Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Генерация гуманизированное печени мышей с помощью печени человека стволовые клетки

10.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/54167

⸱

29 августа 2016 г.

 ,  , 
1Department of Regenerative Medicine, Graduate School of Medicine, Yokohama City University, 2Department of Advanced Gastroenterological Surgical Science and Technology, Faculty of Medicine, University of Tsukuba, 3Regenerative Medicine Research Center, Jiangsu University Hospital

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем новую гуманизированную модель печени мыши, созданную на мышах с нокаутом опосредованных рецепторами Alb-токсина (TRECK)/SCID после трансплантации незрелых и расширяемых стволовых клеток печени человека.

Аннотация

Разработана новая животная модель с участием химерных мышей с гуманизированной печенью, полученной с помощью трансплантации гепатоцитов человека. Эти мыши, у которых печень была повторно заселена функциональными человеческими гепатоцитами, могут служить полезным инструментом для изучения биологии клеток печени человека, метаболизма лекарств и других доклинических применений. Одним из ключевых факторов, необходимых для успешной трансплантации гепатоцитов человека мышам, является элиминация эндогенных гепатоцитов для предотвращения конкуренции с клетками человека и обеспечения подходящего пространства и микросреды для стимулирования экспансии и дифференцировки донорских клеток человека. На сегодняшний день созданы две основные модели мышей с повреждением печени с использованием фумарилакацетатгидролазы (Fah) и активатора уроплазминогена (uPA) мышей. Тем не менее, мыши Fah используются в основном со зрелыми гепатоцитами, и применение модели uPA ограничено снижением размножения. Чтобы преодолеть эти ограничения, мыши, опосредованные рецептором Alb-токсина, использовали мышей с нокаутом клеток (TRECK)/SCID для дифференцировки in vivo незрелых гепатоцитов человека и гуманизации печени. Стволовые клетки печени человека (HpSCs) успешно заселили печень мышей Alb-TRECK/SCID, у которых развилась летальная фульминантная печеночная недостаточность после лечения дифтерийным токсином (DT). Эта модель гуманизированной печени у мышей Alb-TRECK/SCID будет иметь функциональное применение в исследованиях, связанных с метаболизмом лекарств и лекарственными взаимодействиями, а также будет способствовать другим исследованиям in vivo и in vitro.

Введение

Мыши обычно используются для фармацевтических испытаний, поскольку биомедицинские исследования на людях ограничены1; однако эти модели не всегда полезны, поскольку они могут неточно имитировать эффекты, наблюдаемые у людей. Большинство лекарств в современном медицинском применении метаболизируются в основном в печени. Тем не менее, один и тот же препарат может метаболизироваться в разные метаболиты в печени мышей и человека из-за межвидовых различий. Таким образом, во время разработки часто бывает трудно определить, представляет ли потенциальный препарат какие-либо риски для клинического применения2,3.

Чтобы решить эту проблему, были разработаны "гуманизированные" мышиные печени путем выращивания клеток печени человека внутри мышей4-6; эти модели демонстрируют реакцию на лекарства, аналогичную той, что наблюдается в печени человека. Основные модели мышей, используемые в настоящее время для гуманизации печени, включают мышей с активатором уроплазминогена (uPA+/+)4,7, мышей с фумарилацетоацетатгидролазой (Fah-/-) 6 и недавно зарегистрированных мышей с тимидинкиназой (TK-NOG).

Однако предыдущие отчеты показали, что трансплантированные незрелые человеческие клетки или стволовые клетки менее конкурентоспособны, чем взрослые человеческие гепатоциты в печени мышей Alb-uPA tg(+/−)Rag2(−/−)8-10. Более того, мыши Fah−/− обеспечивают преимущество в росте только для дифференцированных гепатоцитов, а не для незрелых клеток-предшественников печени11. Трансплантация стволовых клеток печени человека (HpSCs) мышам с TK-NOG в лаборатории не увенчалась успехом. Следовательно, в настоящее время не существует полезной мышиной модели для эффективного приживления незрелых клеток печени человека.

