Методическая статья

подтипов Campylobacter jejuni Подвид. doylei Изолятов Использование PhyloProteomics Масс-спектрометрия на основе (MSPP)

DOI:

10.3791/54165

⸱

30 октября 2016 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institut für Medizinische Mikrobiologie, Universitätsmedizin Göttingen

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Масс - спектрометрии на основе phyloproteomics (MSPP) использовали для типа коллекцию Campylobacter jejuni SSP. Doylei изолирует на уровне штамма по сравнению с мультилокальному ввода последовательности (MLST).

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MALDI-TOF MS дает возможность различать некоторые бактерии не только на виды и подвиды уровне, но даже ниже, на уровне штамма. Аллельные изоформы ионов детектируемых биомаркеров в результате изолят конкретных массовых сдвигов. Масс-спектрометрия на основе phyloproteomics (MSPP) представляет собой метод роман, который сочетает в себе масс-спектрометрического детектируемых биомаркеров массы в схеме, что позволяет сделать вывод о phyloproteomic отношений из изолята конкретных массовых сдвигов по сравнению с геном секвенировали эталонного штамма. Выведенные аминокислотные последовательности затем используются для расчета дендрограммы МОЗН на основе.

Здесь мы опишем рабочий процесс MSPP, набрав Campylobacter jejuni SSP. Doylei изолята коллекцию из семи штаммов. Все семь штаммов были человеческого происхождения и мультилокальному последовательность ввода (MLST) продемонстрировали свое генетическое разнообразие. МОЗН-типирование привело к семи различных типов последовательностей МОЗН, достаточно отражая их PHYlogenetic отношения.

C. jejuni подвид. doylei схема МОЗН включает в себя 14 различных ионов биомаркеров, в основном рибосомных белков в диапазоне масс от 2 до 11 кДа. МОЗН может в принципе быть адаптированы к другим методом масс-спектрометрического платформы с расширенным диапазоном масс-. Таким образом, этот метод имеет потенциал, чтобы стать полезным инструментом для измерения уровня деформации микробного набора текста.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В течение последнего десятилетия, время пролета масс - спектрометрии матричной лазерной десорбцией ионизации (MALDI-TOF MS) выдвигала быть высоко оценен стандартным методом микробного рода и видовой идентификации в клинической микробиологии 1, 2. идентификация видов основан на регистрации небольших белковых отпечатков пальцев интактных клеток или клеточных лизатов. Типичный диапазон массы для масс-спектрометра, используемого в обычной клинической микробиологии является 2-20 кД. Кроме того, в результате чего спектры могут быть использованы для различения деформаций на ниже видов и ниже подвида уровня 3. Ранние пионерские исследования выявили специфические ионы биомаркеров для конкретной подгруппы штаммов в Campylobacter jejuni 4 Clostridium несговорчивый 5, сальмонелла энтерика подвид. enterica серовар Typhi 6, стафилококк 7 - 9, и Escherichia палочка 10 - 12.

Сочетание нескольких переменных масс биомаркеров, соответствующих аллельных изоформ дает возможность для более глубокого подтипов. Ранее мы успешно реализовали метод для преобразования этих вариаций массовых профилей в значимых и воспроизводимых phyloproteomic отношений , называемых массовых phyloproteomics основе спектрометрия (MSPP) на C. jejuni подвид. Коллекция jejuni изолят 13. МОЗН может быть использован масс-спектрометрический, эквивалентную последовательности ДНК методов подтипов, основанных как последовательности мультилокусная ввода (MLST).

Виды Campylobacter являются основной причиной бактериального гастроэнтерита во всем мире 14, 15. Как следствие Кампилобактериоз Постинфекционный осложнением, а именно, синдром Гийена - Барре, реактивный артрит и воспалительное заболевание кишечника может возникнуть 16. Основными источниками инфекции являютсязараженного мяса скота из курицы, индейки, свиней, крупного рогатого скота, овец и уток, молока и поверхностных вод 15, 17. Поэтому регулярные эпидемиологические исследования наблюдения в контексте безопасности пищевых продуктов необходимы. MLST является "золотым стандартом" в молекулярное типирование для Campylobacter видов 18. Поскольку Сангер-секвенирования на основе метода MLST является трудоемким, требует много времени и относительно дорогой, MLST набрав ограничивается относительно небольшими изолят когорты. Таким образом, существует потребность в более дешевых и быстрых методов подтипов. Эта потребность может быть выполнено с помощью методов масс-спектрометрических как MSPP.

