из кварцевого стекла (наружный диаметр: 1,0 мм; внутренний диаметр 0,5, 0,6 или 0,7 мм) трубки с помощью пипетки съемник инструмента. Постарайтесь достичь длинный (10 - 15 мм) штраф постепенное сужение.
   3. Проверьте с помощью светового микроскопа, что регистрирующие электроды показывают правильную сужающийся. Установите электрод на предметное стекло с формовочной клеем и использовать цели 40X воздуха, чтобы осмотреть его наконечник.
      Примечание: Хороший электрод не сужается гладко, пока его незримо небольшой наконечник, вокруг которого непрерывная параллельно темнее, а светлые интерференционные картины можно увидеть. Некоторые параметры съемник генерируют высокие электроды сопротивления, которые не могут привести к успешных прорывов клеток, потому что их советы напоминают "трубы". Таким образом, визуальный осмотр электродов имеет важное значение.
   4. Прикрепите электроды в горизонтальном положении на большой чашки Петри с пластилином (или аналогичного формовочной клея) для безопасного хранения и транспортировки к электрофизиологии буровой установки. Убедитесь в том, что электрод Подсказкиповторно всегда в воздухе, и не случайно касаясь ничего.
   5. Back-заполнить записи и опорные электроды непосредственно перед экспериментом с соответствующим раствором соли. С помощью небольшой 5 мл шприц, соединенный с небольшим фильтром частиц с тонким пластиковым наконечником (например, microloader).
      1. Для фоторецепторов экспериментов, заполнения электрода записи до полного (капелька формы в ее большом конце) с 3 М KCl, как это решение сводит к минимуму влияние жидкости перехода потенциала к записанному напряжения.
      2. Для исследования гистаминэргических LMCS, которые реагируют на синаптические вход от R1-R6 фоторецепторов хлоридом-Проводимость изменений, заполняют регистрирующие электроды с 3 М ацетата калия и 0,5 мМ KCl, поскольку это решение оказывает меньшее влияние на батарее хлорида клетки. Заполните электрод сравнения с зольной Ringer, содержащий в мМ: 120 NaCl, 5 KCl, 10 TES (C ₆ H ₁₅ NO ₆ S), 1,5 CaCl _2, 4 MgCl _2, и 30 сахарозы
   6. Проверьте сопротивление вновь запряженных электрода записи в системе записи.
      1. Убедитесь в том, что серебряные провода внутри электрода держателей равномерно покрывают хлоридом серебра (появление пурпурно-серый - не блестящая серебристая), чтобы свести к минимуму записи артефактов (например, дрейф в потенциале перехода). Если нет, то замените их правильно chloridized проводов.
      2. При необходимости, chloridize новые серебряные провода. Тщательно очистите провода (за счет быстрого прохождения их через пламя), так что они появляются ярко-серебристого цвета. Избегайте касаний пальцами, для того, чтобы внести на ровный слой AgCl. Замочите провода в полную силу отбеливателя в течение 15 - 30 мин, пока они не появляются фиолетовый-серый цвет. В качестве альтернативы, гальванизирует каждый провод (сделав его положительным по отношению к раствору , содержащему 3 М КСl и пропускание тока через нее со скоростью 1 мА / см ² площади поверхности) в течение 10 - 15 секунд до тех пор , пока адекватно покрыта. Подключите обратно заполненные записи и опорные электроды к их электродных держателей. Поместите ванну раствора маленького Рингера на вертикально регулируемой подготовки муха платформы полюса. Привод кончиков электродов в раствор Рингера и измерьте сопротивление наконечника записывающего электрода.
         Примечание: Этот шаг необходим только при тестировании резистивных свойств электродов, которые вытягивают из новой партии стеклянной трубки, или при оптимизации программ прибора микроэлектродный съемника через итерации.
      3. Перед выполнением измерений сопротивления, прочтите инструкции в руководстве при изготовлении усилителя для соответствующих настроек измерений. Для хорошей записи электрода, имеют сопротивление кончика ~ 100 - 220 МОм.

2. Подготовка дрозофилы

1. Соберите 5 - 10 дней мух (после вылупления) и поместить их в чистую пробирку, содержащую летучей улandard пищи. Можно добиться хороших записей с младших мух тоже, даже из "новорожденных"; но из-за их более мягких глаз, отрезания роговичный отверстие для записи электрода является более трудным.
2. Построить муху ловить трубку и подготовка летучей стенд (рисунок 4). Смотрите рисунок 4 для общей идеи о том , как эти самодельные инструменты были объединены.
   1. Для того, чтобы муху ловить трубку, отрезать кончик коническим днищем 50 мл пластиковые центрифужные трубки. Затем вставьте и приклейте большой конец 1 мл кончика пипетки на этом новом открытии.
   2. И, наконец, вырезать маленький конец пипетки до размера, который легко позволяет летать с помощью ходьбы. Обратитесь к механической мастерской, чтобы собрать небольшую летучую подготовительный этап, который позволяет вращение и блокировка зольной держателя на разных позициях 2-осей.

