Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Улучшенная техника швейцарско-прокатка для Кишечные Подготовка ткани для иммуногистохимического и иммунофлуоресцентного анализов

72.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54161

⸱

13 июля 2016 г.

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, Stony Brook University School of Medicine, 2Department of Physiology & Biophysics, Stony Brook University School of Medicine

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Точная идентификация и расположение эпителиальных клеток вдоль кишечной слизистой оболочки имеют важное значение для определения различных клеточных клонов. Правильная визуализация кишечных тканей имеет решающее значение для идентификации паттернов экспрессии белка с максимальным разрешением. Это исследование направлено на очертить оптимальные методы и условия для обработки мыши кишечных тканей.

Аннотация

Важно понимать роль факторов, регулирующих гомеостаз эпителиального кишечника и реакцию на повреждение и регенерацию. В современной литературе описывается несколько различных методологических подходов к получению изображений тканей кишечника для проверки данных. В этой статье мы описываем общий протокол, относящийся к получению и обработке тканей кишечника мыши. Обсуждается правильная фиксация тканей кишечника и методики Swiss-roll, улучшающие морфологию эпителия кишечника. Пострезекционная обработка и переориентация внедренных кишечных тканей имеют решающее значение для получения залитых парафином блоков, которые демонстрируют неповрежденные структурные особенности кишечника после разреза. Техника вальцовки по швейцарской системе помогает в гистологической оценке исследуемых участков кишечника или толстой кишки целиком. Способность дифференцировать структурные особенности кишечника может иметь жизненно важное значение при количественном измерении воспаления кишечника и онкогенеза по всей длине. Наконец, срезы с парафином идеально подходят для надежной обработки с использованием как иммуногистохимических, так и иммунофлуоресцентных методов обнаружения. Нефлуоресцентные иммуногистохимические срезы обеспечивают яркое изображение ткани с детализацией различных клеточных структурных особенностей, но не обеспечивают гибкости для экспериментов по внутриклеточной колокализации. Несколько флуоресцентных каналов могут быть надлежащим образом использованы с иммунофлуоресцентным детектированием для экспериментов по колокализации, что способствует механистическим исследованиям.

Введение

Эпителий кишечника млекопитающего содержит единственный слой столбчатых клеток. В тонкой кишке, пролиферативные клетки ограничены крипт в то время как дифференцированные клетки занимают область ворсинок. Тем не менее, так как нет ворсинки в толстой кишке, пролиферативные клетки локализуются в нижней части крипт и дифференцированные клетки занимают верхнюю область крипт. Кишечный эпителий претерпевает быстрое пополнение (около 3 - 5 дней), который приводится в движение непрерывным делением пролиферативных клеток в криптах. В пролиферативные клетки крипт не являются однородной популяции и подразделяются на стволовые клетки и транзитные-амплификации (TA) клеток 1. Стволовые клетки находятся в нижней части крипты, в течение первых 4 -х - 5 клеток от самого дна 2. Текущая модель поддерживает существование двух типов стволовых клеток: крипт база столбчатый (CBC) стволовых клеток и резервных покоящихся стволовых клеток. CBC sПЭМ клетки активно пролиферирующих и отмечены лейцин-богатый повтор содержащий G-белком рецептор 5 (Lgr5) 3, Olfactomedin 4 (Olfm4) 4 и Achaete щитка-как 2 (Ascl2) 5. С другой стороны, резервные покоящиеся стволовые клетки помечены B специфичного для клеток мышей Молони интеграции сайта вируса лейкоза 1 (Bmi1) 6, мыши теломеразной обратной транскриптазы (mTert) 7, хмель Гомеобоксный (Hopx) 8, даблкортин-Как и САМ - киназа -Как 1 (Dclk1) 9, и лейцин-Rich повторами и иммуноглобулин-подобных доменов 1 (Lrig1) 10. Активно пролиферирующие стволовые клетки дают начало клеткам TA затем подвергаются дальнейшей дифференциации в абсорбирующих клеток (энтероцитов) и секреторных клеток (энтероэндокринные, бокаловидных, Панет и хохолка клетки). Непрерывное деление клеток в пролиферативной зоне приводит к движению вверх эпителиальных клеток вдоль оси крипта-ворсинок, пока они не достигают вершины ворсинок, где они подвергаются апоптозу и являютсяотшелушиваются с поверхности эпителия. Различные типы эпителиальных клеток кишечника отмечены экспрессии различных белков (например, бокаловидных клеток тонкого кишечника могут быть признаны окрашиванием антителами против Muc2 и Paneth клеток с антителами против лизоцима). Мы изучаем роль Kruppel-подобных факторов (KLFs) в гомеостаза и патобиологии кишечного эпителия 11-13. Результаты , представленные здесь , поддерживая возможности модифицированного метода швейцарской прокатки основаны на предыдущих исследованиях роли Kruppel-подобный фактор 5 (KLF5) в поддержании в активно пролиферирующих эпителия кишечника стволовых клеток 14. KLF5 является фактором транскрипции цинковых пальцев , который высоко выражается в активной кишечной стволовых и клеток TA 12. Предыдущие исследования показали, что KLF5 совместно выражены с Ki-67, известного пролиферативного маркера в криптах кишечника.

