Методическая статья

Высокочувствительных и быстрое обнаружение флуоресценция с помощью портативного анализатора FRET

8.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54144

⸱

1 октября 2016 г.

 ,  ,  ,  , 
1Synthetic Biology & Bioengineering Research Center, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, 2College of Interdisciplinary & Creative Studies, Konyang University, 3Biosystems and Bioengineering Program, University of Science and Technology

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает быструю и высокочувствительную квантификацию Ферстер резонансный перенос энергии (FRET) данных датчиков с использованием заказных портативного анализатора ладу. Устройство было использовано для обнаружения мальтозу в пределах диапазона критических температур, что обеспечивает максимальную чувствительность обнаружения, что позволяет практическую и эффективную оценку содержания сахара.

Аннотация

Последние достижения в области Форстера резонансного переноса энергии (FRET) датчики позволили использовать их для обнаружения различных малых молекул, в том числе ионов и аминокислот. Однако врожденная слабая интенсивность сигнала датчиков FRET является серьезной проблемой, которая препятствует их применению в различных областях и делает использование дорогих, высокого класса флуорометры необходимо. Ранее мы создали экономически эффективное, высокопроизводительное FRET анализатор, который может конкретно измерить отношение двух эмиссионных диапазонах длин волн (530 и 480 нм) для достижения высокой чувствительности обнаружения. Совсем недавно было обнаружено, что FRET датчики с бактериальным периплазматических белков, связывающих обнаружить лиганды с максимальной чувствительностью в критическом интервале температур от 50 - 55 ° C. Этот отчет описывает протокол для оценки содержания сахара в коммерчески доступных образцов напитков с использованием нашего портативного анализатора FRET с датчиком температуры FRET конкретного. Наши результаты показали, что дополнительный предварительный нагревПроцесс датчика FRET значительно увеличивает отношение сигнал FRET, чтобы обеспечить более точное измерение содержания сахара. На заказ FRET анализатор и датчик были успешно применены для количественного определения содержания сахара в трех типах коммерческих напитков. Мы ожидаем, что дальнейшее уменьшение размера и производительности улучшение оборудования будет способствовать использованию ручных анализаторов в средах, где высококачественное оборудование не доступно.

Введение

Ферстер резонансный перенос энергии (FRET) широко используется в качестве биометрический датчик для обнаружения малых молекул , таких как сахара, ионов кальция и аминокислот 1-4. FRET биосенсоры содержат флуоресцентные белки, голубому флуоресцентные белки (СЛТ) и желтый флуоресцентные белки (YFPs), которые сливают с обоих концов периплазматических-связывающего протеина (ПСП). Сугарс связываются с ПСБ, расположенных в середине датчика FRET, вызывая структурные изменения в датчике, который впоследствии варьировал расстояние и дипольным ориентация двух флуоресцирующих белков в любом конце РВР. Это изменение позволяет количественного анализа содержания сахара путем измерения отношения длин волн излучения EYFP (530 нм) и ECFP (480 нм). Благодаря высокой чувствительности, специфичности, возможности мониторинга в режиме реального времени, а также быстрое время отклика FRET биосенсоров, эти датчики широко используются в экологических, промышленных и медицинских применений 5. Кроме того, ratiomИзмерение etric с использованием FRET биосенсоров имеет важные практические преимущества, так как он может быть использован для измерения компонентов в сложных биологических образцах, где концентрация датчик не может легко контролировать и фоновой флуоресценции всегда присутствует.

Несмотря на эти преимущества датчиков на основе FRET для количественной визуализации, небольшие структурные изменения с неполным домена движения-передачи к флуоресцентных белков производят интенсивность по своей сути слабый сигнал. Этот слабый сигнал ограничивает применение датчиков FRET основе для в пробирке или в естественных условиях анализа 6. Следовательно, большинство FRET биосенсоры требуют применения дорогостоящих и высокочувствительного оборудования. Ранее мы разработали недорогой и портативный анализатор ладу возможностями , аналогичными существующих флуоресцентных анализаторов 7. В этом устройстве, недорогой 405-нм диапазона ультрафиолетового света на светоизлучающих диодах (СИД), был использован в качестве источника света, чтобы вызвать возбуждение госигнал флуоресценции е, заменяя дорогую лампу или лазер. Система обнаружения анализатора эффективно фокусирует сигнал флуоресценции рассеивая на двух фотоприемников с кремниевым фотодиодом. В более позднем исследовании мы показали , что оптимизация температуры обнаружения при 50 - 55 ° С может существенно увеличить радиометрический сигнал FRET 8. Это усиление сигнала температуры конкретных, наряду с заказного анализатором FRET, позволяет использовать датчики FRET в более общих диагностических применений с быстрой и высокой чувствительностью.

