Методическая статья

Улучшенная техника швейцарско-прокатка для Кишечные Подготовка ткани для иммуногистохимического и иммунофлуоресцентного анализов

DOI:

10.3791/54161

⸱

13 июля 2016 г.

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, Stony Brook University School of Medicine, 2Department of Physiology & Biophysics, Stony Brook University School of Medicine

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Точная идентификация и расположение эпителиальных клеток вдоль кишечной слизистой оболочки имеют важное значение для определения различных клеточных клонов. Правильная визуализация кишечных тканей имеет решающее значение для идентификации паттернов экспрессии белка с максимальным разрешением. Это исследование направлено на очертить оптимальные методы и условия для обработки мыши кишечных тканей.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Важно понимать роль факторов, регулирующих гомеостаз эпителиального кишечника и реакцию на повреждение и регенерацию. В современной литературе описывается несколько различных методологических подходов к получению изображений тканей кишечника для проверки данных. В этой статье мы описываем общий протокол, относящийся к получению и обработке тканей кишечника мыши. Обсуждается правильная фиксация тканей кишечника и методики Swiss-roll, улучшающие морфологию эпителия кишечника. Пострезекционная обработка и переориентация внедренных кишечных тканей имеют решающее значение для получения залитых парафином блоков, которые демонстрируют неповрежденные структурные особенности кишечника после разреза. Техника вальцовки по швейцарской системе помогает в гистологической оценке исследуемых участков кишечника или толстой кишки целиком. Способность дифференцировать структурные особенности кишечника может иметь жизненно важное значение при количественном измерении воспаления кишечника и онкогенеза по всей длине. Наконец, срезы с парафином идеально подходят для надежной обработки с использованием как иммуногистохимических, так и иммунофлуоресцентных методов обнаружения. Нефлуоресцентные иммуногистохимические срезы обеспечивают яркое изображение ткани с детализацией различных клеточных структурных особенностей, но не обеспечивают гибкости для экспериментов по внутриклеточной колокализации. Несколько флуоресцентных каналов могут быть надлежащим образом использованы с иммунофлуоресцентным детектированием для экспериментов по колокализации, что способствует механистическим исследованиям.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эпителий кишечника млекопитающего содержит единственный слой столбчатых клеток. В тонкой кишке, пролиферативные клетки ограничены крипт в то время как дифференцированные клетки занимают область ворсинок. Тем не менее, так как нет ворсинки в толстой кишке, пролиферативные клетки локализуются в нижней части крипт и дифференцированные клетки занимают верхнюю область крипт. Кишечный эпителий претерпевает быстрое пополнение (около 3 - 5 дней), который приводится в движение непрерывным делением пролиферативных клеток в криптах. В пролиферативные клетки крипт не являются однородной популяции и подразделяются на стволовые клетки и транзитные-амплификации (TA) клеток 1.<....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Мыши

  1. Все исследования с участием мышей были утверждены Институциональный уходу и использованию животных комитета Stony Brook University (IACUC) путем. Мышей содержали в цикле свет-темнота 12:12 час.
    1. Коммерчески получить мышей C57BL / 6. Получить C57BL / 6 мышей , несущих аллели Klf5 фланкированные сайтов LoxP (Klf5 е л / ф л). Эти мыши были описаны ранее 21 и любезно предоставленные доктором Ryozo Нагаи.
  2. Приобретение / 6 мышей C57BL, несущие ген индуцибельной Cre рекомбиназы под регуляции промотора Lgr5 (Lgr5-EGFP / CreERT2 мышей).
  3. ....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Швейцарская техника качению в сочетании с иммуногистохимического окрашивания позволяет для всестороннего анализа тонкой или толстой ткани кишечника. Пример H & E окрашивания в толстой кишке о наличии C57BL / 6 мыши (рисунок 1) является иллюстрацией целесообразности и эффективности этого метода. Как показано на рисунке 1, изображение может захватывать все части толстой кишки: проксимальный, средний и дистальный. Таким образом, это позволяет комплексно.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Прокатный техника Швейцарский является мощным способом получения кишечной ткани для гистологического и морфологической оценки в крупных масштабах. В отличие от ранее описанной швейцарской прокатной техники, которая первоначально была разработана для приготовления замороженных срезов 18,19, процедура представлена ​​здесь позволяет быстрое приготовление ткани кишечника и фиксации для фиксации формалином и парафин (FFPE). По сравнению с замороженной ткани, FFPE ткань имеет гораздо более длительный срок хранения .......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы хотели бы поблагодарить Айнару Руис де Сабандо за предоставленные изображения H&E. Эта работа была поддержана грантами Национальных институтов здравоохранения (DK052230, DK093680 и CA172113), предоставленными доктору Винсенту В. Янгу.

....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Наборы для препарирования из нержавеющей сталиVWR25640-002
Камера для демаскировкиBiocare MedicalDC2012
Шприц 10 млVWR89215-218
Swingsette Кассета для встраивания/обработки тканей с крышкойSimportM515
Superfrost Plus Slides [размер: 25 x 75 x 1 мм]VWR48311-703
Набор для окрашивания гороквручную Tissue-Tek/Sakura4451
Тарелка для окрашивания зеленойсалфетки-Tek/Sakura4456
Тарелка для окрашивания Белаясалфетка-Tek/Сакура4457
Держатель слайдов с 24 горками со съемной ручкойTissue-Tek/Sakura4465
ДуховкаThermo Scientific6243для запекания горок под углом 65 градусов
Диссекционный микроскопZeissStemi 2000C
Флуоресцентный микроскопNikon Eclipse90iЯркий и флуоресцентный свет, с объективами: 10X, 20X
PAP Pen Super-Liquid Blocker MiniFisher ScientificDAI-PAP-S-M
Этанол 200 proofAAPR111000200
MethanolVWRBDH1135-4LP
Ледяная уксусная кислотаAAPR281000ACS
КсилолFisher ScientificX5P-1GAL
Перекись водорода 25% раствор в водеACROS202465000
10% буферированный формалинFisher Scientific22-026-213
Бычья сыворотка фракция V, тепловой шокRoche3116956001
Tween 20Sigma AldrichP7949
Цитрат натрияFisher ScientificS279
Gavage иглаVWR20068-624
Rabbit anti Klf5 антителоSanta Cruz Biotechnologysc-22797Разведение 1:150
Курица против EGFP антителоMilliporeAB16901Разведение 1:500
Rabbit anti Ki67 антителоBiocare MedicalCRM325BDilution 1:500
Mach3 rabbit AP полимерный набор для обнаружения полимеровBiocare MedicalM3R533L
Warp красный хромогеннабор BiocareMedical WR806 H
Lgr5-EGFP/CreERT2 мыши Лаборатории Джексона008875 
Автоматизированный процессорLeicaLeica TP1020

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. van der Flier, L. G., Clevers, H. Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium. Annu Rev Physiol. 71, 241-260 (2009).
  2. Bjerknes, M., Cheng, H. Methods for the isolation of intact epithelium from the mouse intestine. Anat Rec. ....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи