Муцины — это высокомолекулярные гликоконъюгаты, размер которых варьируется от 0,2 до 200 мегадальтон (MDa). В результате своего размера муцины не проникают в обычные полиакриламидные гели и требуют более крупных пор для разделения. Мы предоставляем подробный протокол электрофореза в агарозном геле муцина для оценки относительной количественной оценки и изучения сборки полимера.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Муцин Электрофорез в агарозном геле: Вестерн блот для высокой молекулярной массой гликопротеинов
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Муцины, что сильно гликозилированные белки, выстилающих поверхности слизистой оболочки, эволюционировали в качестве ключевого компонента врожденной защиты, защищая эпителий от вторжения патогенов. Основная роль этих макромолекул, чтобы облегчить улавливание частиц и зазор, продвигая смазывание слизистой оболочки. В процессе синтеза белков, муцинов претерпевают интенсивную О-гликозилирование и мультимеризацию, что значительно увеличивают массу и размер этих молекул. Эти посттрансляционные модификации являются критически важными для вязкоупругих свойств слизи. В результате сложного биохимического и биофизической природы этих молекул, работая с муцин обеспечивает множество проблем, которые не могут быть преодолены с помощью традиционных методов анализа белков. Например, их высокой молекулярной массы предотвращает электрофоретической миграции через регулярные полиакриламидном геле и их липкая природа вызывает адгезию к экспериментальному НКТ. Однако, исследуя роль муцинах в области здравоохранения(Например., Поддержание целостности слизистых оболочек) и болезни (например., Hyperconcentration, mucostasis, рак) в последнее время приобрел интерес и муцинов исследуются в качестве терапевтической мишени. Лучшее понимание производства и функции макромолекул муцин может привести к новым фармацевтическим подходам, например, ингибиторы муцина экзоцитоза гранул и / или муколитических агентов. Таким образом, последовательные и надежные протоколы для исследования муцин биологии имеют решающее значение для научного прогресса. Здесь мы описываем обычные методы для разделения муцин макромолекул электрофореза в агарозном геле, белка-переносчика в нитроцеллюлозную мембрану, и детектировать сигнал с муцин-специфических антител, а также инфракрасный считыватель флуоресцентный гель. Эти методы широко применяются для определения муцина, мультимеризацию количественный и испытать влияние фармакологических соединений на муцин.
Введение
Муцины обычно получают поверхности слизистых оболочек, выстилающих полости подвергаются воздействию внешней среды (например., Органов дыхания, пищеварения, репродуктивная, поверхности глазного яблока), а также внутренних органов (например, поджелудочной железы, желчного пузыря, молочных желез). Присутствие этих гликопротеинов поддерживает гидратации поверхности и образует физический барьер против патогенов. Несмотря на то, муцин производства имеет важное значение для здоровья слизистых оболочек, муцина hyperconcentration и / или отклоняющиеся свойства слизи может привести к непроходимости протоков, бактериальной колонизации и хроническое воспаление,....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Подготовка буфера для муцин гель Вестерн-блоттинга
- Готовят 1 литр 50x TAE (Трис-ацетат-ЭДТА) буфере.
- В 700 мл дистиллированной воды (дН 2 O) добавляют 242 г трис - основания (0,4 м), 57,1 г ледяной уксусной кислоты (взвешивать жидкость) (0,2 М) и 14,61 г этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) (50 мМ).
- Отрегулируйте рН до 8,0 и сделать объем до 1 л с дН 2 O.
- Приготовьте 10 мл 10-кратного буфера для загрузки.
- Приготовьте 5 мл буфера 1х ТАЕ. Для этого добавляют 5 мл глицерина (50%), 25 мг бромофенолового синего (0,25%), и 100 мг додецилсульфата натрия (SDS) (1%).