В этом протоколе мы продемонстрировали общую применимость анализатора FRET при оптимальных температурных условиях FRET путем количественного определения содержания сахара в коммерчески доступных напитков. Этот протокол обеспечивает детали операции FRET устройства, а также краткое описание датчика и подготовки проб. Мы ожидаем, что этот доклад будет способствовать потенциальное применение портативногоАнализатор в небольших лабораторных условиях и обеспечивают основу для дальнейшего развития недорогого на месте диагностического устройства с биосенсоров FRET основе.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Приготовление биосенсора

  1. Построить плазмиду pET21a (+) - CFP-MBP-YFP-His6 следуя ранее установленным протоколом 2.
  2. Инокулируйте 5 мл бульона Луриа (LB) с одной колонии штамма кишечной палочки DE3 и инкубировать при 37 ° С в течение 16 часов при встряхивании.
  3. Передача 1 мл / N O культуры в 500-мл колбу , содержащую 100 мл LB и инкубировать при 37 ° С в качалке инкубаторе до тех пор пока оптическая плотность при 600 нм (OD 600) не достигнет 0,5 (около 3 ч).
  4. Сбора клеток в 50 мл коническую пробирку центрифугированием при 1000 х г в течение 20 мин при температуре 4 ° С.
  5. Ресуспендируют осадок быстро в каждую пробирку с 50 мл охлажденной льдом дистиллированной воды (DW) и центрифуге при 1000 х г в течение 20 мин при температуре 4 ° С.
  6. Ресуспендируют осадок в 50 мкл охлажденного льдом DW с добавлением 10% (об / об) глицерина, осторожно не закрученной , пока раствор (Электрокомпетентные клетки) достигает OD 600 100.
  7. Поместите смесь электрокомпетентных клеток (50 мкл клеток при OD 600 из 100) и 10 нг плазмиды pET21a (+) - КФП-МВР-YFP-His6 в охлажденный льдом кювету для электропорации в электропорации устройства и электропорации смесь (18 кВ / см, 25 мкФ).
  8. Быстрое добавление 1 мл SOC среды в кювету и клетки вновь суспендируют мягко, с последующим восстановлением при температуре 37 ° С в течение 1 ч при осторожном встряхивании в 15 мл с круглым дном трубки.
  9. Разведите клетки на пластине LB, содержащей 100 мкг / мл ампициллина, и инкубируют при температуре 37 ° С в течение 12 часов.
  10. Изолируйте одну колонию с помощью цикла и инокуляции колонию в 10 мл LB, содержащей 100 мкг / мл ампициллина, при 37 ° С в шейкере в течение 12 часов.
  11. Добавьте 5 мл посевной культуры в 500 мл LB, содержащей 100 мкг / мл ампициллина, и инкубируют культуры в качалке инкубаторе 37 ° C.
  12. Добавить 0,5 мМ изопропил β-d-тиогалактозида (IPTG) , когда OD 600 достигает0,5 и инкубировать культуры в качалке инкубаторе 37 ° C в течение 24 часов.
  13. Центрифуга клетки при 4500 х г в течение 20 мин (4 ° С) и осторожно удалить супернатант.
  14. Ресуспендируют осадок в 5 мл буфера для связывания (20 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 1 мМ PMSF, 0,5 мМ ЭДТА и 1 мМ DTT).
  15. Разрушать ультразвуком клетки на льду с шестью 10-сек всплесков на 200-300 Вт, после каждого пакета с 10 сек охлаждения.
  16. Центрифуга лизат при 10000 × г в течение 30 мин при 4 ° С для осаждения клеточного дебриса. Перенести супернатант (растворимый белок) в новую пробирку для сбора.
  17. Для достижения аффинной очистки белков датчиков ладу нагрузки 4 мл очищенного клеточного лизата на аффинную колонку Ni-NTA (5-мл объема) и выполнить анализ - хроматографии с использованием быстрой жидкостной хроматографии протеинов (FPLC) 18.
  18. Промывают колонку один раз с пятью колоночными объемами буфера для промывки I (50 мМ фосфатный буфер, 300 мМ хлорида натрия, 10 мМ имидазола, рН 7,0).
  19. Повторите стадию промывки с пятью колоночными объемами буфера для промывки II (50 мМ фосфатный буфер, 300 мМ хлорида натрия, 20 мМ имидазола, рН 7,0).
  20. Элюции белка датчика с пятью колоночными объемами буфера для элюции (50 мМ фосфатный буфер, 300 мМ хлорида натрия, 500 мМ имидазола, рН 7,0).
  21. Для того, чтобы сконцентрировать и обессоливания элюированный образец, заполнить концентраторы (размер мембраны 10000 МВт) до 20 мл образца и центрифуги в течение 10 мин при 3000 г. Refill Концентратор с 0,8% фосфатно-буферном солевом растворе (PBS). Повторите этот шаг дважды, сначала заполнение концентратором 20 мл образца, а затем заправку с PBS.
  22. Восстановление концентрированного и де-соленая белок датчика и хранить его при температуре -80 ° C.

