В этой статье представлен протокол производства белковых наночастиц, который изменяет гидрофобную поверхность на гидрофильную. Полученная наночастица представляет собой сборку глиадин-цианоакрилатных диблок-сополимеров. Распыление покрытия полученной наночастицей изменяет поверхность материала мишени на гидрофильную поверхность.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Протокол для производства Глиадин-цианоакрилатных наночастицами для гидрофильного покрытия
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
В данной статье представлен протокол для получения наночастиц на основе белка, который изменяет гидрофобной поверхности в гидрофильные с помощью простого нанесения покрытия распылением. Эти наночастицы получают путем реакции полимеризации алкилсвинца цианоакрилату на поверхности хлопьев белка (глиадина) молекул. Алкил цианакриловый представляет собой мономер, который мгновенно полимеризуется при комнатной температуре при нанесении на поверхность материалов. Его реакция полимеризации инициируется следовых количеств слабощелочных или нуклеофильных частиц на поверхности, в том числе влаги. После того, как полимеризуется, полимеризованные алкил- Cyanoacrylates демонстрируют сильное сродство с объектными материалами, так как нитрильные группы находятся в основной цепи поли (алкил цианоакрилату). Белки также работать в качестве инициатора полимеризации для этого, поскольку они содержат аминогруппы, которые могут инициировать полимеризацию цианоакрилату. Если агрегируется белок используется в качестве инициатора, белковый агрегат окружен гидрофобноеполи (алкил цианакриловый) цепи после реакции полимеризации алкилсвинца цианоакрилату. Контролируя условия эксперимента, частицы в нанометровом диапазоне производятся. Полученные наночастицы легко адсорбироваться на поверхности большинства материалов, включая стекло, металлы, пластмассы, дерева, кожи и тканей. Когда поверхность материала опрыскивают добываемой суспензии наночастиц и промывают водой, мицеллярный структура наночастице изменяет свою конформацию, и гидрофильные белки подвергается воздействию воздуха. В результате, поверхность наночастиц с покрытием изменяется на гидрофильной.
Введение
Цель этой статьи — показать протокол приготовления суспензии наночастиц, который изменяет смачивающие свойства материалов с помощью простого распыления. Представленная суспензия наночастиц изготовлена из алкилцианоакрилата1 и белка злаковых культур глиадина2,3. В процессе изготовления в водном этаноле4 образуются белковые агрегаты. В последующей реакции с мономером (алкилцианоакрилатом) образуется наночастица, состоящая из белкового ядра, окруженного линейными полимерными цепями [поли(алкилцианоакрилат)]5.
Поли(алкилцианоакрилат)s являются биоразлагаемыми и используются для производства наночастиц путем эмульсионной полимеризации6. Эта реакция спонтанно инициируется гидроксильными группами, диссоциированными от воды, или другими нуклеофильными группами в реакционной среде7. В случае реакции, представленной в данной статье, аминогруппы на поверхности белковых агрегатов инициируют реакцию полимеризации мономеров алкилцианоакрилата5,8. В результате этой реакции в реакционной среде образуются наночастицы. Ядром наночастицы являются белковые агрегаты, а внешний слой — поли(алкилцианоакрилатные) цепи (PACA). Полученная наночастица обладает сильным сродством к большинству материалов (точнее, к любому материалу, к которому может адсорбироваться PACA) и прилипает к их поверхности, образуя тонкое покрытие в нанометровом масштабе. Простое напыляемое покрытие мгновенно превращает поверхность материала в гидрофильную.