Эта статья представляет собой подробный протокол для MSPP-ввода с помощью набора Campylobacter jejuni подвида. Doylei изоляты и сравнение его потенциал с MLST.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовьте безопасное рабочее место, рассматривая условия биобезопасности

  1. Знакомиться с лабораторными и правил техники безопасности, которые имеют отношение к работе с микроорганизмами. Большинство патогенных микроорганизмов человека должны быть обработаны на уровне биологической безопасности 2 условия , но некоторые, такие как сальмонелла энтерика серовара Typhi, требуют уровень биологической безопасности 3. Информация об уровне обработки каждого патогена могут быть доступны на www.cdc.gov/biosafety~~pobj.
  2. Независимо от биологической опасности классификации конкретного микроорганизма, рассматривать все материалы, которые вступали в контакт с инфекционным агентом, так как инфекционные отходы, которые должны быть автоклавного перед их утилизацией. Уважайте региональные правила техники безопасности для опасных материалов и биологических веществ. Убедитесь в том, что подходящие контейнеры для немедленного и надлежащего удаления потенциально загрязненных материалов (биологических опасностей) доступны.
  3. Убедитесь в том, что стерильные инструменты (прививочные петли), растворы и питательные среды (Чашки с агаром) доступны перед началом бактериальной культуры.
  4. Мойте руки с антисептическим мылом и теплой водой сразу после работы с инфекционными микроорганизмами.

2. Выберите Reference и Коллекция изолятов

  1. Выбрать и получить один стандартный референсный геном-секвенировали выделения наряду с последовательностями кодированного протеома, в идеале в формате FASTA. Если несколько штаммов геном-секвенирован доступны, включают их в анализе.
    Примечание: Эта изолят / эти изоляты будут в дальнейшем использоваться для прогнозирования идентичности масс-пиков, наблюдаемых в масс-спектрометрии (смотри раздел 7).
  2. Выбрать и получить различные потенциально разнообразных изолятов таким образом, чтобы они покрывали филогении видов или подвидов интерес.
    Примечание: Эти изоляты будут в дальнейшем использоваться для демонстрации изменчивости биомаркеров в популяции (см раздел 8).
  3. Убедитесь в том, что вся коллекция и ссылка изолят (ы) проPerly набран соответствующим золотым стандартом для данного конкретного организма 18 - 20.
    Примечание: Это может включать в себя множество (суб) методов -typing, но, скорее всего, прибегают к MLST, который до сих пор является стандартным способом, чтобы продемонстрировать генетическое разнообразие большинства видов микроорганизмов.
  4. Для того, чтобы сделать вывод о филогении в пределах коллекции, вычислить phylogram из данных , набрав, например, с помощью метода невзвешенное пара группы с среднеарифметического (UPGMA) в MEGA6 программного обеспечения для данных MLST 21. Для получения данных MLST, а также обратиться к базе данных MLST и назначить типы последовательностей и соответствующих клоновых комплексов 22.
    Примечание: Это будет в дальнейшем использоваться для анализа конгруэнтности MSPP с помощью метода стандартных тренажерах ранее золота (смотри раздел 9).

3. Подготовить MALDI визирную пластину

ВНИМАНИЕ: ТФК является сильной кислотой. Неправильное использование ТФК несет риск тяжелых ожогов кожи, повреждения глаз и сильное раздражение Oе верхних дыхательных путей при вдыхании. Поэтому строгие меры безопасности должны соблюдаться и надлежащего средства индивидуальной защиты (СИЗ), включая защитные очки, щитки, соответствующие перчатки, ботинки, или даже полный защитный костюм необходим, при обращении с ТФК. Возможное воздействие ТФК должно контролироваться путем обработки вещества при адекватной вентиляции с эффективной системой вытяжной вентиляции. В случае недостаточной вентиляции необходимо использовать респиратор с одобренным фильтром. Кроме того, ТФК является вредным для водных организмов с долгосрочными последствиями. Любой выпуск ТФК в сточных водах в окружающую среду следует избегать.

Примечание: Перед тем как пятнистость образцы на MALDI в мишень, очистить мишень тщательно, если пластина была использована ранее.

  1. Приготовьте 100 мл 70% -ного водного раствора этанола с использованием 30 мл деионизированной воды и 70 мл чистого этанола.
  2. Подготовьте 250 мкл 80% -ного водного раствора трифторуксусной кислоты в растворе (ТФК), путем смешивания 50мкл деионизованной воды и 200 мкл 100% ТФУ в реакционной трубе и встряхивая пробирку в течение 1 мин.
  3. Почистите MALDI мишень, поместив его в стеклянную посуду и погружением его в 70% водном растворе этанола в течение приблизительно 5 мин при комнатной температуре.
  4. Ополосните цель под горячей водой.
  5. С помощью бумажной салфетки, вытирать визирной интенсивно с 70% -ным водным раствором этанола, чтобы удалить все предыдущие образцы и другие потенциальные мусора.
  6. Если требуется дополнительная очистка, промыть под струей горячей воды в то время как вытирая бумажной салфеткой.
  7. Удалите остатки и потенциально невидимые, загрязняющие вещества, покрывая поверхность мишени тонким слоем 80% -ным водным раствором TFA (~ 100 мкл на 96 мест) и обтирать все целевые позиции чистой бумажной салфеткой.
  8. Наконец, промойте цель, чтобы удалить кислоту, вытереть насухо бумажной салфеткой, и оставьте его в течение по крайней мере 15 мин при комнатной температуре для испарения остаточной жидкости.