Таким образом, мы разработали новую модель мыши Alb-TRECK/SCID, которая может быть эффективно повторно заселена незрелыми гепатоцитами человека. Эта трансгенная мышиная модель экспрессирует рецепторы человеческого гепарин-связывающего EGF-подобного фактора роста (HB-EGF) под контролем промотора альбумина, специфичного для клеток печени. После введения дифтерийного токсина (ДТ) у этих мышей развивается фульминантный гепатит из-за условной абляции гепатоцитов, что обеспечивает резидентность донорских клетоки пролиферацию. Несмотря нато, что гепатоциты мышей были успешно трансплантированы мышам Alb-TRECK/SCID в предыдущих исследованиях, о создании гуманизированной печени с использованием мышей Alb-TRECK/SCID еще не сообщалось.

В этом исследовании гуманизированная печень была получена у мышей Alb-TRECK/SCID путем трансплантации HpSCs. Эта гуманизированная печень обеспечивает in vivo среду для универсальной дифференцировки стволовых клеток и способности предсказывать характер метаболизма лекарств человека и взаимодействие лекарств.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все экспериментальные процедуры животных были проведены в соответствии с Руководством по защите животных от Yokohama City University.

1. Генерация модели острого печени Травма мыши

  1. Добавить 1 мл phenolized 0,85% раствора NaCl (0,6 г фенола в 100 мл 0,85% раствора NaCl) до 1 мг токсина дифтерии (DT), чтобы сделать 1 мг / мл маточного раствора DT. Примечание: ДТ в концентрации 1 мг / мл может храниться в течение приблизительно 2 лет при 3 ° С до 8 ° С.
  2. Серийно разбавить 1 мг / мл маточного раствора ДТ до 0,3 мкг / мл DT в phenolized 0,85% раствором хлорида натрия и готовят аликвоты 0,3 мкг / мл раствора DT в качестве рабочего раствора. Примечание: Этот рабочий раствор должен быть свежеприготовленным.
  3. Для проведения экспериментов с использованием сублетальных дозы (~ 50% летальность), управлять 8-недельных мышей в возрасте 1,5 мкг / кг дозы DT.
    1. Выполните внутрибрюшинную инъекцию DT, держа мышь в спинных лежачее и вставьте needlе ниже сгиба колен, слева или справа от средней линии. Избегайте средней линии, чтобы предотвратить проникновение в мочевой пузырь. Угол иглы под примерно 45 ° по отношению к телу.
    2. Использование инсулиновый шприц, вводят мышам с помощью 100 мкл свежеприготовленного 0,3 мкг / мл DT на 20 г веса мыши. Например, 18-г мыши должен получить 90 мкл 0,3 мкг раствора DT / мл.
  4. В 48 ч после инъекции дт, собирают кровь из хвостовой вены, помещая мышь в фиксатор и нагревая хвост мыши на водяной бане 37 ° С в течение приблизительно 10 мин, чтобы расширить кровеносные сосуды. Затем, сделайте 1-мм ник в хвост 2 см от кончика с острым скальпелем и собирают кровь с микрокапиллярной трубкой.
    1. Центрифуга микрокапиллярной трубки, содержащей кровь при 1500 х г в течение 5 мин и собирают сыворотку отделение надосадочной жидкости и осадка клеток.
  5. 50 мкл 1:20 разбавленной сыворотки мыши на GOT / AST-PIII скользит. Измеряют поглощение продукта реакции (синий краситель) при 650 нм с использованием многоцелевой автоматического анализатора сухим химии в соответствии с протоколом производителя.
    Примечание: для чтения из аспартатаминотрансферазы (АСТ) / отображается автоматически глутаминовой щавелевоуксусной трансаминазы (GOT) активность. 2 дня после инъекции DT, примерно 60% мышей выставлены значения AST между 12000 - 16000 МЕ / л и были рассмотрены, страдают от острого повреждения печени. Эти мыши были переведены в новую клетку, и использовали в качестве реципиентов трансплантата клеток.