Figurе 4. Инструменты и придумывает необходимо для создания Fly подготовки. Fly ловли трубка сделана наклеиванием 1 мл пластиковой пипетки 50 мл пластиковые центрифужные пробирки. Bespoke подготовка муха стенд позволяет свободное вращение-и блокировка мух держателя в предпочтительном положении для приготовления летать. Муха фиксируется пчелиным воском, используя электрический восковую нагреватель. Вазелин наносится небольшой аппликатор осуществляется посредством соединения толстый сортировки волосы на ручке. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

3. Собирают муху для эксперимента в кончике пипетки 1 мл, который едва позволяет летать, чтобы соответствовать через. Приложить муху ловить трубку с наконечником пипетки на нем, к лету трубки. В ловле мух, воспользоваться присущей им тенденцией подниматься вверх (antigravitaxis) в наконечник пипетки. Предпочтительно, чтобы выбрать самую большую женщину, как размер материиs в электрофизиологии.
   Примечание: Чем больше муха, тем больше его клетки и тем больше шансов на высокое качество внутриклеточных записей. Более мелкие мухи (как самки и самцы) могут также обеспечить отличные записи, но подготовка труднее сделать. После того, как муха в ловушке большой пипетки, не забудьте закрыть всплывающую трубку, чтобы остановить других мух от побега.
4. Подключение 100 мл шприца с гибким пластиковым шлангом к большему отверстие наконечника пипетки - с лету до сих пор в нем.
5. Поместите узкий конец на большой кончик пипетки, которая расширенного просто позволить дрозофилы через, к отверстию в нижней части зольной держателя и выдавить небольшое количество воздуха из шприца , чтобы извлечь муха в лету держателя ,
   1. Посмотрите через стереомикроскопа и осторожно вводить больше воздуха, пока голова мухи не выступает из конического конца летучей держателя. Убедитесь в том, что муха прочно в ловушке из его грудной клетки к маленькому ОПЕнин на верхней части зольной держателя.
6. Используйте нагреватель воска, чтобы закрепить муху с пчелиным воском от своих «плечи» к лету держателя. Отрегулируйте температуру воска нагревателя, чтобы быть как можно более низким еще чисто плавления воска.
   Примечание: Если температура правильная, воск кажется прозрачным. Слишком высокая температура делает воск "сгорать"; слишком низко держит воск жесткой. При креплении муху, быть точным и кратким при длительном воздействии тепла может привести к его повреждению. Использование светоотверждаемый зубной клей не рекомендуется здесь, как его применение является слишком медленным.

Рисунок 5. Подготовка Fly для экспериментов в естественных условиях. Слева, Голова Drosophila 'ю.ш. расположена прямо в муху держателя и фиксируется от его хобота, правого глаза и плечи к лету держателя с подогревом ВЕeswax. Правильно, Небольшое отверстие вырезается в самой толстой части глаза, чуть выше экватора , и лишь немногие омматидиев от задней кутикулу, используя острый край бритвы. Кусок роговицы осторожно удаляют , а отверстие закупоривается вазелином , чтобы предотвратить глаз от высыхания. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

7. Зафиксировать голову мухи. Применение пчелиного воска к хоботка (рисунок 5) и угла правого глаза, избегая роговицу, и зафиксировать голову от этих точек на лету держателя.
8. Произведите микро-нож. Зажмите без нержавеющей стали бритву с двумя лезвиями держателями / выключатели (как с плоской рукояткой) и трещины небольшую полоску ее острым краем. Для здоровья и безопасности, используйте защитные очки для защиты глаз (хотя это весьма маловероятно, что куски бы рикошетом, когда бритва треснул). Идеально,производят острый край бритвы, который напоминает шпилем. Убедитесь в том, что это "Шпиль" прочно прикреплен к лопасти держателя, но будьте осторожны, чтобы избежать каких-либо самоповреждения!
9. Использование микро-нож, подготовить небольшой размер отверстий несколько омматидиев в левом глазу мухи - около 4 - 5 омматидиев из спинной кутикулы чуть выше экватора глаза, чтобы обеспечить проход для микроэлектродом записи. Выполните под стереомикроскопа, рассматривая препарат с большим увеличением.
   Примечание: Так как муха глаз чувствует себя упругой и стойкая к зондировании, отверстие лучше всего вырезать с "шпилем" гамма-ножа. Техника резки довольно сложно, поэтому обратите пристальное внимание на демонстрации видео. Сохраняя муха держателя в определенных направлениях (при подготовке стенда летать) может сделать рассечение проще. Первоначально микрохирургии может чувствовать себя трудно учиться, но когда-то совершили, нейронная адаптация постепенно улучшается исследователя 3D-восприятие и ловкость.
10. ралить тщательно маленький кусочек роговицы из отверстия, которое было просто вырезать, обнажая сетчатку снизу. Стремительно закрыть отверстие в глаза с крошечной каплей вазелина, используя тонкие волосы из вазелина аппликатором.
    Примечание: Вазелин обслуживает несколько ролей здесь. Это предотвращает обезвоживание тканей и коагуляции гемолимфы, что нарушило бы вставленной записи электрода. Она также кстати пальто микроэлектродом, уменьшая его очный емкость. Это может улучшить частотные характеристики системы записи, и поэтому временное разрешение записанных нейросигналы. Избегать размазывания вазелин над остальной части глаза, как это размывает оптики.

3. Запись с R1-R6 фоторецепторов или LMCS

1. Всегда быть заземлены при работе усилителя микроэлектродного (например, прикоснувшись к металлической поверхности клетки Фарадея или таблицы антивибрационные), так как это исключает один из случайно поставитьING статический заряд на головной стадии, которая может привести к повреждению схемы.
2. Осветите подготовки муха платформы полюс сверху двух гузнек световодов (фиг.6а) (с источником холодного света внутри клетки Фарадея) , так что муха-держатель может быть размещен на полюсе в предпочтительном положении под пристальным визуальным контролем ,