Глиадин является одной из основных фракций глютена, который находится в эндосперме пшеницы. Глиадины в основном представляют собой мономерные белки с молекулярной массой около 28 000 - 55 000. Нековалентные связи, такие как водородные связи, ионные связи и гидрофобные связи, отвечают за агрегацию глиадинов2. Хотя в этой статье в качестве реагента выбран глиадин, многие другие белки также могут быть использованы для той же цели. Тем не менее, условия реакции должны быть соответствующим образом изменены, поскольку условие для индуцирования агрегации зависит от типа используемого белка8. По сравнению с другими белками, глиадин более доступен, очистка проста, а стоимость производства низкая. Хотя этилцианоакрилат (ЭХА) выбран в качестве мономера для представленной реакции, для той же реакции могут быть использованы и другие алкилцианоакрилаты. Причина выбора ЭХА заключается в том, что он легко доступен по низкой цене.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Обезжиривание Коммерческая Глиадин
- Мера 150 мл ацетона с мерным цилиндром и влить в 250 мл колбу Эрленмейера.
- При перемешивании со спином бар на магнитной мешалке при комнатной температуре, добавляют 30 г коммерческого порошка глиадина. Уплотнение отверстие колбы с алюминиевой фольгой, и держать при перемешивании O / N в капюшоне.
- Фильтрате раствор с помощью фильтровальной бумаги.
- Промывают фильтрат свежим ацетоном (около 50 мл). Данный отстояться в течение 10 мин, чтобы позволить ацетон стечь.
- Перенести фильтрат вместе с фильтровальной бумагой внизу, чтобы большое блюдо, таких как клеточной культуры квадратный блюдо. Накройте все блюдо с большим фильтровальной бумагой, чтобы замедлить испарение остаточного ацетона.
- Разрешить фильтрат полностью высохнуть в капот O / N. Храните обезжиренного глиадина в герметичном контейнере при комнатной температуре.
2. Приготовление Очищенный глиадин
- Мера 150 мл воды промтер с мерным цилиндром и вылить в 1000 мл колбу Эрленмейера.
- Мера 350 мл абсолютного этанола с беспорядком цилиндром и налить в тот же 1000 мл колбу Эрленмейера. Перемешивают энергично (800 - 1000 оборотов в минуту) с перемещаемой бар до тех пор, ни один пузырь не образуется из смеси раствора.
- При перемешивании добавляют 20 г обезжиренной коммерческого порошка глиадина. Добавить глиадина в небольших количествах, в то время, чтобы избежать образования комков, который содержит воздух в середине. Хранить при перемешивании O / N.
- Перенесите весь раствор замарать цилиндра объемом 1000 мл. Дайте постоять в течение двух дней. В течение этого времени, примеси будут осаждаться в нижней части цилиндра.
- Передача супернатант на роторном испарителе с помощью пипетки, и удаления этанола из надосадочной жидкости в максимально возможной степени. По мере того как процент этанола снижается, глиадин появится в растворе в виде совокупности.
- Замораживание раствор, содержащий агрегаты глиадина, погружая / вращающаяся в метаноле/ Сухой лед смеси и подвергают сублимационной высушивают при температуре -70 ° С в вакууме. Перед сублимационной сушки, убедитесь, что весь раствор замораживают без какой-либо жидкости.
Примечание: Лиофилизированный глиадин сформирует пористого твердого вещества. - Измельчите лиофилизированный глиадин с ступки и пестика, и растереть с кофемолке, чтобы получить тонкую мощность (<0,5 мм). Переносят продукт в герметичном контейнере и хранить при комнатной температуре.
3. Полимеризация Реакция ЭКА с глиадина
- Поместите сцинтилляционный флакон (объем составляет около 20 мл) в весовой баланс, и массы тары. Добавить 3,2 г дистиллированной воды и 6,8 г абсолютного этанола в пробирке scitillation.
- Перемещение сцинтилляционный флакон на магнитной мешалкой, поместить магнитную спиновый бар (20 х 3 мм) в пробирку, и размешивают энергично (800 - 1000 оборотов в минуту) до полного удаления пузырьков воздуха не образуется из водной смеси этанола.
- Добавьте 40 мкл 4 н HCl в пробирку при перемешивании. Добавьте 20 мг глиадина во флакон в то время как STI Rring, и продолжают перемешивание до тех пор, глиадин порошок полностью не растворяется в водной смеси этанол.