Желудочно-кишечного тракта тр акт не является структурно или функционально однородная ткань. Тонкий кишечник делится на двенадцатиперстную кишку, тощую кишку и подвздошную кишку и толстую кишку в слепую кишку и толстую кишку, причем последний дополнительно разделен на проксимальном, средней и дистальной части. Каждый из этих разделов имеет уникальные гистологические особенности и играет различные роли 15. Таким образом , эффекты инсультов и степень реакции на кишечный эпителий может зависеть от области исследуемой ткани 16. Кроме того, различные штаммы мышей демонстрируют разнообразие реакции на гистологическом уровне , основанного на типе инсульта , используемого в исследованиях 16. Таким образом, подобающую препарата ткани необходимо, чтобы обеспечить соответствующее гистологических и молекулярный анализ кишечных тканей. Таким образом, швейцарский ролл анализ методика грантов полной длины кишечного эпителия в одно время и, таким образом, удостоверяется обоснованные выводы на основе полной информации.

e_content "> Техника швейцарско-н - ролл был впервые упомянут Магнусом 17, и подробно описал Moolenbeck и Ruitenberg и Парк и др. , как способ получения тканей и выполнения гистологического анализа грызуна кишечника 18,19, соответственно. Протокола очерчены в данной публикации, представляет собой улучшенную версию оригинального метода, который позволяет для своевременной и надежной подготовки тканей для диагностических целей. Эта модифицированная методика позволяет эффективно коллекций и подготовки кишечного эпителия универсально используемых методов, таких как иммуногистохимии, иммунофлюоресценции, а также как (флуоресцентных и хромогенного 20) в месте гибридизации. Кроме того, модифицированная ткань образец способа получения использует легко доступные и относительно недорогие реагенты, предлагая метод быстрой фиксации тканей и позволяет для извлечения белка, ДНК и РНК для дополнительной оценки. Взятые вместе, Тхиs метод отлично подходит для комплексной оценки гистологических, патологических и молекулярных особенностей кишечного эпителия.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Мыши

  1. Все исследования с участием мышей были утверждены Институциональный уходу и использованию животных комитета Stony Brook University (IACUC) путем. Мышей содержали в цикле свет-темнота 12:12 час.
    1. Коммерчески получить мышей C57BL / 6. Получить C57BL / 6 мышей , несущих аллели Klf5 фланкированные сайтов LoxP (Klf5 е л / ф л). Эти мыши были описаны ранее 21 и любезно предоставленные доктором Ryozo Нагаи.
  2. Приобретение / 6 мышей C57BL, несущие ген индуцибельной Cre рекомбиназы под регуляции промотора Lgr5 (Lgr5-EGFP / CreERT2 мышей).
  3. Для установления Lgr5-EGFP / Creer T2 / Klf5 F L / F L мышей, пересекают Klf5 фл / F L мышей с Lgr5-EGFP мышей / Creer Т2 , а затем обратного скрещивания потомство к Klf5 фл / F L мышей.
  4. Лечить мышей с тамоксифеном согласно протоколу описано ранее 22. Вводят 8-недельных экспериментальных и контрольных мышей внутрибрюшинно (IP) с 1 мг тамоксифена (10 мг / мл), растворенного в стерильном кукурузном масле, в течение 5 дней подряд.
  5. На 14 -й день после первой инъекции тамоксифена, пожертвуйте мышей с использованием СО 2 удушья, помещая их в камеру , соединенную с CO 2 источника газа. Дайте поток газа в камеру до тех пор, пока мыши находятся в бессознательном состоянии, и все движение прекращается. Для обеспечения эвтаназии выполнять шейки дислокации.