Рисунок 6. Позиционирование Муха-держатель и электроды для экспериментов (AB) Муха-держатель размещают на платформе записи , которая также обеспечивает регулирование температуры с помощью элемента Пельтье (A: белый круглый платформы в центре).. Карданного рука дает точное позиционирование светового раздражителя на равном расстоянии (через х, у-вращения) вокруг лету, с источником света (жидкость или кварцевый волоконно-оптический пучок конца) непосредственно указывая на его глаза. Во многих из НУг буровые установки, световая стимуляция генерируется с помощью светодиодов (с линейными тока водителей) или с помощью монохроматора. Таким образом, их стимулы носят специфический (полосам) прошел спектральный состав, выбранный между 300 - 740 нм и крышка 4 - 6 журнала диапазон Единица измерения интенсивности (как ослабляется отдельных фильтров нейтральной плотности). (C) Два микроэлектродов, управляются отдельными микроманипуляторами, расположены в головке зольной: электрод сравнения (выше) через глазков; электрод записи (слева) через небольшое отверстие в левом глазу. (D) для получения максимального количества фоторецепторов записей, микроэлектрода запись забивают в отверстие, параллельных оси хобот-глазка. Когда кончик электрода проникает и герметизирует фотоэлектрического элемента, свободно вращающийся источник света закреплен на положение, в котором клетка производит максимальный отклик напряжения на заданный световой раздражитель. Эта точка в пространстве лежит в центре рецептивного поля клетки. Если отверстие Iы близко к кутикуле, LMC проходки может дополнительно быть достигнуто с таким же углом электрода (слева). Если отверстие дальше от кутикулы, еще один полезный угол электрода подход для получения записей LMC также показан (справа). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

3. Установить маховое держатель (с мухой в нем!) На лету подготовка платформы полюса. Поверните маховое держатель так , чтобы левый глаз мухи непосредственно перед следователем (Рисунок 6B).
4. Вставьте тупой электрод сравнения мягко через occelli мухи в головной капсулы с использованием небольшого грубого микроманипулятор при наблюдении препарата через стереомикроскопа (6С). Не толкайте электрод слишком глубоко, так как это может привести к повреждению мозга мухи.
   1. В качестве альтернативы, вставьте электрод в задней части грудной клетки, Всегда убедитесь, что муха появляется вересковый (перемещает его усики) и его глаза нетронутыми; Не случайно повреждены. Если препарат выглядит менее безукоризненно, подготовить новую муху для экспериментов.
5. Драйв резкое микроэлектрода записи в левый глаз через вазелином покрытые небольшое отверстие, подготовленный ранее. Используйте большое увеличение в стереомикроскопа и переместить световоды и фокальной плоскости так, что расположение рабочего конца электрода становится очевидным в 3D его картин отражательной способности.
   Примечание: На рисунке показано , как 6D голова мухи должны быть слегка расположены по- разному (в отношении к углу микроэлектрода записи попадает в глаз) для фоторецепторов и записей LMC. Вождение электрод в глаза, не нарушая его самый трудный этап эксперимента. Если кончик электрода попадает в небольшое отверстие в глазу, попав на роговицу, он обычно ломается.
6. Включите усилитель микроэлектродовкак только оба электрода плотно внутри препарата, в электрическом контакте с жидкостями тела мухи.
7. Выключите холодного света источник (внутри клетки Фарадея) и отключите его от сети. Подключите его штекер к центральному землю, чтобы свести к минимуму наземного контура индуцированный электрический шум, и переместить световоды гузнек прочь так, что система карданного рука может свободно перемещаться по всему лету. Выключить освещение в комнате, чтобы гарантировать, что препарат муха сейчас находится в относительной темноте.
8. Измерьте сопротивление электрода записи в глаза (как указано в руководстве пользователя усилителя). Используйте только регистрирующих электродов, в которых сопротивление составляет 100 - 250 МОм.
   Примечание: Это практически невозможно добиться высокого качества внутриклеточные записи на <70 МОм электрода. Если сопротивление <80 МОм, вполне вероятно, что кончик электрода нарушается. В этом случае выключите усилитель и изменить записи электрода.
   1. После того, как электродзаменяется и в глаза, включить усилитель для измерения его сопротивления. Иногда, наконечник электрода может перекрыть какой-то детрит, как он входит в ткань. Это может быть исправлено с помощью емкостного Базз и импульс тока функции усилителя, что, как правило, ясно, что быстрым резонирование или отталкивания.
9. Установите усилитель тока-зажим (CC) или в режиме записи моста. Отменить любую произвольную разность потенциалов между записывающими и электродов сравнения, поскольку оба из них сейчас отдыхает в электрически соединены межклеточное пространство, путем установки сигнала смещения (напряжение записи) до нуля. Следуйте сигнала смещения изменения, используя вывод данных на дисплей усилителя или экране осциллографа.
10. Подождите 2-3 мин для мух глаза до темно адаптироваться.
11. Ведите записи электрода кончик постепенно глубже в глаза с небольшими шагами микронных от 0,1 до 1. Делайте это с оси х пьезо-шаговых удаленного управлением микроманипулятора или бу осторожно вращая ручку точного разрешения ручного манипулятора.
12. Стимулируют муха глаз с кратким (1 - 10 мс) вспышек света в качестве электрода записи выдвигается в ткани.
    Примечание: Если электрод записи установлен в сетчатке и функции глаза нормально, каждый вспышка света вызывает короткое и небольшое падение напряжения (0,2 - 5 мВ гиперполяризации), называется электроретинограмму (ЭРГ). Это изменение в поле потенциала внеклеточного пространства обусловлена ​​коллективным ответом клеток к сетчатке глаза "на свету. Однако, как только кончик электрода входит в пластинку, закрывая на LMCS, ЭРГ меняет, показывая деполяризующими ответов.
13. Перемещение источника света вокруг глаз мухи с помощью системы карданного руки и найти место, где свет вызывает большой отклик ERG.
    Примечание: Эта позиция отмечает небольшую область в визуальном пространстве, где фоторецепторы (или LMCS), которые расположены рядом с кончиком электрода записи, Образец их легкий вход.
14. Проникнуть ячейку с электродом записи.
    Примечание: Проникновение может происходить спонтанно, или, когда электрод микро-шаг вперед. Он может быть дополнительно облегчается аккуратным постукиванием системы Микроманипулятор или с помощью гудение-функции усилителя; Эти действия резонировать кончик электрода в ткани. Когда электрод пронзает фоторецепторов мембрану, введя его внутриклеточное пространство, разность напряжений между записью и электрода сравнения резко падает от 0 мВ до ~ -65 мВ (между -55 и -75 мВ); в то время как во время LMC проходок, это падение, как правило, меньше (от -30 до -50 мВ). Эти различия напряжения представляют собой отрицательные потенциалы упокоения данной клетки. В зависимости от качества записи электрода (заточку) и клеточного процесса проникал, показание напряжения от регистрирующего электрода может быстро или постепенно стабилизироваться потенциала покоя, в качестве клеточной мембраныУплотнения к наружному слою электрода. Но если проникновение происходит лишь частично или беден, электрод обычно выскальзывает из ячейки с записанной потенциальной восхождений обратно к нулю.
15. Локализуйте центр рецептивного поля пенетрирован- клетки, когда электрод появляется герметичны, показывая стабильный мембранный потенциал (темный потенциал покоя). Переместите мигающий световой стимул вокруг глаз мухи, с использованием системы карданного руки, чтобы найти точку в визуальном пространстве, где вспышка света вызывает максимальный отклик напряжения ячейки. Зафиксировать карданным руку, когда световой раздражитель непосредственно сталкивается (точки, в) воспринимающий центре поля.
    Примечание: В темноте, дрозофила фоторецепторов реагируют на яркие световые импульсы с 40 - 65 мВ ответов деполяризующими напряжения ^4,5, в то время как стабильные LMC записи показывают , от 20 до 45 мВ гиперполяризационные ответов ^9,10,14. Glia проходки может произойти редко, обозначается <-80 мВ покоя потенциалов и гораздо медленнее,и меньше (~ 5 мВ) насыщенный Светоиндуцированный деполяризаций. Фоторецепторов у дрозофилы с различными глазными пигментации, таких как белый глаз ⁷ и киноварь, показывают сопоставимые размеры отклика дикого типа.
16. Использование режима усилителя тока зажим (CC), компенсируют емкость записывающего электрода, вводя небольшой 0,1 нА и краткое (100 - 200 мс) импульсы тока в исследуемой ячейке, чтобы свести к минимуму записи артефактов во время его зарядки мембраны.
    Примечание: Эта важная процедура подробно описана в руководстве усилителя, и должно быть осуществлено на практике с моделью электрической клеток перед проведением эксперимента.
17. Ответы напряжения Запись на световых импульсов и других стимулов, представляющих интерес, имеющих различные статистические или физические свойства (например, натуралистического интенсивности света временных рядов или случайных узоров контраста). Тест, например, как записанные ответы изменить с легкими или темно-адаптации.
    Примечание: Можно точно LiGHT-адаптируются исследуемую клетку путем непрерывного света заранее выбранной интенсивности, добавив фильтры нейтральной плотности на пути прохождения света ^4,5. В качестве альтернативы, для длительной темной адаптации выключить световой раздражитель в течение заданного времени. Из-за механической устойчивости системы записи, высокое качество записи электродов и нетронутость препарата, стабильные условия съемки иногда может длиться в течение многих часов. Таким образом, в хороший день, можно собрать большое количество данных при различных условиях адаптируя из одной клетки. Когда электрод выскальзывает из ячейки, записанные ответы уменьшаются и среднее напряжение начинает приближаться к нулю.
18. тщательно Авансовые электрода записи с помощью точного контроля оси х микроманипулятора пока электрод не контактирует и проникает в следующую ячейку (как правило, это ближайший сосед нейронная). Не перемещайте электрод вдоль y- или оси, поскольку эти маневры делают электрод к "плтельное ткани "в сторону, повреждения структуры глаза!
    Примечание: С хорошим электродом и здорового препарата, можно записывать высококачественные качество ответов от многих фоторецепторов (но редко из многих LMCS) в том же Облети в течение нескольких часов; время от времени, в течение всего рабочего дня (> 8 ч) без четкого ухудшения сигнала.
19. Сохранение файлов данных периодически с идентифицирующей информацией, такой как дата, генотип, и записываемого типа клеток. Из-за большого объема данных, которые могут быть собраны в успешной записи сессии, сохранить хорошие письменные записи в лабораторном книге для анализа будущих данных.