- Убедившись решение глиадин ясно невооруженным глазом, медленно добавляют 80 - 100 мкл ECA при перемешивании скорость по-прежнему 800 - 1000 оборотов в минуту.
- Снизить скорость перемешивания до 500 оборотов в минуту, и продолжают перемешивание в течение 1 часа. По мере протекания реакции, наблюдать мутность, который указывает, что реакция полимеризации продолжается.
- Когда реакция завершается, Переносят раствор в центрифужные пробирки, и уравновесить вес труб. Центрифуга продукта реакции при 10000 х г в течение 20 мин. В это время, боковые преципитаты продукта и наночастицы остаются в supernantant. Основным компонентом побочного продукта является ППДК гомополимер.
- После того, как центрифугу, выработанную суспензии наночастиц (всплывающую) с помощью пипетки в сцинтилляционный флакон (или любой воздухонепроницаемый контейнер), и хранить его при комнатной температуре.
- Приготовьте 10 г 68% -ного водного раствора этанола, при смешивании 3,2 г воды и 6,8 г абсолютного этанола в 20 мл сцинтилляционный флакон и перемешать до тех пор, ни один пузырь не образуется из смеси раствора.
- Добавьте 40 мкл 4 н соляной кислоты к смеси раствора при перемешивании. Добавляют 50 мкл суспензии наночастиц в приготовленном растворе этанола при перемешивании.
- Измерьте размер наночастиц с динамического рассеяния света (DLS) с использованием раствора образца, полученного выше и следуйте инструкциям изготовителя.
Примечание: Размер конечного продукта должен быть меньше, чем 200 нм. Если он больше, чем 200 нм, продукт не будет стабильным в течение длительного периода времени. Более крупные наночастицы образуются при Занятое ECA не свежие.
5. Рассмотрение продукта
- Приготовьте стеклянную пластинку, такие, как ручное зеркало. Промыть поверхность стеклянной пластины с мыльной водой. рInSe поверхности стеклянной пластины с проточной водой. Сушат очищаемую поверхность или использовать без сушки в течение следующего шага.
- Спрей суспензию наночастиц, полученную в 3,6) на части стеклянной пластины, и смывать поверхность немедленно проточной водой.
- Спрей чистой воды на поверхности стеклянной пластины. Обратите внимание на покрытие (опрыскивают суспензии наночастиц) поверхность удержания воды слой в то время как без покрытия поверхность ясна.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Наночастицы могут быть получены в различных условиях реакции. Глиадин формы агрегировать в широком диапазоне содержания этилового спирта 5. Тем не менее, размер агрегатов должно быть как можно меньше, так как дополнительный слой (то есть., Полимеризованный ИКА) будут добавлены к этой совокупности , и этот процесс будет сделать окончательный размер больше. Если конечный размер частиц слишком велик, то частица будет неустойчив и будет легко осаждаться. Таким образом, 68...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Существует несколько критических этапов в производстве суспензии наночастиц. Если очищенный глиадин содержит примеси, то в результате реакции с ЭХА образуются побочные продукты. Несмотря на то, что эти нежелательные продукты могут быть удалены из реакционной среды на стадии центрифугирования, это снижает выход основного продукта. Если раствор глиадина, приготовленный на экспериментальном этапе (2.3), через двое суток не показывает четкого разделения между надосадочной жидкостью и осадком, то раствор должен выдерживаться ...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Упоминание торговых названий или коммерческих продуктов в данной публикации осуществляется исключительно с целью предоставления конкретной информации и не подразумевает рекомендации или одобрения со стороны Министерства сельского хозяйства США. Министерство сельского хозяйства США является поставщиком равных возможностей и работодателем.