2. Измерение содержания сахара с помощью FRET Analyzer

ПРИМЕЧАНИЕ: Детали анализатора конструкции FRET были описаны в нашей предыдущей работе 7.

  1. Приготовьте раствор обнаружения 0,8% PBS, содержащего 0,2мкМ белков датчиков.
  2. Включите анализатор ладу. Нажмите кнопку "UP" в течение 2 секунд для калибровки оптимальной температуры. Установите температуру до 53 ° С, используя "вверх" и кнопки "DOWN" и нажмите кнопку "SET".
  3. Для калибровки нажмите и удерживайте кнопку "UP" и кнопки "DOWN" одновременно в течение 2 сек. Убедитесь, что светодиодные дисплеи "CALIB" и нажмите кнопку "SET".
  4. Поместите 12,5 × 12,5 × 45 мм (длина × ширина × высота) прямоугольный параллелепипед сосуда (кювета), содержащий только PBS буфера в держатель кювет анализатора и нажмите кнопку "SET".
  5. Замените кювету одна из которых содержит только решение обнаружения (см 2.1) без сахара (мальтоза / сахарозы) и нажмите кнопку "SET" для калибровки базовой линии.
  6. Замените кювету с одним, содержащую раствор обнаружения с 10 мМ сахаром и нажмите "SET"Кнопка.
  7. Для определения содержания сахара в образце напитка, положить 1 образец мл напитка в 1,5 мл микроцентрифужных трубки и центрифуге при 16000 × г в течение 1 мин.
    Примечание: Измерение флуоресценции FRET на основе датчиков имеет то преимущество, что они не требуют специальной предварительной обработки образца, так как только 1% (об / об) образца входит в общем объеме. Тем не менее, мы рекомендуем удалить любые материалы , которые могут повлиять на точность измерения флуоресценции (например, клетки, нерастворимые частицы, липидов, жиров, или любой материал с автофлюоресценции). Кроме того, если сильная кислота, сильное основание, чистящее средство (детергент), или эмульгатором (эмульгатор) присутствует в высокой концентрации, и может влиять на свойства биологического датчика FRET, она должна быть удалена с использованием органического растворителя или нейтрализатор. Например, когда молочный жир и эмульгаторы, исключаются из замороженных закусок, образцы центрифугируют в пробирке при 16000 & bull; g в течение 30 мин, а жидкость betweeп донных отложений и верхний слой молочного жира извлекается. Равное количество гексана, а затем, с последующим центрифугированием при 15000 х г в течение 30 мин, чтобы исключить липиды.
  8. Удалить супернатант с 1 мл шприц и фильтруют его через фильтр в шприце (размер пор 0,2 мкм).
  9. Поместите 0,1 мл отфильтрованного образца напитка в 1,5 мл микроцентрифужных пробирку, содержащую 0,9 мл PBS и водоворот осторожно.
    Примечание: Очень важно, чтобы разбавить образец напитка должным образом. В этом случае, 1000-кратное разведение проводили таким образом, чтобы концентрация сахара будет находиться в пределах динамического диапазона устройства. Мы рекомендуем оценить концентрацию целевого сахара заранее, ссылаясь на содержание сахара в этикетке напитка.
  10. Добавьте 5 мкл разбавленной пробы напитка (1%, об / об) в кювету, содержащую 0,495 мл раствора обнаружения.
  11. Поместите кювету в держатель кювет анализатора FRET и предварительного нагрева образца раствора до 53 ° С.
  12. Нажмите кнопку "SET" для измерения содержания сахара.
    Примечание Можно оценить измерение FRET с использованием считывателя MultiLabel пластины или флуоресцентный спектрофотометр , снабженный устройством Пельтье для регулирования температуры путем считывания соотношение при 488/535 нм 7,8. Для обнаружения сахарозы, выполните шаги с 1,1 до 2,12 с датчиком ЧСЗ-LH 2.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Для проведения количественного анализа содержания сахара с использованием анализатора FRET, необходимо построить кривую подогнанную оценки концентрации целевого сахара из наблюдаемого соотношения FRET. Пусть г определить отношение интенсивности излучения УНЧ при длине волны 480 нм и интенсивность излучения YFP генерируется при 530 нм (уравнение. 1).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Этот протокол позволяет быстро и эффективно количественно оценить содержание сахара в образцах напитков, с использованием заказных FRET анализатор 7 при оптимальной температуре для датчиков ладу. Анализатор был разработан с недавно развитой, недорогой 405-нм полоса ультрафиолетовое-LED в качестве источника света и двух фотоприемников с кремниевым фотодиодом. Это устройство является более экономически эффективным, чем другие сопоставимые флюорометрами. Прибор показал высокую чувствительность обнаружения, в час...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