Результаты

Резкий способ записи микроэлектродный, адаптированной здесь для глаз дрозофилы, может быть использован для надежной количественной оценки нейронной информационной выборки и обработки в сетчатке и ламинированным клеток, а также связь между ними ^{4,5,7,8,10,33.} При использовании его для изучения кодирования в различных запасов дикого типа, мутантов или генетически сконструированных штаммов мух, метод доказал свою ценность; не только в количественной оценке последствий мутации, температуры, диеты или выбранного выражения ^{3,4,6,9,10,14,30,34,} но и в выявлении механистические причины измененными визуальными поведения ^14,34. Способ также легко применимы к другим препаратам насекомых ^35,36, расширяя возможности neuroethological исследования зрения. Далее мы представляем несколько примеров его успешного применения.

Рисунок 7. НапряжениеОтветы плодовой мушки R1-R6 фоторецептор световому импульсу при 20 и 25 ^° С. Поскольку резкие микроэлектродные проникновений часто очень стабильны, можно записать ответы напряжения одного и того же R1-R6 фоторецепторов к данному световой раздражитель в различные температуры окружающей среды путем нагревания или охлаждения лету. В наших наборах, муха-держатель помещается на близком петли Пельтье элементом на основе системы контроля температуры. Это позволяет изменять температуру головы мухи за считанные секунды. Более высокая температура ускоряет реакцию напряжения и , что характерно снижает потенциал покоя R1-R6 фоторецепторов (как показано красными стрелками). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Изучение влияния температуры на фоторецептор Выход

° С (рисунок 7). Как количественно , прежде чем ^4,9, потепление снижает потенциал покоя фоторецептора в темноте, и ускоряет свои ответы напряжения.