2. Подготовка ткани и швейцарской Роллинг

  1. Использование рассечение пинцет и ножницы, вырезать надрез в коже брюшной стороны. С парой щипцов, держать кожу в разрез и осторожно потяните в сторону от брюшной мышечной ткани. Используйте пару ножниц, чтобы разрезать брюшную кожу и подвергать мышцы живота.
  2. Удержание и подтянуть Пеritoneum с пинцетом. Убедитесь в том, чтобы не быть проведение и потянув на кишечнике. Осторожно сделать надрез в брюшную ткани и продолжают срезая кожу подвергать мышцы живота. Тщательно надрезать мышцы живота и продолжают сокращать их прочь выставить кишечник.
  3. Определение толстой кишки и трассировки к дальнему концу, где он соединяется в прямую кишку / задний проход. С ножницами, вырезать как можно ближе к анальное отверстие, как это возможно.
  4. Определить желудок и проследить, где она соединяется с тонкой кишки. С парой ножниц, освободи кишечник около 1 см от живота. Перенесите всю длину освобожденного тонкой кишки и толстой кишки в чистую чашку Петри, содержащую фосфатно-солевой буфер (PBS).
  5. С одной стороны, или парой щипцов, удерживая дистальный конец толстой кишки и использовать другую руку, чтобы аккуратно распутать всю длину толстой кишки из любого брыжеечной соединительной и / или жировой ткани.
  6. Определить слепой кишки(Маленький мешочек между тонкой и толстой кишки) и разрезают, где слепая кишка и двоеточие Join (проксимальный конец толстой кишки), чтобы освободить прямую кишку.
  7. С одной стороны, или парой щипцов, держать тонкую кишку и использовать другую руку, чтобы аккуратно распутать всю длину тонкой кишки из любого брыжеечной соединительной и / или жировой ткани. Срежьте слепая кишка и выбросить, если нет необходимости в этом.
    Примечание: Этот процесс может быть остановлен здесь путем инкубирования отсекают кишок в модифицированном фиксаторе Буэна (50% этанол / 5% уксусной кислоты в дН 2 O) в течение ночи и продолжить процедуру на следующий день.
  8. Обработка одного сегмента кишечника (тонкой кишки или толстой кишки), заполнить 10-мл шприц с фиксатором модифицированную Буэна и прикрепить иглу через зонд к нему. Вставьте иглу около половины сантиметра в переднем открытии кишечного сегмента.
  9. Удерживая иглу через зонд внутри кишечного сегмента, применяя сильное давление с помощью приборана кишечный сегмент. С другой стороны, проведение шприц, нежный, но постоянное давление, чтобы очистить содержимое сегмента кишечника с использованием закрепитель модифицированную Буэна. Этот шаг позволяет одновременную чистку кишечника сегмента и немедленной фиксации. Используйте чашку Петри для сбора отходов проточный. Фиксацию можно наблюдать по цвету толстой кишки поворота непрозрачным.
    Примечание: Убедитесь в том, чтобы не применять слишком большое давление при промывке или кишечный сегмент может распахнулась.
  10. С помощью ножниц разрезали кишечного сегмента продольно вдоль линии брыжейки. Держите его с парой щипцов и промойте его на короткое время в чашку Петри, содержащую PBS.
    1. Отрежьте тонкую кишку на 3 равные части: проксимальной, средней и дистальной. Проксимальный сегмент является одним сразу после желудка, и дистальный сегмент является одним непосредственно перед двоеточием. Проксимальный сегмент эквивалентен двенадцатиперстную кишку, в середине к тощей кишке, и дистальнееподвздошной кишки.
    2. Для каждого сегмента отмечают проксимальный и дистальный конец. Проксимальный конец является тот, который первоначально был направлен в сторону желудка, и дистальный указал на толстой кишке.
  11. Используйте в верхней части чашки Петри поместить очищенный и открытый кишечный сегмент. Поместите кишечный сегмент с полостную стороной вверх.
    1. Для толстой кишки, определить люминальную сторону по variegations / гребнями, работающих по ширине и присутствуют на проксимальном конце. В середине и дистальных отделах имеют некоторые variegations, которые работают в продольном направлении. Для тонкой кишки, определить люминальную сторону по шероховатой поверхности появляются, знаменующий ворсинки.