- По....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Мы показываем репрезентативные результаты муцина экспрессии после электрофореза в агарозном геле в БАЛ из легких мышей (рисунок 1). В этом примере мы использовали агарозный гель, чтобы показать положительную регуляцию муцина производства следующих IL-13 обработки мышиной модели Тд-Muc5ac. Вестерн - блот показывает визуальное представление муцина выражение, которое может быть использовано для количественного анализа мультимеру или интенсивности сигнала полосы мономера
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Протокол муцина Вестерн - блоттинга , описанного в этом видео сочетает в себе традиционные методы , используемые в молекулярной биологии для разделения и передачи больших макромолекулы, такие как ДНК, с регулярными методами для обнаружения белка, то есть., Иммуноблоттинга. Тот же метод может быть применен для изучения биологии сложных гликозаминогликанов, например, при пробое сверхвысокой молекулярной массы гиалуроновой кислоты 18. Хотя этот метод может быть использован в широком спектре анализов, ус.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют никакого конфликта раскрывать.
Благодарности
Авторы хотели бы выразить признательность доктору Джону Шихану и доктору Любне Абдулле за их руководство и наставничество, которые сыграли центральную роль в завершении этой работы. Эта работа была поддержана Национальным институтом здравоохранения (P01HL108808, UH2HL123645) и Фондом муковисцидоза Therapeutics, Inc. (EHRE07XX0). Кэтрин Рэмси получает стипендию NHMRC для исследований в области ранней карьеры.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Tris Base | Sigma | T6060-1кг | 1 кг |
| Ледяная уксусная кислота | Sigma | ARK2183-1L | 1 л |
| EDTA | Sigma | EDS-100 | г 100 г |
| Глицерин | Fisher | BP229-1 | 1 л |
| Бромофенол Blue Sigma | 114391-5 г | г | |
| SDS (додецилсульфат натрия) | Sigma | L6026-50 г | 50 г |
| 20x SSC (цитрат натрия) Буфер | Promega | V4261 | 1 л |
| NaCl | Fisher | S271-1 | 1 кг |
| тринатрия цитрат (Na3C6H5O7) | Sigma | W302600-1кг | 1 кг |
| 10 мМ DTT (дитиотреитол) | Sigma | D0632 | 25 г |
| Сухое молоко | Saco | Быстрорастворимое обезжиренное сухое молоко | |
| Дульбекко Фосфат Буферизованный физиологический раствор (D-PBS) | Gibco lifetechnologies | 14200-025 | 500 мл |
| Первичные антитела против GFP козы (образцы мышей) | Антитела и анализы Rockland | 600-101-215 | 1 мг |
| UNC 222 Первичные антитела кролика Anti-Muc5b (образцы мышей) | UNC | ||
| H300 Первичные антитела к MUC5B (образцы для человека) | Santa Cruz | sc-20119 | 200 μ g |
| 45M1 Anti-MUC5AC Первичные антитела (образцы человека) | Abcam | ab3649 | 100 μ g |
| Donkey Anti-rabbit 800CW IR Dye | LI-COR Biosciences | 926-32213 | 0,5 мг |
| Donkey Anti-mouse 680LT IR Dye | LI-COR Biosciences | 926-68022 | 0,5 мг |
| Электрофорез Гелевая коробка и литейный поддон | Системы | ||
| Коробка питания | Biorad | Model 200/20 | |
| Мембранная промокательная бумага | Amersham | 10600016 | |
| Ватман Бумага и нитроцеллюлозная мембрана | GE | 10 439 196 | |
| Boekel/Appligene Вакуумный блоттер 230 V | Expotech США | 230600-2 | |
| Odyssey Инфракрасная флуоресцентная система | LI-COR Biosciences |
Ссылки
- Henderson, A. G., et al. Cystic fibrosis airway secretions exhibit mucin hyperconcentration and increased osmotic pressure. J Clin Invest. 124 (7), 3047-3060 (2014).
- Preciado, D., et al. MUC5B Is the predominant mucin glycoprotei....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