Рисунок 8. Signaling Производительность плодовой мушки R1-R6 фоторецептора Улучшает с Интенсивность света (А) выход фоторецептора тускнеть (ниже) и светлые. (Выше; 10000 раз более яркий свет) повторяется натуралистическое временных рядов интенсивности света , записанный тем же микроэлектродомв той же камере при температуре 20 ^о С. Ответы на яркий стимул крупнее, потому что они объединяют в себе большее количество образцов, элементарные ответы (выбоины) для одиночных фотонов ^4,5,7,8. (B) 20 последовательных ответов один второй длинные напряжения накладываются. Индивидуальные ответы (светло - серый) были приняты после того, как адаптивных тенденций (стрелка А) отступило (пунктирная поле в A). Соответствующие средства ответа (сигналы) темные следы. Разница между сигналом и отдельных ответов является шум. (С) клеток "сигнализации производительности количественно с помощью записей , « сигнал-шуму (SNR) с использованием стандартных методов ^4,5,7,8. Выход фоторецептора имеет около 64 Гц более широкий диапазон надежной сигнализации при ярком стимуляции ( _{"Светлый} ≥1, до 84 Гц , чем при тусклом (SNR SNR) _'Dim ≥1, до 20 Гц), с Signal-шум значительно улучшается; от SNR _Dim ^MAX = 87 до SNR _Яркий ^MAX = 1,868. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Изучение адаптации и Neural Кодирование с помощью ритмической стимуляции

Неинвазивность метода, влечет за собой относительно небольшое повреждение в сетчатке и ламинированным структур, делает его идеальным для изучения характеристик передачи сигналов отдельных клеток в различных световых раздражителей в их вблизи естественного физиологического состояния в естественных условиях. На рисунке 8 показаны отклики напряжения постоянного R1- R6 фоторецепторов в тусклом и ярком неоднократного натуралистического света времени интенсивность серии раздражителя при 20 ^о с, в то время как рисунок 9 ° С Пре- и постсинаптические записи были выполнены отдельно от двух различных мух , так как одновременное внутриклеточные записей по двум острыми микроэлектродов в том же ходу, один в сетчатке , а другой в листовых пластинках, слишком сложно , чтобы быть жизнеспособным ^30.

Рисунок 9. Реакции напряжения плодовой мушки R1-R6 фоторецептор и БМО к многократному натуралистического стимуляции при 25 ^° С (А) R1-R6 (серый) и LMC (черный) выводит записанные различными микроэлектродов из разных мух. (B) Полностью свет адаптированный 20 последовательных пре- (выше) и постсинаптические (ниже) ответов на тот же натуралистического последовательности стимула с индивидуальными ответами, как показано на светло - серыйг соответствующие средства ответа (сигналы), как темные следы. Разница между сигналом и отдельных ответов является шум. (С) клеток "сигнализации производительности количественно с помощью записей , « сигнал-шуму (SNR). Выход LMC имеет около 10 Гц более широкий диапазон надежной передачи сигналов (SNR _'LMC ≥1, до 104 Гц) , чем выход R1-R6 (SNR' _R ≥1, вплоть до 94 Гц). Оба отношения сигнал-шум высоки (SNR _LMC ^MAX = 142, SNR _R ^MAX = 752), а также шум записи была низкой, их различия отражают реальные различия кодирования между ячейками. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы увидеть увеличенную версию эта фигура.

После начала стимула, записи типичныйLY показывают быстро адаптируя тенденции, которые в значительной степени ослабевать в течение 5-6 сек. С тех пор, клетки производят весьма последовательные ответы на каждый 1 сек длительный стимул презентации (каждая пунктирная рамка охватывает 20 из них). Повторные ответов становится очевидным , когда они накладываются (8В и 9В). Индивидуальные ответы тонкие серые следы, и их средней толще темный след. Средний ответ принимается в качестве нейронного сигнала, в то время как нейронные шум является разница между средним значением и каждого отдельного ^4,5,9,37,38 ответа. Соответствующие отношения сигнал-шум в частотной области (рис 8C и рисунке 9в) были получены с помощью Фурье-преобразования сигнала и шума кусками данных в спектрах мощности и разделения спектра мощности сигнала средней с соответствующим средним значением шума спектра мощности ^{4, 5,9,37,38.} Характерно, что максимальные отношения сигнал-шум Oе записанные нейронные выходы к натуралистической стимуляции высоки (100 - 1000), а в наиболее стабильных препаратов с очень низким уровнем шума записи может достигать значений >> 1000 (например, рис 8C.). Заметьте также , что потепление расширяет клеток пропускную способность надежной сигнализации ⁴ (SNR _'Яркий ≥ 1); например, относительная разность между двумя R1-R6S на рисунках 8 и 9, соответственно, составляет 10 Гц (84 при 20 ^° С и 94 Гц при 25 ^° С).

Можно дополнительно оценить скорость каждой ячейки передачи информации от ее отношения сигнал-шум с помощью уравнения Шеннона ^32, или путем вычисления разности между энтропией и шумовых ставок энтропии ответов "через тройной метод экстраполяции ^39. Подробнее об информации, теоретического анализа, а также их использование и ограничениеы конкретно с помощью этого метода приведены в предыдущих публикациях ^7,8,39.