4. Получение45; Циано-4-гидрокси-коричной кислоты Матричный раствор, содержащий внутренний калибрующего

  1. Приготовьте насыщенный раствор матрицы путем растворения 10 мг альфа-циано-4-гидрокси-коричной кислоты (HCCA) в 1 мл смеси 50% ацетонитрила, 47,5% воды и 2,5% TFA. Остаточный нерастворенный HCCA останется, если раствор насыщен.
  2. Добавить рекомбинантный человеческий инсулин как внутренний калибрующего. Для этого, подготовить маточного раствора до конечной концентрации 10 пг / мкл в 50% -ном водном ацетонитриле, аликвоты и хранят при -20 ° C для дальнейшего использования.

5. MALDI-TOF масс-спектрометрии

Примечание: необходимо использовать условия культивирования специфических для организмов, представляющих интерес. Образцы для MALDI-TOF MS могут быть получены либо путем подготовки мазка или экстракции, в зависимости от организма (смотри раздел 8.4.1). В то время как способ экстракции кислоты этанол-муравьиной обеспечивает достаточную дезактивацию болезнетворных микроорганизмов, препарат мазок должен быть выполнен в соответствии с Suffциент условия биобезопасности по мере необходимости (смотри главу 1). Как правило, нет никакого риска инфекции после применения матрицы, но для конкретных патогенов необходимы специальные протоколы инактивацию. Так, например , MALDI-TOF MS видов Nocardia требует предварительного лизис бактерий в кипящей воде, последующим осаждением этанолом белков 23. EI Khéchine и др. разработана процедура инактивации микобактерий, нагревая колонии бактерий при температуре 95 ° С в течение 1 ч в завинчивающейся крышкой пробирки , содержащие воду и 0,5% Tween 20 24.