2. Подготовка печени человека стволовых клеток

  1. Изолировать печени человека стволовые клетки из первичных клеток эмбриональной печени человека с использованием клеток сортировщика антигены CDCP1, CD90 и CD66 клеток для получения субпопуляции CDCP1 + CD90 + CD66-, затем засеять популяцию клеток изолированных на коллаген IV покрытием блюда культуры, как сообщалось ранее 15. Используйте первичные эмбриональные клетки печени человека зачаточномвозраст от 14 до 18 недель.
  2. Собирают печени человека стволовые клетки культивировали до 80% - 90% слияния на чашки для культивирования 100 мм, аспирация культуральной среды, промыть клетки с 10 мл PBS, а затем удалить PBS. Trypsinize клетки с 2 мл 0,05% -ного раствора трипсина / ЭДТА в течение 5 мин при 37 ° С. Примечание: Клетки в более чем 90% слияния, не подходят для трансплантации клеток, так как дифференцировка клеток могут влиять на их способность пролиферативный у мышей.
  3. Контроль состояния дисперсии клеток под микроскопом. Когда клетки кажутся плавающими или течет свободно, остановить ферментативного расщепления путем добавления 8 мл DMEM / F12, содержащей 10% FBS.
  4. Суспендирования клеток медленно с помощью 10 мл серологической пипеткой и переносят клетки в коническую пробирку объемом 15 мл. Центрифуга клетки в течение 5 мин при 100 х г и 4 ° С.
  5. Аккуратно ресуспендируют осадок клеток в 10 мл DMEM / F12, содержащей 10% FBS и определяют количество клеток с помощью микроскопа счетнокамерное.
  6. Разделить ячейки в 1,0 × 10 6 клеток на 50 мкл PBS аликвоты для каждой отдельной мыши и не хранить на льду до трансплантации.

3. внутриселезеночное Трансплантация печени человека стволовых клеток

  1. Поместите чистую клетку на 37 ° C электрический грелку.
  2. Обезболить мыши с помощью изофлуран ингаляции (1 - 1,5% (об / об) в 2 л кислорода в минуту), поместив ее под соплом. В качестве альтернативы, используйте пробирки, содержащие марлю, смоченную изофлуран.
    1. Убедитесь в том, что мышь находится под наркозом, слегка зажимая заднюю лапу. Если коленный рефлекс выявляется, поместите мышь обратно в камеру. Используйте ветеринара мазь для глаз, чтобы предотвратить сухость под наркозом.
  3. Бритье хирургический сайт, используя электрические ножницы и применять 70% (по объему / об) этанола и повидон-йода для стерилизации. Затем делают разрез кожи 1 см в левый бок чуть ниже реберной границы ребер, а затем разрез набрюшной стенки, а также брюшину.
  4. Осторожно обнажения селезенки. С помощью 100-мкл микроинъекции шприц с 32-G 1/2-дюймовый иглу , чтобы непосредственно вводить 1,0 × 10 6 печени человека стволовых клеток в 50 мкл PBS в селезенку каждой мыши. Наклоните иглу под углом 5 ° для инъекций.
    1. Убедитесь, что глубина инъекции составляет менее половины толщины селезенки. Игла должна войти в селезенку на одном конце (голова) и хранение клеток на другом конце (хвост).
  5. Для того, чтобы предотвратить утечку клеток после инъекции, осторожно применять давление с помощью пальца в течение 2 мин, а затем удалить иглу.
  6. Поместите селезенку обратно в тело мыши и закрыть полость с нормальной проточной шву для мускулатуре и кожи.
  7. Передача мышей в 37 ° C подогретого клетки сразу же после трансплантации. Для обеспечения мышь способна дышать комфортно, поместите курсор на его стороне в клетке, Аопорожнять контакт между клеткой и подстилки месте операции.
  8. Монитор мышей до анестезии не спадет, чтобы обеспечить швы остаются закрытыми и мыши вернуться к предоперационного условия.
  9. Убедитесь, что у мышей обеспечены нормальной питьевой водой и пищей. Через 1 ч возвращают в клетку в комнату мыши центра животных и контролировать мышей ежедневно.