      Примечание: Для тонкой кишки, нет никаких внешних макроскопического анатомического демаркация проксимальных, средних и дистальных отделах. Однако эти области можно можно идентифицированный в разделах под микроскопом. Ворсинок являются самыми длинными в проксимальной области и постепенно становятся короче дистально, где они находятсясамый короткий в длину. Микроскопически, крипт ободочной кишки являются кратчайшим в проксимальной области, которые также могут быть идентифицированы по наличию гребней. Крипт ободочной кишки являются самым высоким в средней части и короче в дистальной области пока еще выше, чем в проксимальной области.
  12. Продолжайте швейцарским крученым двоеточие:
    1. Держите двоеточие плоские открытые и вытащить его пинцетом от его проксимального конца к краю чашки Петри.
    2. Держите люминальную стороной вверх и удерживать проксимальный конец с пинцетом с одной стороны, и с другой стороны провести зубочисткой.
    3. Заверните края проксимального конца вокруг зубочистки с помощью пинцета и слегка ущипнуть, обернутый край против зубочистку, чтобы удерживать его на месте.
    4. Аккуратно и медленно начать прокатки зубочистку с пальцами, чтобы бросить толстой кишки вокруг зубочисткой, чтобы сформировать рулет.
    5. После того, как по всей длине толстой кишки был свернут, используйте пару щипцов, чтобы аккуратно вставьте грOlon рулет от зубочисткой и в ткани обработки / -вложением кассеты. Поместите кассету в 10% забуференном формалине в течение ночи при комнатной температуре.
  13. Продолжайте швейцарской прокатки тонкой кишки:
    1. Обработка одного сегмента в то время, держать сегмент плоские открытые с полостной стороной вверх и потяните его с пинцетом от его проксимального конца к краю чашки Петри.
    2. Продолжить со швейцарским прокатке, как описано для толстой кишки.
  14. Продолжить с обработкой фиксированных формалином тканей для парафин. Выполните следующие действия:
    Примечание: Используйте автоматизированный процессор (см материалы и оборудование для получения подробных сведений).
    1. В то время как ткань находится в кассете, промойте ткань с PBS до тех пор, пока фиксатор полностью удаляется.
    2. Высушить ткани с использованием этанола в следующей последовательности: 50% этаноле в течение 10 мин, 70% этаноле в течение 10 мин, 80% этаноле в течение 10 мин, 95% этаноле в течение 10 мин, 100% этаноле в течение 10 мин, 100% этаноле в течение 10 мин , и 100% этаноле в течение 10 мин.
    3. Обмен этанола с ксилолом в следующей последовательности: 2: 1 этанол: ксилол в течение 10 - 15 мин, 1: 1 этанол: ксилол в течение 10 - 15 мин, 1: 2 этанол: ксилол в течение 10 - 15 мин, 100% ксилола в течение 10 - 15 мин, 100% ксилола в течение 10 - 15 мин, и 100% ксилола в течение 10 - 15 мин. ВНИМАНИЕ: Ксилол представляет опасность для здоровья, таким образом, рабочее место должно быть оборудовано местной вытяжной вентиляцией с соответствующим капотом и надлежащего защитного оборудования должен быть несл персоналом.
    4. Обмен ксилола с парафином. Выполните следующие действия в вакуумной печи в течение 54 - 58 ° C: 2: 1 ксилол: парафин в течение 30 мин, 1: 1 ксилол: парафин в течение 30 мин, 1: 2 ксилол: парафин в течение 30 мин, 100% парафина для 1 - 2 ч, а 100% парафина в течение 1 - 2 ч или в течение ночи.
      Примечание: Не дайте парафина превышать 60 ° С в течение длительных периодов времени, так как это может привести к разрушению парафиновых полимеров и сделать его твердым и хрупким.
    5. Вставить в свежей новой парафином и сориентировать ткани, как дехряков до того, как парафин затвердевает. Для рулетов, следуя paraffinization ткани, важно, чтобы изменить положение каждый рулон на его стороне во время парафин. Это гарантирует, что во время резки, участки по всей длине каждого рулона будет производиться.
  15. Для окрашивания, вырезать толстые секции 5 мкм с использованием микротома. Соберите разделы на заряженные слайды и высушить их (отжигом) в 65 ° С печи в течение ночи; дайте остыть до комнатной температуры, а затем использовали их для окрашивания.
    Примечание: Время выпечки может быть сокращен до 1 - 2 часа в зависимости от того, как свежесрезанных слайды. Если менее чем через месяц после секционирования, то желательно, чтобы испечь в течение ночи. Если прошло больше месяца, а затем 1 - 2 ч выпечки достаточно, чтобы сэкономить время. Если время истекает, в течение ночи поддержка всегда можно использовать.