  1. Мазок Подготовка
    1. Распространение Pinhead размера количество бактериальной колонии непосредственно на положении пластины MALDI мишени ( «спот»).
    2. Перекрытие каждого пятна с 1 мкл ГКЦА регулярной матрицы или матрицы, содержащей внутреннюю калибрующего и оставляют кристаллизоваться при комнатной температуре. Для определения точной массы пика калибровки, наложения управления зрВЗ с 1 мкл Test Standard и 1 мкл матрицы ГКЦА, содержащей внутреннюю калибрующего.
      Примечание: Здесь, как Test Standard экстракт кишечной палочки DH5 альфа используется , что демонстрирует характерный белок отпечатка пальца в MALDI-TOF MS. Он шипами его с двумя белками, которые расширяют верхний предел обнаруживаемого диапазона масс.
  2. Добыча Метод
    1. Урожай приблизительно пять колоний из агаровой пластины культуры с петлей модифицирования и тщательно приостановить в 300 мкл дважды дистиллированной воды в 1,5 мл реакционной трубки. Добавить 900 мкл абсолютного этанола и тщательно перемешать повторным пипетированием, пока бактериальные колонии не будут полностью приостановлены.
      Примечание: На этом этапе можно и хорошо установлено для хранения образцов при -20 ° С. Кроме того, инактивация патогенных микроорганизмов может быть проверена путем полосатость 1-10 мкл экстракта на подходящую агаром после инкубации при оптимальных условиях роста. Успешный вАктивация обозначается отсутствие роста микробов.
    2. Центрифуга образца при 13000 х г в течение 1 мин, отбросить супернатант, и высушить осадок при комнатной температуре в течение 10 минут. Ресуспендируют осадок тщательно с помощью пипетки вверх и вниз в 50 мкл 70% -ной муравьиной кислоты.
    3. Добавить 50 мкл ацетонитрила и перемешивают. Удалите мусор с помощью центрифугирования при 13000 х г в течение 2 мин. Передача 1 мкл супернатанта на позиции образца на MALDI мишени пластины и оставить сохнуть в течение 5 мин при комнатной температуре.
    4. Перекрытие каждого пятна с 1 мкл матрицы ГКЦА, содержащей внутреннюю калибрующего и оставляют кристаллизоваться при комнатной температуре.
  3. Запись масс-спектров
    Примечание: Пик-выбирая из масс-спектров производится с использованием стандартных процедур рекомендуется (Centroid алгоритм; Отношение сигнал / шум:. 2; относительна интенсивность Порог: 2%; ширина пика 3 м / г, базовый вычитание: TopHat)
    1. Откалибровать прибор согласно protoc фабрикантовол.
    2. Для каждого пятна, собрать 600 спектров в 100 выстрелов шагов.
      1. Перейдите на вкладку "AutoXecute" конфигурации программного обеспечения масс-спектрометра. Откройте "метод" левой кнопкой мыши на кнопке "метод" и выбор метода , например, "MBT_AutoX" из выпадающего меню.
      2. Щелкните левой кнопкой мыши на кнопку "Редактировать ..." справа от меню "метод", чтобы открыть "AutoXecute Method Editor". Перейдите на вкладку "Накопительный". Установите "SUM UP" значение "600" и "удовлетворительные снимки в" _X_ "Ступени выстрел" значение "100".
  4. Внутренний Spectrum Процедура калибровки
    Примечание: ошибки измерения минуту присущи масс-спектрометрии. В зависимости от периодического использования прибора, температуры прибора и повторной калибровки, полученные значения измерений могут отличаться между экспериментами. После предварительной калибровки прибора измерения и после калибровочного измерения спектра к внутреннему калибрующего является наиболее точным способом обеспечения сопоставимости между спектра.
    1. Выполните следующие действия для каждой калибровки списка пиков:
      1. Запустить браузер спектра (например, flexAnalysis и открытый спектр:. Меню "Файл" → "Открыть ...")
      2. Создание списка контроля массы с пиком калибрующего: меню "Метод" → "Open ...".
      3. Выберите метод: MBT_Standard.FAMSMethod → ​​"Открыть".
      4. Edit List Mass Control: Снимите все Calibrants.
      5. Добавить пик калибрующего в нижней части: Пик этикетки: "Insulin_HIStag [M + H] + _ ср"; m_z: "5808,29"; Допуск [м.д.]: "50"; Проверьте калибрующего флажок.
      6. Сохранить как, например, "MSPP список калибрующего".
    2. Для каждого спектра, выберите калибрующего пик из списка, нажмите кнопку "Автоматическое Assign" и нажмите "Ok".
ove_title "> 6. Проверьте процедуру внутренней калибровки

  1. Экспериментально определить точное значение массы калибровочного пика.
    1. Подготовьте два пятна с 1 мкл Test Standard каждый (этап 5.1.1). Перекрытие сначала с 1 мкл регулярной матрицы HCCA, второй с 1 мкл калибрующего-матрицы с шипами.
    2. Получение масс-спектров от каждого пятна (раздел 5.3), и внутренне откалибровать к пикам Стандарт испытаний (раздел 5.4).
    3. Перекрытие обоих спектров, открыв их с браузером спектра (например, flexAnalysis и открытый спектр: меню "Файл" → "Открыть ...") и нахождение пика при ожидаемой массе (инсулин м / г = 5,808.29), которые должны присутствовать в калибрующего-спектр с шипами, но не в спектре, полученном с обычной матрицей.
  2. Убедитесь, что калибрующего Пик не закрывала любым другим биомаркером Организме интересов.
    1. Приготовьте два пятна (раздел 5.1) с опорным напряжением и Овеrlay сначала с 1 мкл регулярной матрицы, второй с 1 мкл калибрующего-матрицы с шипами.
    2. Приобретать масс - спектры с обеих точек (раздел 5.3) и наложения полученных спектров, открыв их с браузером спектра (например, flexAnalysis и открытый спектр: меню "Файл" → "Открыть ..."). Убедитесь в том, что пик калибрующего отчетливо виден в спектре, полученном с игольчатым матрицей и не загораживали другим смежным сигналом. Если это не так, то выбрать другой калибрующего для данного конкретного организма.
      Примечание: Использование пичковый внутреннего калибрующего значительно повышает точность для определения вариаций биомаркеров масс. С помощью этого метода, расщепление масс вплоть до 1 Da может быть обнаружен. В качестве альтернативы, также инвариантные массы, происходящие из организмов, могут быть использованы в качестве calibrants. Тем не менее, по определению, весь организм полученные массы должны рассматриваться как потенциально переменной, если не доказано иное.