Рисунок 10. Ответы напряжения убийцы Fly R1-R6 фоторецептор и БМО к многократному натуралистического стимуляции при 19 ^о С (А) R1-R6 (серый) и LMC (черный) выводит записанные тем же микроэлектродом из того же лету; первый постсинаптически, а затем пресинаптически, как электрод был продвинут в глаза. (В) 20 последовательных заранее (выше) и постсинаптические (ниже) ответы (светло - серые следы) к тому же натуралистического последовательности стимула были захвачены после первоначальной адаптации (пунктирная коробки в A). Их средства сигналы (темные следы на вершине), в то время как их соответствующие отличия от отдельных ответов дают шум. (C) , соответствующий Signaл-к-шуму (SNR) рассчитывались как на фигурах 8С и 9С. Выход LMC имеет около 100 Гц более широкий спектр надежной передачи сигналов (SNR _'LMC ^MAX ≥1, до 234 Гц) , чем выход R1-R6 (SNR' _{R ^MAX} ≥1, до 134 Гц). Оба отношения сигнал-шум высоки (SNR _LMC ^MAX = 137, SNR _R ^MAX = 627), а как же микроэлектродный был использован в записи, их различия отражают реальные различия в пре- и постсинаптических нервных выходов. Эти результаты означают , что система записи была низким уровнем шума, а также его влияние на анализе был незначительным. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Neuroethological Видение Исследования

Способ также может быть использован для записи до и постсинаптические реакции напряжение от сложных глаз различных видов насекомых ^7,8,35,36 (рисунок 10), что позволяет сравнительными neuroethological исследования обработки визуальной информации. Для представленной системы записи, только необходимая адаптация нового препарата-держатели, каждый с соответствующим размера отверстия для изученных видов. Эти примерные записи взяты из женского убийцы мухи (Coenosia attenuata). Они показывают внутриклеточные реакции напряжения фотоэлектрического R1-R6 и БМО к идентичным повторяющейся световой стимуляции, используемый для аналогов дрозофилы на рисунке 9, но при 19 ^о С. В этом случае, как пред- и постсинаптические данные были записаны с той же мухи; один за другим, с тем же электродом записи (заполненной 3 М KCl) первый наступающей через боковую пластинкой, прежде чем войтиИНГ лобную сетчатку. По сравнению с данными дрозофилы при 25 ^° C, данные Coenosia - даже при более низкой температуре - показывает ответы с более быстрой динамикой; расширение спектра надежной сигнализации (отношение сигнал-шум >> 1) в более широком диапазоне частот. Такие функциональные адаптации в нейронной кодировании натуралистических стимулов согласуются с хищным образом жизни ³⁶ Coenosia 's, которые требуют высокой точности информации пространственно - временной для достижения быстрых воздушных охоты поведения.

Обсуждение

Мы представили основные ключевые шаги по использованию острых обычных микроэлектродов для регистрации внутриклеточных реакций фоторецепторов R1-R6 и БМК в неповрежденных глазах мухи. Этот метод был оптимизирован вместе с индивидуальными аппаратными и программными инструментами в течение последних 18 лет, чтобы обеспечить высококачественные длительные записи, отвечающие на широкий спектр экспериментальных вопросов. Затрачивая время и ресурсы на создание надежных и точных экспериментальных установок, а также на производство микроэлектродов с благоприятными электрическими свойствами, высококачественные записи могут стать нормой в любой лаборатории, занимающейся визуальной нейрофизиологией дрозофилы . В то время как хорошо спроектированные системы записи и световой стимуляции важны для быстрого выполнения различных экспериментальных парадигм, существуют три процедурных шага, которые еще более важны для достижения успешных записей: (i) сделать препарат от мухи с минимальным повреждением глаза, (ii) вытянуть микроэлектроды с нужными электрическими свойствами и (iii) ввести записывающий электрод в глаз, не сломав его кончик. В конечном счете, чтобы записать значимые данные, исследователь должен понимать физические основы электрофизиологии и то, как изготавливать подходящие микроэлектроды для целевых типов клеток.

Поэтому ограничения этой методики в первую очередь обусловлены терпением, опытом и техническими возможностями исследователя. Поскольку для освоения этой техники для небольших клеток дрозофилы может потребоваться много времени, электрофизиологам-стажерам рекомендуется сначала попрактиковаться с более крупными глазами насекомых, таких как иглобрюх³⁶ или саранча³⁵, используя ту же установку. Как только выполнение высококачественных внутриклеточных записей с более крупных фоторецепторов и интернейронов становится рутиной, пришло время перейти к глазу дрозофилы . Еще одно ограничение методики касается клеточной идентификации. Проникшие в клетки дрозофилы могут быть электрофоретически загружены красителями, в том числе люциферовым желтым или нейробиотином. Однако из-за небольшого размера наконечника микроэлектродов электрофорез работает менее эффективно, чем при использовании электродов с более низким сопротивлением, таких как патч-электроды. Кроме того, микроэлектроды, заполненные красителем, характерно обладают менее благоприятными электрическими свойствами, что значительно затрудняет регистрацию высококачественных ответов с их помощью от фоторецепторов и БМК дрозофилы .