3. Анализ Гистологические и Иммунофлуоресценции Окрашивание

Выполните гистологический анализ и immunofluценции окрашивания , как описано выше 23,24, с некоторыми изменениями. Для получения белка усиливается зеленый флуоресцентный (EGFP) иммунофлюоресценции:

  1. Выпечка слайдов в 65 ° C печи в течение 1 ч, чтобы инактивировать эндогенный активность щелочной фосфатазы и впоследствии deparaffinize в ксилоле.
  2. Инкубируйте секций в ванне 3% -ной перекиси водорода в метаноле, чтобы блокировать пероксидаз эндогенные ткани; затем регидратации путем инкубации в серии убывающий спирта ванны (100%, 95%, 70%) с последующим извлечением антигена в цитратном буферном растворе (10 мМ цитрат натрия, 0,05% Tween-20, рН 6,0) при 125 ° С в течение 10 мин используя decloaking камеру.
  3. Обведите срезах ткани с помощью маркировки перо, которое обеспечивает гидрофобный барьер и инкубировать секций с блокирующим буфером (2,5% бычьего альбумина [БСА] в сыворотке в TBS-Tween) в течение 30 мин при температуре 37 ° С и затем с первичным антителом против EGFP (разведение 1 : 500) при 4 ° с в течение ночи во влажной камере при встряхивании осторожно.
  4. Промыть секции и инкубировать с флуоресцентно меченый вторичными антителами в соответствующей концентрации в течение 30 мин при 37 ° С.
  5. Вымойте слайды после вторичной очистки антител и окраски ядер с Hoechst и смонтировать с монтажными средствами массовой информации.
    1. Для Klf5 / EGFP / Ki-67 совместного окрашивания, процесс горок, как описано в пунктах 3.1 - 3.3 и выполнить Klf5 окрашивание путем инкубации с Klf5 антителом (разведение 1: 150) в течение ночи.
    2. Применить кролика обнаружения полимера AP к слайдам согласно протоколу.
    3. Reveal Klf4 окрашивания с использованием хромогенного иммуногистохимического окрашивания в соответствии с протоколом производителя.
    4. Выполните антитела элюирование с использованием ранее описанной протокола 25. Инкубируйте слайды при 50 ° C в глицин-ДСН (рН 2,0), раствор при перемешивании в течение 1 часа.
    5. Промыть тщательно сползает с дистиллированной водой и инкубировать с блокирующим буфером (2,5% бычьего сывороточного альбумина в TBS-Tween) в течение 30 мин при 37 ° С.
    6. Добавить Ki-67 (разведение 1: 500) и EGFP (разведение 1:500) антител одновременно и инкубировать при 37 ° С в течение 1 часа.
    7. Выполните флуоресцентной детекции с соответствующими вторичными антителами перед тем окрашиванием Hoechst (данные не показаны) и монтировать с монтажной средой.