7. Определение биомаркера ионов в эталонный штамм

  1. Измерьте масс-спектр эталонного штамма, с помощью матрицы подсыпали внутреннего калибрующего.
    1. Распространение Pinhead размера количество бактериальной колонии (раздел 5.1) или 1 мкл бактериального экстракта белка (раздел 5.2) непосредственно на позицию пластины MALDI мишени ( «спот»).
    2. Перекрытие каждого пятна с 1 мкл матрицы ГКЦА, содержащей внутреннюю калибрующего и оставить целевую пластину кристаллизоваться при комнатной температуре (раздел 5.1.2 / 5.2.4).
    3. Запись масс-спектры опорного напряжения (раздел 5.3).
  2. Внутренне калибровки эталонного спектра к калибрующего массы (здесь: инсулин при т / г = 5,806.29), а затем предварительно процесс в зависимости от исходного вычитания (TopHat) и сглаживания (параметры: SavitzkyGolay, ширина: 2 м / г, 10 циклов).
    1. Запустите браузер спектра (например, flexAnalysis и открытый спектр: меню "Файл" → "Открыть ...; ").
    2. Выберите метод: ниспадающее меню "Метод" → "Открыть ...", щелкните левой кнопкой мыши метод выбора, например, "MBT_Standard.FAMSMethod" → "Открыть".
    3. Калибровка спектра, выбрав "Внутренний ..." из выпадающего меню "Калибровка". Откроется окно списка пик калибрующего (ы) (раздел 5.4). Щелкните левой кнопкой мыши на пик калибрующего (инсулин) → Щелчок левой кнопкой мыши "OK". Выберите "спектры Process" из выпадающего меню "Process".
    4. Для базового вычитания активации спектра в списке спектра на правой стороне. Выберите "Отнимите Масс-спектр Базовый уровень" из выпадающего меню "Process".
    5. Для сглаживания спектра, активировать спектр в списке спектра на правой стороне. Выберите "Smooth Масс-спектр Базовый уровень" из выпадающего меню "Process".
  3. Из секвенирование генома данных эталонного штамма, вычислить theoreticaл одноизотопные молекулярный вес каждого из кодируемых белков, переводя последовательность ДНК в соответствующей аминокислотной последовательности с помощью редактора выравнивания последовательностей. Скопируйте и вставьте эту последовательность белка в поле ввода на портале ExPASy биоинформатики ресурсов (http://web.expasy.org/compute_pi/~~HEAD=pobj). и нажмите кнопку "Нажмите здесь", чтобы вычислить Pí / Mw. В случае С. jejuni подвид. doylei вычислить массу 14 детектируемых биомаркеров.
  4. Скопировать результаты в таблицу, с одной колонке, содержащей идентификатор гена и следующего молекулярного веса. Сортировка строк по вычисленной молекулярной массы с целью облегчения поиска в масс. Примечание: Другие столбцы не являются обязательными; функциональная аннотация может быть особенно полезным в дальнейшем для интерпретации.
  5. Вставьте второй столбец в таблицу для молекулярного веса де-methioninated форме, путем вычитания 135 Da из моноизотопном молекулярной массы. Примечание: Это происходит потому, что некоторые белки претерпевают посттрансляционной модификации путем протеолитического удаления терминальный метионин N.
  6. Назначают каждого основного измеренное биомаркеров массы к расчетным массам от эталонного штамма путем поиска измеренной массы из таблицы генома , полученного выше (таблица 1).
  7. Если ионы биомаркеров не могут быть отнесены к прогнозируемым генных продуктов, рассмотреть другие посттрансляционные модификации (метилирование, ацетилирование, пренилирование и т.д., см http://www.abrf.org/delta-mass для компиляции модификаций и связанных с ней массовых изменений ). Для любого другого известного посттрансляционной модификации, которая часто наблюдается в организмах интерес добавить еще один столбец в таблицу и пересчитывать молекулярный вес, аналогичный способу де-methioninated форме.
  8. Настройка на другую вкладку с электронными таблицами, а также запись для каждого биомаркера ионов массы и идентификатора в отдельном столбце таблицы.