Это исследование было поддержано грантами от Intelligent синтетической биологии Центра глобального проекта Frontier (2011-0031944) и Программы KRIBB исследовательской инициативы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
LBBD#244620
изопропил &бета;-D-тиогалактозид (IPTG)SigmaI6758
АмпициллинSigmaA9518
Tri-HClBioneerC-9006-1
PMSFSigma78830
EDTABioneerC-9007
DTT SigmaD0632
NaClJunsei19015-0350
фосфатно-солевой буфер (PBS)Gibco70011-0440,8% NaCl, 0,02% KCl, 0,0144% Na<суб>2HPO<суб>4, 0,024% KH<суб>2OP<суб>4, pH 7,4
SOC2% триптон, 0,5% экстракт дрожжей, 10 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 10 мМ MGCl<суб>2, 20 мМ Глюкозный
ресурс QAmersham Biosciences17-1177-016 &x 30 мм анионообменная хроматографическая колонка 
HisTrap HP1Amersham Biosciences29-0510-21
Кварцевая кюветаSigmaZ802875
AKÄ KTAFPLCAmersham Biosciences18-1900-26быстрая белковая жидкостная хроматография (FPLC)
Cary EclipseVarianIncфлуоресцентный спектрофотометр
VICTOR   PerkinElmer2030-0050считыватель мультиэтикеточных пластин
E. coli JM109 (DE3)PromegaElectrocompetent Cells
A (Напитки)Korea Yakult Co. (Корея)BirakФерментированные напитки
B (Напитки)Lotte Foods (Корея)EproБезалкогольный напиток
C (Напиток)Lotte Foods (Корея)GetorayСпортивный напиток