  6. Заметим , гистологическую морфологию тканей мечение клеток 5 мкм секций с гематоксилином и эозином (H & E) , 26. Для люминесцентных изображений используйте длину волны излучения 535, 646 и 700 визуализировать EGFP, Klf5 и Ki-67 окрашивание соответственно.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Швейцарская техника качению в сочетании с иммуногистохимического окрашивания позволяет для всестороннего анализа тонкой или толстой ткани кишечника. Пример H & E окрашивания в толстой кишке о наличии C57BL / 6 мыши (рисунок 1) является иллюстрацией целесообразности и эффективности этого метода. Как показано на рисунке 1, изображение может захватывать все части толстой кишки: проксимальный, средний и дистальный. Таким образом, это позволяет комплексно...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Прокатный техника Швейцарский является мощным способом получения кишечной ткани для гистологического и морфологической оценки в крупных масштабах. В отличие от ранее описанной швейцарской прокатной техники, которая первоначально была разработана для приготовления замороженных срезов 18,19, процедура представлена ​​здесь позволяет быстрое приготовление ткани кишечника и фиксации для фиксации формалином и парафин (FFPE). По сравнению с замороженной ткани, FFPE ткань имеет гораздо более длительный срок хранения ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить Айнару Руис де Сабандо за предоставленные изображения H&E. Эта работа была поддержана грантами Национальных институтов здравоохранения (DK052230, DK093680 и CA172113), предоставленными доктору Винсенту В. Янгу.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Наборы для препарирования из нержавеющей сталиVWR25640-002
Камера для демаскировкиBiocare MedicalDC2012
Шприц 10 млVWR89215-218
Swingsette Кассета для встраивания/обработки тканей с крышкойSimportM515
Superfrost Plus Slides [размер: 25 x 75 x 1 мм]VWR48311-703
Набор для окрашивания гороквручную Tissue-Tek/Sakura4451
Тарелка для окрашивания зеленойсалфетки-Tek/Sakura4456
Тарелка для окрашивания Белаясалфетка-Tek/Сакура4457
Держатель слайдов с 24 горками со съемной ручкойTissue-Tek/Sakura4465
ДуховкаThermo Scientific6243для запекания горок под углом 65 градусов
Диссекционный микроскопZeissStemi 2000C
Флуоресцентный микроскопNikon Eclipse90iЯркий и флуоресцентный свет, с объективами: 10X, 20X
PAP Pen Super-Liquid Blocker MiniFisher ScientificDAI-PAP-S-M
Этанол 200 proofAAPR111000200
MethanolVWRBDH1135-4LP
Ледяная уксусная кислотаAAPR281000ACS
КсилолFisher ScientificX5P-1GAL
Перекись водорода 25% раствор в водеACROS202465000
10% буферированный формалинFisher Scientific22-026-213
Бычья сыворотка фракция V, тепловой шокRoche3116956001
Tween 20Sigma AldrichP7949
Цитрат натрияFisher ScientificS279
Gavage иглаVWR20068-624
Rabbit anti Klf5 антителоSanta Cruz Biotechnologysc-22797Разведение 1:150
Курица против EGFP антителоMilliporeAB16901Разведение 1:500
Rabbit anti Ki67 антителоBiocare MedicalCRM325BDilution 1:500
Mach3 rabbit AP полимерный набор для обнаружения полимеровBiocare MedicalM3R533L
Warp красный хромогеннабор BiocareMedical WR806 H
Lgr5-EGFP/CreERT2 мыши Лаборатории Джексона008875 
Автоматизированный процессорLeicaLeica TP1020