8. Оценка биомаркером Изменчивостьв популяции

  1. Откалибруйте масс-спектры, полученные из коллекции штаммов, как это было сделано для эталонного штамма (ов) (раздел 5.4.2).
  2. Определение вариантных биомаркеров в масс-спектрах. Вариантом масса характеризуется отсутствием массы, известной из эталонного спектра и появления новой массы не присутствует в ссылке. Разность масс должна соответствовать одному обмена аминокислот (таблица 2), или их комбинации.
  3. На одном из изолята на строку, записывать измеренные массы для каждого биомаркера и предсказанным изоформы в соответствующих столбцах таблицы.
    Примечание: В редких случаях , некоторые массовые сдвиги могут быть связаны с несколькими различными биржами аминокислот, например, как, N обмениваются D и Q обмениваются E, и наоборот, приводят к массовому смещению 0,985 Da (таблица 2). Эта внутренняя проблема не может быть решена с помощью масс-спектрометрии в одиночку. Таким образом, различные изоформы на уровне последовательности белка, имеющего ту же массудолжны рассматриваться в качестве одного типа MSPP. Параллельный Sanger секвенирование определенных генов ионных биомаркеров подтвердили , что эта проблема не произошло в то время как МОЗН-набрав C. jejuni подвид. doylei изолировать коллекцию , используемую в данном исследовании.
  4. Подтвердите новые типы МОЗН с помощью ПЦР-амплификации и секвенирования соответствующих генов биомаркеров. В свою очередь, это также служит подтверждением того, что личность биомаркером было правильно настроено.
    1. Культура бактериальных изолятов при оптимальных условиях роста. Культура C. jejuni SSP. doylei штаммы на Колумбийский агар с добавлением 5% овечьей крови при 37 ° С в условиях микроаэрофилии (5% O 2, 10% СО 2, 85% N 2). Выдержите в течение ок 48 ч. Используйте отдельный агаризованной для каждого изолята, чтобы избежать перекрестного загрязнения.
    2. Извлечение геномной ДНК из бактериальных изолятов с использованием соответствующего набора для экстракции ДНК / автоматизированное оборудование в соответствии с инструкциями изготовителя.
    3. Amplify соответствующие гены биомаркеров с использованием праймеров , перечисленных в таблице 3 Выполните все реакции ПЦР при следующих условиях:. денатурации при 94 ° С в течение 30 секунд; отжиг при 55 ° С в течение 30 сек; Относительное удлинение при 72 ° С в течение 30 сек.
    4. Определение последовательности ДНК каждого ампликона Сангером секвенирования с использованием соответствующего количества геномной ДНК (обычно 600-700 нг ДНК достаточна при концентрации около 100 нг / мкл) и один из праймеров для амплификации (как правило, это делается использование поставщика услуг).
  5. В отдельной таблице (см таблицу 4), записать выведенная последовательность белка для каждого нового изоформы с помощью соответствующего инструмента перевода (например, Transseq: http://www.ebi.ac.uk/Tools/st/~~HEAD=dobj) 25.

9. Вычислить филогению МОЗН основе и сравнения с золотого стандарта

  1. Соединить конкретные последовательности биомаркером аминокислот, принадлежащих к ттипа он МОЗН изолятов в одну непрерывную последовательность с использованием редактора выравнивания последовательностей, таких как BioEdit (http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html~~HEAD=pobj) 26 или биомаркеров таблицы.
  2. Вычислить филогению путем кластеризации , как это сделано для золотого стандарта типов данных, например, UPGMA кластеризация 21.
  3. Сравните филогению МОЗН основе к полученному с золотым стандартом 4, 13.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ранее мы успешно установили схему MSPP для C. jejuni подвид. jejuni 13. Здесь мы стремились распространить метод на родственный подвида C. jejuni подвид. doylei. В этой конкретной обстановке, семь С. jejuni подвид. doylei изоляты были приобретены у бельгийской коллекции микроорганизмов / Лаборатория микробиологии UGent BCCM / LMG Генте, Бельгия. Все семь изолятов, используемые для нашего анализа были человеческого происхожд...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Самым важным шагом в создании схемы MSPP является однозначная генетическая определение биомаркеров ионных идентичностей. Если это не представляется возможным идентифицировать биомаркеров , несомненно, то его следует исключить из схемы 13.