Техническая проблема, которая иногда возникает – это нестабильный входной сигнал, либо полное его отсутствие. Это часто связано с тем, что сигнал напряжения либо постоянно дрейфует, либо выше/ниже диапазона записи усилителя. В большинстве случаев такое поведение вызвано блокировкой записывающего электрода (или его кончик слишком тонким - со слишком высоким сопротивлением или внутренней емкостью - для правильного проведения быстрых изменений сигнала). Хотя можно попытаться разблокировать наконечник, жужжа емкости электрода, что иногда срабатывает, часто ситуацию лучше всего решить, просто заменив записывающий электрод. Кроме того, может потребоваться регулировка параметров в приборе для съемки микроэлектродов для снижения сопротивления наконечника новых электродов. Наконечник электрода также может быть заблокирован при препаратах, для которых потребовалось слишком много времени, чтобы покрыть отверстие роговицы вазелином. Длительный контакт с воздухом может высушить только что обнаженную ткань сетчатки, превратив ее поверхностный слой в клейкое вещество. В этом случае исследователь обычно видит красное пятно ткани, застрявшее на записывающем электроде, когда вытаскивает его из глаза. Единственное решение здесь – сделать новую подготовку. Вазелин может обеспечить множество преимуществ для электрофизиологической регистрации: (i) он предотвращает коагуляцию гемолимфы, которая может сломать кончик электрода; (ii) он покрывает кончик электрода, уменьшая его внутреннюю емкость, что снижает постоянную времени электрода и, таким образом, обладает потенциалом для улучшения временного разрешения регистрируемых нейронных сигналов^40,41; (iii) он сохраняет наконечник электрода в чистоте, облегчая проникновение; А после проникновения (iv) может даже помочь герметизация кончика электрода с клеточной мембраной⁴².

Кроме того, сигнал может быть нестабильным или теряться при обрыве или дехлоридизации хлоридной проволоки электрододержателя; В этом случае просто замените или повторно хлорируйте старый провод. Отсутствующий сигнал также может быть вызван тем, что один (или оба) держатели электродов не были надежно подключены к своим гнездам. Тем не менее, крайне необычно, что часть оборудования может быть неисправна. Если сигнал не обнаруживается и все другие возможности исчерпаны, проверьте, правильно ли подключена и функционирует ли каждая часть записывающего устройства, включая сцену, усилитель, фильтры нижних частот и АЦП/ЦАП. Одним из способов достижения этой цели является замена каждого инструмента на другой от буровой установки, которая, как известно, работает нормально. В качестве альтернативы можно использовать генератор сигналов для проверки работоспособности электронных компонентов по одному.

Но, пожалуй, самая распространенная техническая проблема, с которой сталкивается электрофизиолог, — это запись шума. В широком смысле шум записи — это наблюдаемая электрическая активность, отличная от прямой реакции нейронов на данный стимул. Поскольку подготовка к мухе, при правильном выполнении, очень стабильна, наблюдаемый шум (выходящий за рамки естественной изменчивости реакций) чаще всего возникает в результате заземления в регистрирующем оборудовании или улавливается близлежащими электрическими устройствами. Такой шум обычно представляет собой гул сети с частотой 50/60 Гц и его гармоники; но иногда состоит из более сложных форм волн. Чтобы выяснить источник шума, снимите держатель для подготовки от мух с установки, подключите записывающие и референсные электроды через каплю Ringer (или поместите их в небольшую ванну с раствором Ringer; см. пункт 1.2.6) и запишите сигнал в режиме CC или моста. Если на записанном сигнале наблюдается шум, это, вероятно, означает, что шум является внешним по отношению к подготовке к мухе.

Еще одним хорошим тестом для определения происхождения шума является замена держателей электродов на модель электрической ячейки, подключенной к усилителю. В идеально сконфигурированной и заземленной системе записанный сигнал теперь должен быть практически без шумов, показывая только стохастический битовый шум от АЦП (в лучшем случае даже не это!). Если шум все еще присутствует, повторно проверьте, правильно ли заземлено все оборудование буровой установки. Удобный способ обнаружения контуров заземления заключается в следующем: (i) отсоедините все заземляющие провода от всех частей буровой установки; ii) обеспечить, чтобы после этого каждая отдельная часть была фактически изолирована от земли с помощью омметра; (iii) соединять части одну за другой с центральным заземлением напрямую, а не через какую-либо другую часть буровой установки. Попробуйте также изменить конфигурацию оборудования. Например, иногда перемещение компьютера и монитора дальше от буровой установки может снизить уровень шума; Тем не менее, в других случаях перемещение компьютера внутрь стойки для оборудования снижает уровень шума. Также стоит отключить от сети близлежащее оборудование, чтобы увидеть, снизился ли уровень шума, или экранировать дополнительные компоненты. Кроме того, попробуйте отключить или заменить различные компоненты записывающего оборудования, особенно кабели BNC (которые могут иметь неисправные заземления). Если при использовании модели ячейки наблюдается только битовый шум, то исходным источником шума являются либо электроды, либо сам препарат от мухи. Например, может случиться так, что электрод сравнения случайно коснется двигательного нерва или активных мышечных волокон внутри капсулы головы (или нарушит полетные мышцы в грудной клетке, если они там расположены). Как правило, проще всего подготовить новую мушку к съемке, позаботившись о том, чтобы свести к минимуму повреждение мухи. Но если шум сохраняется и является широкополосным, вполне вероятно, что электроды не являются оптимальными для экспериментов; слишком резкий/тонкий (следовательно, слишком шумный) или просто неподходящий для этой цели; Мы даже видели, как кварцевые электроды действуют как антенны, улавливая слабые сигналы вещания! Несмотря на то, что итерация настроек параметра съемника для создания подходящих микроэлектродов для стабильной высококачественной записи с определенных типов клеток может потребовать больших усилий, она того стоит. После того, как записывающие электроды хорошо подобраны для проведения экспериментов, они могут обеспечить длительную запись выдающегося качества.