Благодарности
Благодаря г-н Джейсон Adkins для экспертной технической помощи.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Мономер этилцианоакрилата (ЭХА) | K& R International (Laguna Niguel, CA) | I-1605 | Можно использовать любой чистый ECA. |
| Gliadin | MGP Ingredients, Inc (Atchison, KS) | Подарок от компании | Gliadin можно приобрести у Sigma-Aldrich (cat #: G3375-25G). Вместо глиадина любой рекламный ролик Можно использовать глютен. |
| HCl | Любой | : Можно использовать любой реагентный химикат. | |
| Ацетон | любой | : Можно использовать любое химическое вещество класса реагента. | |
| Метанол | Любой | Можно использовать любое химическое вещество класса реагента. | |
| Этанол (100%) | Можно использовать любое | химическое вещество класса реагента. | |
| Фильтровальная бумага | Любая | : Можно использовать фильтровальную бумагу любого сорта размером более 10 см. | |
| Квадратная чашка для клеточных культур | Любая | Можно использовать любую чашку размером более 20 x 20 см. | |
| Кофемолка | Любая | Можно использовать любую кофемолку. | |
| Ротационный испаритель | Любой | Можно использовать любой ротационный испаритель. | |
| Сублимационная сушилка | Любая | сублимационная сушилка, которая может достигать -70 градусов; Можно использовать C. | |
| Центрифуга | Любая | Можно использовать любую центрифугу, которая может наносить 1 000 x g. | |
| Магнитная мешалка | Любая | магнитная мешалка, которая может поворачивать прядильную планку до 1 000 оборотов в минуту. | |
| Динамическое рассеяние света (DLS) | Brookhaven Instruments Corporation | NanoBrook Omni Zeta Potential Analyzer | DLS от любой компании. |
| Сканирующий электронный микроскоп (СЭМ) | Carl Zeiss Inc. | Можно использовать любой SEM. | |
| Динамический угол контакта (DCA) | Инструменты Thermo Cahn Можно | использовать любой DCA. |
Ссылки
- Vauthier, C., Dubernet, C., Fattal, E., Pinto-Alphandary, H., Couvreur, P. Poly(alkylcyanoacrylates) as biodegradable materials for biomedical applications. Adv. Drug Deliver. Rev. 55, 519-548 (2003).
- Wieser, H. Chemistry of gluten proteins. Food Microbiol. 24, 115-119 (2007).
- Bietz, J. A., Wall, J. S. Identity of high molecular weight gliadin and ethanol soluble glutenin subunits of wheat: Relation to gluten structure. Cereal Chem. 57, 415-421 (1980).
- Kim, S. Production of composites by using gliadin as a bonding material. J. Cereal Sci. 54, 168-172 (2011).
- Kim, S., Kim, Y. Production of gliadin-poly(ethyl cyanoacrylate) nanoparticles for hydrophilic coating. J. Nanopart. Res. 16, 1-10 (2014).
- Behan, N., Birkinshaw, C., Clarke, N. Poly n-butyl cyanoacrylate nanoparticles: a mechanistic study of polymerisation and particle formation. Biomaterials. 22, 1335-1344 (2001).
- Nicolas, J., Couvreur, P. Synthesis of poly(alkyl cyanoacrylate)-based colloidal nanomedicines. Wiley Interdiscip. Rev. Nanomed. Nanobiotechnol. 1, 111-127 (2009).
- Kim, S., Evans, K., Biswas, A. Production of BSA-poly(ethyl cyanoacrylate) nanoparticles as a coating material that improves wetting property. Colloid Surface. B. 107, 68-75 (2013).
- Lander, L. M., Siewierski, L. M., Brittain, W. J., Vogler, E. A. A systematic comparison of contact angle methods. Langmuir. 9, 2237-2239 (1993).
- Davies, J., Nunnerley, C. S., Brisley, A. C., Edwards, J. C., Finlayson, S. D. Use of Dynamic Contact Angle Profile Analysis in Studying the Kinetics of Protein Removal from Steel Glass, Polytetrafluoroethylene, Polypropylene, Ethylenepropylene Rubber, and Silicone Surfaces. J. Colloid Interf. Sci. 182, 437-443 (1996).
- Giolando, D. M. Nano-crystals of titanium dioxide in aluminum oxide: A transparent self-cleaning coating applicable to solar energy. Sol. Energy. 97, 195-199 (2013).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