C. jejuni подвид. doylei схема включает в себя 14 различных ионов биомаркеров. Эти 5 меньше по сравнению с C. jejuni подвид. Схема jejuni МОЗН 13 .Наиболее существенная разница между выявляемой C...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарны Ханне Кляйншмидт за отличную техническую поддержку. Эта статья была подготовлена в рамках программы поддержки открытого доступа Deutsche Forschungsgemeinschaft и издательского фонда Гёттингенского университета имени Георга Августа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
ацетонитрилSigma-Aldrich, Тауфкирхен, Германия34967
Autoflex III TOF/TOF 200 системаBruker Daltonics, Бремен, ГерманияGT02554 G201Масс-спектрометр
Стандарт для тестирования бактерий BTSBruker Daltonics, Бремен, Германия604537
BioTools 3.2 SR1Bruker Daltonics, Бремен, Германия263564Программный комплекс
Bruker IVD Bakterial Test StandardBruker Daltonics, Бремен, Германия82901905 пробирок
Campylobacter jejuni subsp. doylei изолят Бельгия координировала сбор микроорганизмов/Лаборатория микробиологии UGent BCCM/LMG Гент, БельгияLMG8843ATCC 49349; IMVS 1141; NCTC 11951; штамм 093
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate Бельгийская координированная коллекция микроорганизмов/Лаборатория микробиологии UGent BCCM/LMG Гент, БельгияLMG9143Goossens Z90
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate Бельгия координировала сбор микроорганизмов/Лаборатория микробиологии UGent BCCM/LMG Гент, БельгияLMG7790ATCC 49350; CCUG 18265; Каспер 71; LMG 8219; NCTC 11847
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate Бельгия координировала сбор микроорганизмов/Лаборатория микробиологии UGent BCCM/LMG Гент, БельгияLMG9243Goossens N130
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate Бельгия координированная коллекция микроорганизмов/Лаборатория микробиологии UGent BCCM/LMG Гент, БельгияLMG8871NCTC A603/87
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate Бельгия координировала сбор микроорганизмов/Лаборатория микробиологии UGent BCCM/LMG Гент, БельгияLMG9255Goossens B538
Campylobacter jejuni subsp. doylei isolate Бельгия координирована сбор микроорганизмов/Лаборатория микробиологии UGent BCCM/LMG Гент, БельгияLMG8870NCTC A613/87
Колумбийское основание агара Merck, Дармштадт, Германия1.10455 .0500500 г
Компас для FlexSeries 1.2 SR1Bruker Daltonics, Бремен, Германия251419Пакет программного обеспечения
для дефибринированной крови овец Oxoid Deutschland GmbH, Wesel, ГерманияSR0051
этанолSigma-Aldrich, Тауфкирхен, Германия02854 Fluka
муравьиная кислотаSigma-Aldrich, Тауфкирхен,Германия F0507
матрица HCCABruker Daltonics, Бремен, Германия604531
Kimwipes бумажная салфеткаKimtech Science через Sigma-Aldrich, Тауфкирхен, Германия
MALDI Biotyper 2.0Bruker Daltonics, Бремен, Германия259935программный пакет
Мачта Криобанк флаконыMast Diagnostica, Рейнфельд, ГерманияCRYO/B
MSP 96 мишень из полированной сталиBruker Daltonics, Бремен, Германия224989
QIAamp DNA Mini Kit Qiagen, Hilden, Германия51304
рекомбинантный человеческий инсулинSigma-Aldrich, Тауфкирхен, ГерманияI2643
трифторуксусная кислотаSigma-Aldrich, Тауфкирхен, ГерманияT6508
вода, молекулярная биология классаSigma-Aldrich, Тауфкирхен, ГерманияW4502
Z188956