Ссылки

  1. Deuschle, K., Okumoto, S., Fehr, M., Looger, L. L., Kozhukh, L., Frommer, W. B. Construction and optimization of a family of genetically encoded metabolite sensors by semirational protein engineering. Protein Sci. 14 (9), 2304-2314 (2005).
  2. Ha, J. S., Song, J. J., Lee, Y. M., Kim, S. J., Sohn, J. H., Shin, C. S., Lee, S. G. Design and application of highly responsive fluorescence resonance energy transfer biosensors for detection of sugar in living Saccharomyces cerevisiae cells. Appl. Environ. Microbiol. 73 (22), 7408-7414 (2007).
  3. Nagai, T., Yamada, S., Tominaga, T., Ichikawa, M., Miyawaki, A. Expanded dynamic range of fluorescent indicators for Ca(2+) by circularly permuted yellow fluorescent proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (29), 10554-10559 (2004).
  4. Okumoto, S., Looger, L. L., Micheva, K. D., Reimer, R. J., Smith, S. J., Frommer, W. B. Detection of glutamate release from neurons by genetically encoded surface-displayed FRET nanosensors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (24), 8740-8745 (2005).
  5. Merzlyakov, M., Li, E., Casas, R., Hristova, K. Spectral Förster resonance energy transfer detection of protein interactions in surface-supported bilayers. Langmuir. 22 (16), 6986-6992 (2006).
  6. Zhang, J., Campbell, R. E., Ting, A. Y., Tsien, R. Y. Creating new fluorescent probes for cell biology. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3 (12), 906-918 (2002).
  7. Kim, H., Kim, H. S., Ha, J. S., Lee, S. G. A portable FRET analyzer for rapid detection of sugar content. Analyst. 140 (10), 3384-3389 (2015).
  8. Gam, J., Ha, J. -S., Kim, H., Lee, D. -H., Lee, J., Lee, S. -G. Ratiometric analyses at critical temperatures can magnify the signal intensity of FRET-based sugar sensors with periplasmic binding proteins. Biosens. Bioelectron. 72, 37-43 (2015).
  9. Hessels, A. M., Merkx, M. Genetically-encoded FRET-based sensors for monitoring Zn2+ in living cells. Metallomics. 7 (2), 258-266 (2015).
  10. Song, Y., Yang, M., Wegner, S. V., Zhao, J., Zhu, R., Wu, Y., He, C., Chen, P. R. A genetically encoded FRET sensor for intracellular heme. ACS Chem. Biol. 10 (7), 1610-1615 (2015).
  11. Addgene. Fluorescent Protein Guide: Biosensors. , Available from: https://www.addgene.org/fluorescent-proteins/biosensors/ (2015).
  12. Rajendran, R., Rayman, G. Point-of-care blood glucose testing for diabetes care in hospitalized patients: an evidence-based review. J. Diabetes Sci. Technol. 8 (6), 1081-1090 (2014).
  13. American Diabetes Association. Standards of medical care in diabetes-2013. , Available from: http://care.diabetesjournals.org/site/misc/2016-Standards-of-Care.pdf (2015).
  14. Vyas, N. K., Vyas, M. N., Quiocho, F. A. Sugar and signal-transducer binding sites of the Escherichia coli galactose chemoreceptor protein. Science. 242, 1290-1295 (1988).
  15. Leermakers, E. T. M., Felix, J. F., Erler, N. S., Ċerimagić, A., Wijtzes, A. I., Hofman, A., Raat, H., Moll, H. A., Rivadeneira, F., Jaddoe, V. W., Franco, O. H., Kiefte-de Jong, J. C. Sugar-containing beverage intake in toddlers and body composition up to age 6 years: The Generation R Study. Eur. J. Clin. Nutr. 69 (3), 314-321 (2015).
  16. Shilts, M., Styne, D., Drake, C., Aden, C., Townsend, M. Fast food, fat and sugar sweetened beverage items are related to children's dietary energy density. FASEB J. 29 (1), 731-736 (2015).
  17. Larsson, S. C., Åkesson, A., Wolk, A. Sweetened beverage consumption is associated with increased risk of stroke in women and men. J Nutr. 144 (6), 856-860 (2014).
  18. Melkko, S., Neri, D. Calmodulin as an affinity purification tag. E. coli Gene Expression Protocols. Vaillancourt, P. E. , Methods in Molecular Biology; 205. Humana Press. Totowa, NJ. 69-77 (2003).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

FRET

Похожие статьи