Методы записи острых микроэлектродов могут быть аналогичным образом применены для изучения обработки нейронной информации во множестве препаратов, включая различные уровни обработки в глазах и мозге насекомых^43,44. Поскольку наконечники микроэлектродов могут быть очень тонкими, они обычно повреждают исследуемые элементы меньше, чем большинство применений патч-хомутов. Важно отметить, что современные усилители с функцией выборки и удержания позволяют хорошо контролировать электрические свойства зондов^40,45-47. Таким образом, при правильном применении эта методика может обеспечить получение достоверных данных как от препаратов in vivo^3,5,7-10,44, так и от in vitro⁴⁸ с высоким отношением сигнал/шум с разрешением менее миллисекунды. Такая точность была бы невозможна с сегодняшними методами оптической визуализации, которые более шумные и медленные. Кроме того, этот метод может быть использован для характеристики свойств электрических мембран малых клеток как в конфигурациях ток-, так и в конфигурациях с потенциальными зажимами^{5,29,33,36,40-42,49}, предоставляя ценные данные для биофизических и эмпирических подходов к моделированию^{7,8,11,33,49-54} , которые связывают эксперименты с теорией.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Стерео Зум Микроскоп для подготовки к мухе	Olympus	SZX12 DFPLFL1,6x ПФ окуляры: WHN30x-H/22	Способен к ~150-кратному увеличению с большим рабочим расстоянием; изготовлен на заказ тяжелая стальная настольная подставка
Стереомикроскоп во внутриклеточной установке	·   Olympus	Olympus SZX7; окуляры: WHN30x-H/22	Окуляры 30X нужны для того, чтобы хорошо видеть отражения кончика электрода при заведении его через маленькое отверстие роговицы в глаз
Nikon микроскоп	Nikon SMZ645; окуляры: C-W30x/7
Anti-vibration Table	Melles Griot	С метрическими отверстиями M6 на макетной плате	Наши изготовленные на заказ оснастки имеют большое отверстие, просверленное в толстой макетной плате, которое пропускает столб платформы для подготовки мухи (в котором находится медный радиатор с электроникой) снизу
Newport
	Narishige Narishige	NMN-21	В наших внутриклеточных установках используются различные системы микроманипуляторов для забивания записывающих электродов в глаз мухи. Все перечисленные манипуляторы успешно обеспечивают длительную стабильную запись от фоторецепторов и БМК дрозофилы.
Huxley Bertram	Huxley xyz-axis с точным ручным управлением
Sensapex	Sensapex Triple axis
Mä рж&аумл; пользователь	Mä рж&аумл; пользовательский DC-3K с дополнительным пьезошаговым устройством по оси X и контроллером
Магнитные стойки	Любая магнитная база с переключателем включения/выключения подойдет		Например, для управления кабелями внутри клетки Фарадея
Держатели электродов	Harvard Apparatus	ESP/W-F10N
Silver Wire	World Precision Instruments	AGW1510	диаметром 0,3 - 0,5 мм; необходимо хлорировать для держателей электродов
Волоконно-оптический источник света	Много различных, включая Olympus
Волоконно-оптические пучки	Технология UltraFine Для		подачи светодиодного светового стимула в систему карданного рычага. Мы используем как жидкие, так и кварцевые световоды (от УФ до ИК)
Трубка
Цифровая система сбора данных	National Instruments
Одноэлектродный усилитель тока/напряжения с микроэлектродным зажимом	npi SEC-10LX	http://www.npielectronic.de/products/amplifiers/sec-single-electrode-clamp/sec-10lx.html	Выдающаяся производительность!
Стандарт для головной сцены	(+/- 150 нА)	npi SEC-10LX
	2-канальный OptoLED (Cairn Research Ltd., Великобритания)		Многие из наших стимульных систем изготовлены на собственном производстве;
Самостоятельно разработанное и сконструированное
программное обеспечение для сбора и анализа	Многие компании на выбор Biosyst		; специально разработанная система на основе Matlab для экспериментальной и теоретической работы в лаборатории Juusola
Персональный компьютер или Mac			Убедитесь, что ПК или Mac совместимы с системой сбора данных и программным обеспечением
Система Cardan Arm	Самостоятельно спроектированный и сконструированный		Обеспечение точного x,y,z-позиционирования световых стимулов
Система термостатирования Пельтье	Самостоятельно спроектированная и изготовленная
клетка Фарадея	Самоизделие		Электромагнитное шумозащитное
покрытие Капилляры		Внешний диаметр: 1 мм
Внутренний диаметр: 0,5 - 0,7 мм
Капилляры		Внешний диаметр: 1 мм
Внутренний диаметр: 0,5 - 0,7 мм
Пуллер для пипеток	Sutter Instrument Модель	P-2000 лазер Flaming/Brown Micropipette Puller	Для боросиликатных электродов сравнения используйте предустановленную программу #11 (патч-электроды): Нагрев = 350; Нить накала = 4; Скорость 36; Задержка = 200).1.2.1). Для боросиликатных записывающих электродов используйте предустановленную программу #12 (обычно она вытягивает хорошие обычные шарпы  для фоторецепторной записи): Heat = 355; Нить накала = 4; Скорость 50; Задержка = 225; Тяга = 150. Для записи БМО, для которых требуются электроды с более тонкими наконечниками, эти значения необходимо регулировать. Для вытягивания кварцевых капилляров в мануале P-2000 предлагаются программы для микроэлектродов с тонкими наконечниками. Эти программы Предустановленные параметры служат полезными отправными точками для систематических модификаций для создания электродов с хорошей эффективностью проникновения и низким уровнем шума записи.
Внеклеточный Ringer Раствор для электрода сравнения	Химикаты от Fisher Scientific	10326390, NaCl 10010310, KCl 10147753, TES 10161800, CaCl2 10159872, MgCl2 10000430, сахароза	Смотрите рецепт в разделе
протокола 3 М раствор KCl для заполнения нитевидного записывающего микроэлектрода	Соли от Fisher Scientific	10010310, KCl
Вазелин
Бритвенные лезвия
Держатель/прерыватель лезвия	Fine Science Tools By Dumont	10053-09	9
см Blu-tack	Bostik		В качестве альтернативы используйте формовочную глину
Щипцы	Fine Science Tools By Dumont	11252-00	#5SF (сверхтонкие наконечники)