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Seng, P., et al. Ongoing revolution in bacteriology: routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Clin Infect Dis. 49 (4), 543-551 (2009).
  2. Bader, O. MALDI-TOF-MS-based species identification and typing approaches in medical mycology. Proteomics. 13 (5), 788-799 (2013).
  3. Sandrin, T. R., Goldstein, J. E., Schumaker, S. MALDI TOF MS profiling of bacteria at the strain level: a review. Mass Spectrom Rev. 32 (3), 188-217 (2013).
  4. Zautner, A. E., et al. Discrimination of multilocus sequence typing-based Campylobacter jejuni subgroups by MALDI-TOF mass spectrometry. BMC Microbiol. 13, 247(2013).
  5. Reil, M., et al. Recognition of Clostridium difficile PCR-ribotypes 001, 027 and 126/078 using an extended MALDI-TOF MS system. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 30 (11), 1431-1436 (2011).
  6. Kuhns, M., Zautner, A. E., et al. Rapid discrimination of Salmonella enterica serovar Typhi from other serovars by MALDI-TOF mass spectrometry. PLoS One. 7 (6), e40004(2012).
  7. Wolters, M., et al. MALDI-TOF MS fingerprinting allows for discrimination of major methicillin-resistant Staphylococcus aureus lineages. Int J Med Microbiol. 301 (1), 64-68 (2011).
  8. Josten, M., et al. Analysis of the matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrum of Staphylococcus aureus identifies mutations that allow differentiation of the main clonal lineages. J Clin Microbiol. 51 (6), 1809-1817 (2013).
  9. Lu, J. J., Tsai, F. J., Ho, C. M., Liu, Y. C., Chen, C. J. Peptide biomarker discovery for identification of methicillin-resistant and vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus strains by MALDI-TOF. Anal Chem. 84 (13), 5685-5692 (2012).
  10. Novais, A., et al. MALDI-TOF mass spectrometry as a tool for the discrimination of high-risk Escherichia coli clones from phylogenetic groups B2 (ST131) and D (ST69, ST405, ST393). Eur J Clin Microbiol Infect Dis. , (2014).
  11. Matsumura, Y., et al. Detection of extended-spectrum-beta-lactamase-producing Escherichia coli ST131 and ST405 clonal groups by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry. J Clin Microbiol. 52 (4), 1034-1040 (2014).
  12. Christner, M., et al. Rapid MALDI-TOF Mass Spectrometry Strain Typing during a Large Outbreak of Shiga-Toxigenic Escherichia coli. PLoS One. 9 (7), e101924(2014).
  13. Zautner, A. E., Masanta, W. O., Weig, M., Groß, U., Bader, O. Mass Spectrometry-based PhyloProteomics (MSPP): A novel microbial typing Method. Scientific Reports. 5, (2015).
  14. The global view of campylobacteriosis. WHO. World Health Organisation (WHO), , Available from: http://www.who.int/foodsafety/publications/campylobacteriosis/en/ (2013).
  15. Dasti, J. I., Tareen, A. M., Lugert, R., Zautner, A. E., Gross, U. Campylobacter jejuni: a brief overview on pathogenicity-associated factors and disease-mediating mechanisms. Int J Med Microbiol. 300 (4), 205-211 (2010).
  16. Zautner, A. E., et al. Seroprevalence of campylobacteriosis and relevant post-infectious sequelae. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 33 (6), 1019-1027 (2014).
  17. Zautner, A. E., Herrmann, S., Groß, U. Campylobacter jejuni - The Search for virulence-associated factors. Archiv Fur Lebensmittelhygiene. 61 (3), 91-101 (2010).
  18. Dingle, K. E., et al. Multilocus sequence typing system for Campylobacter jejuni. J Clin Microbiol. 39 (1), 14-23 (2001).
  19. Dingle, K. E., et al. Molecular characterization of Campylobacter jejuni clones: a basis for epidemiologic investigation. Emerg Infect Dis. 8 (9), 949-955 (2002).
  20. Cody, A. J., et al. Real-time genomic epidemiological evaluation of human Campylobacter isolates by use of whole-genome multilocus sequence typing. J Clin Microbiol. 51 (8), 2526-2534 (2013).
  21. Tamura, K., Stecher, G., Peterson, D., Filipski, A., Kumar, S. MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0. Mol Biol Evol. 30 (12), 2725-2729 (2013).
  22. Jolley, K. A., Chan, M. S., Maiden, M. C. mlstdbNet - distributed multi-locus sequence typing (MLST) databases. BMC Bioinformatics. 5, 86(2004).
  23. Verroken, A., et al. Evaluation of Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry for Identification of Nocardia Species. J Clinl Microbiol. 48 (11), 4015-4021 (2010).
  24. El Khéchine, A., Couderc, C., Flaudrops, C., Raoult, D., Drancourt, M. Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry Identification of Mycobacteria in Routine Clinical Practice. PLoS ONE. 6 (9), e24720(2011).
  25. Goujon, M., et al. A new bioinformatics analysis tools framework at EMBL-EBI. Nucleic Acids Research. 38, Web Server issue 695-699 (2010).
  26. Hall, T. A. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symposium Series. 41, 95-98 (1999).
  27. Jolley, K. A., et al. Ribosomal multilocus sequence typing: universal characterization of bacteria from domain to strain. Microbiology. 158, 1005-1015 (2012).
  28. Suarez, S., et al. Ribosomal proteins as biomarkers for bacterial identification by mass spectrometry in the clinical microbiology laboratory. J Microbiol Methods. 94 (3), 390-396 (2013).
  29. Teramoto, K., et al. Phylogenetic classification of Pseudomonas putida strains by MALDI-MS using ribosomal subunit proteins as biomarkers. Anal Chem. 79 (22), 8712-8719 (2007).
  30. Teramoto, K., Kitagawa, W., Sato, H., Torimura, M., Tamura, T., Tao, H. Phylogenetic analysis of Rhodococcus erythropolis based on the variation of ribosomal proteins as observed by matrix-assisted laser desorption ionization-mass spectrometry without using genome information. J Biosci Bioeng. 108 (4), 348-353 (2009).
  31. Bernhard, M., Weig, M., Zautner, A. E., Gross, U., Bader, O. Yeast on-target lysis (YOTL), a procedure for making auxiliary mass spectrum data sets for clinical routine identification of yeasts. J Clin Microbiol. 52 (12), 4163-4167 (2014).
  32. Stark, T., et al. Mass spectrometric profiling of Bacillus cereus strains and quantitation of the emetic toxin cereulide by means of stable isotope dilution analysis and HEp-2 bioassay. Anal Bioanal Chem. 405 (1), 191-201 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

TOF MS

Похожие статьи