Ссылки

  1. van der Flier, L. G., Clevers, H. Stem cells, self-renewal, and differentiation in the intestinal epithelium. Annu Rev Physiol. 71, 241-260 (2009).
  2. Bjerknes, M., Cheng, H. Methods for the isolation of intact epithelium from the mouse intestine. Anat Rec. 199, 565-574 (1981).
  3. Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449 (7165), 1003-1007 (2007).
  4. van der Flier, L. G., Haegebarth, A., Stange, D. E., van de Wetering, M., Clevers, H. OLFM4 is a robust marker for stem cells in human intestine and marks a subset of colorectal cancer cells. Gastroenterology. 137 (1), 15-17 (2009).
  5. van der Flier, L. G., et al. Transcription factor achaete scute-like 2 controls intestinal stem cell fate. Cell. 136 (5), 903-912 (2009).
  6. Sangiorgi, E., Capecchi, M. R. Bmi1 is expressed in vivo in intestinal stem cells. Nat Genet. 40 (7), 915-920 (2008).
  7. Montgomery, R. K., et al. Mouse telomerase reverse transcriptase (mTert) expression marks slowly cycling intestinal stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (1), 179-184 (2011).
  8. Takeda, N., et al. Interconversion between intestinal stem cell populations in distinct niches. Science. 334 (6061), 1420-1424 (2011).
  9. May, R., et al. Identification of a novel putative gastrointestinal stem cell and adenoma stem cell marker, doublecortin and CaM kinase-like-1, following radiation injury and in adenomatous polyposis coli/multiple intestinal neoplasia mice. Stem Cells. 26 (3), 630-637 (2008).
  10. Powell, A. E., et al. The pan-ErbB negative regulator Lrig1 is an intestinal stem cell marker that functions as a tumor suppressor. Cell. 149 (1), 146-158 (2012).
  11. Pearson, R., Fleetwood, J., Eaton, S., Crossley, M., Bao, S. Kruppel-like transcription factors: a functional family. Int J Biochem Cell Biol. 40 (10), 1996-2001 (2008).
  12. McConnell, B. B., Yang, V. W. Mammalian Kruppel-like factors in health and diseases. Physiol Rev. 90 (4), 1337-1381 (2010).
  13. McConnell, B. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. The diverse functions of Kruppel-like factors 4 and 5 in epithelial biology and pathobiology. Bioessays. 29 (6), 549-557 (2007).
  14. Nandan, M. O., Ghaleb, A. M., Bialkowska, A. B., Yang, V. W. Kruppel-like factor 5 is essential for proliferation and survival of mouse intestinal epithelial stem cells. Stem Cell Res. 14 (1), 10-19 (2015).
  15. Gelberg, H. B. Comparative anatomy, physiology, and mechanisms of disease production of the esophagus, stomach, and small intestine. Toxicol Pathol. 42 (1), 54-66 (2014).
  16. De Robertis, M., et al. The AOM/DSS murine model for the study of colon carcinogenesis: From pathways to diagnosis and therapy studies. J Carcinog. 10 (9), (2011).
  17. Magnus, H. A. Observations on the presence of intestinal epithelium in the gastric mucosa. The Journal of Pathology and Bacteriology. 44 (2), 389-398 (1937).
  18. Moolenbeek, C., Ruitenberg, E. J. The "Swiss roll": a simple technique for histological studies of the rodent intestine. Lab Anim. 15 (1), 57-59 (1981).
  19. Park, C. M., Reid, P. E., Walker, D. C., MacPherson, B. R. A simple, practical 'swiss roll' method of preparing tissues for paraffin or methacrylate embedding. J Microsc. 145, Pt 1 115-120 (1987).
  20. Summersgill, B., Clark, J., Shipley, J. Fluorescence and chromogenic in situ hybridization to detect genetic aberrations in formalin-fixed paraffin embedded material, including tissue microarrays. Nat Protoc. 3 (2), 220-234 (2008).
  21. Takeda, N., et al. Cardiac fibroblasts are essential for the adaptive response of the murine heart to pressure overload. J Clin Invest. 120 (1), 254-265 (2010).
  22. el Marjou, F., et al. Tissue-specific and inducible Cre-mediated recombination in the gut epithelium. Genesis. 39 (3), 186-193 (2004).
  23. McConnell, B. B., et al. Kruppel-like factor 5 is important for maintenance of crypt architecture and barrier function in mouse intestine. Gastroenterology. 141 (4), 1302-1313 (2011).
  24. Nandan, M. O., et al. Kruppel-like factor 5 is a crucial mediator of intestinal tumorigenesis in mice harboring combined ApcMin and KRASV12 mutations. Mol Cancer. 9 (63), (2010).
  25. Pirici, D., et al. Antibody elution method for multiple immunohistochemistry on primary antibodies raised in the same species and of the same subtype. J Histochem Cytochem. 57 (6), 567-575 (2009).
  26. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. CSH Protoc. 2008, pdb prot4986 (2008).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Улучшенная техника швейцарско-прокатка для Кишечные Подготовка ткани для иммуногистохимического и иммунофлуоресцентного анализов
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.