4. Обнаружение пересаженных печени человека стволовых клеток, полученных из гепатоцитов в печени мышей

Примечание: Для следующих процедур, усыпить всех животных с помощью передозировки кетамина и ксилазина с последующим смещением шейных позвонков.

  1. Через 4 - 6 недель после трансплантации, эвтаназии мышей и открыть брюшной полости за счет одновременного разрезания кутис и фасции с помощью хирургических ножниц.
  2. Рассеките соединительной ткани над брюшины, используя ножницы, как расширитель, и разрезают брюшину вдоль белой линии, чтобы открыть брюшнуюполость.
  3. Lift грудину с пинцетом, проколоть мембрану, и прорезать каждую сторону от грудины вверх через цервикальный пояском.
  4. Отрежьте полую вену на грудном стороне печени и тянуть пищевод через печень в переднем направлении. Извлеките диафрагму, чтобы удалить печень.
    Примечание: Будьте осторожны, чтобы держать кончики ножниц указал вверх, чтобы предотвратить повреждения органов грудной клетки внизу. Тимус имеет тенденцию иногда цепляются к спинной стороне грудной кости, и это должно быть тщательно избегать.
  5. С помощью диафрагмы в качестве ручки, начинают вытягивать печень из брюшной полости. Внутренняя полая будет держать печень на месте. Обрежьте внутреннюю полую вену; будьте осторожны, чтобы не преждевременно освободить правый надпочечник.
    Примечание: Мыши имеют четыре-лопастные печень, состоящую из средней доли, левой доли, правой доли, и хвостатого мочку. Желчный пузырь суспендируют в небольшом раздвоениюмедианная лопасть.
  6. Отдельные лепестки друг от друга на стыках и встраивать их в оптимальной температуры резания (ОКТ) соединения в соответствии с протоколом производителя. Замораживание ОКТ, содержащий ткани печени в металлических сеток на криостата.
  7. Вырезать 5-мкм срезы толщиной образца с помощью криостата при температуре -18 ° C и смонтировать их на предметные стекла микроскопа RT. Хранить запас при -80 ° С. Подготовьте слайды для гематоксилином и эозином (H & E) и иммунофлюоресценции окрашивания в соответствии с ранее описанными процедурами 16.

5. Обнаружение Альбумин человека секретируемых Расчет химерного Rate

  1. Для измерения человеческого воссоздание печени, проводить человеческого альбумина ELISA с использованием сыворотки и человеческого альбумина ELISA набор в соответствии с инструкциями изготовителя.
  2. Вычислить гуманизированного печени химерный скорость путем ПЦР в реальном времени анализ уровней экспрессии во всем-гуманизировать печени. Определить относительную ехотношение уровней прижимное актина человека специфичные для человека и мыши кросс актина (соотношение 1) и отношение мыши конкретных актина к человеческой-мышиной поперечному актина (отношение 2). Химерные ставка рассчитывается как отношение 1 / (соотношение 1 + 2) соотношение.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Alb-Treck / SCID мышей гепатоциты экспрессии человеческого рецептора DT HB-EGF ген под контролем промотора альбумина и проявляют цитотоксические эффекты после введения DT 12. Для того, чтобы оценить влияние лечения на ДТ поражения печени, DT дозы 1,5 мкг / кг вводили в 8-недельных Alb-Treck / SCID мышей и патологические изменения в администрации DT часов после печени 48 были оценены гистологически. По сравнению с контрольными мышами (не получавших ДТ), ДТ-обработанных мышей пр...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Недавние исследования показали , что печень мыши может быть заселена с гепатоцитах человека, в том числе взрослых гепатоцитов и пролиферативных печеночных стволовых клеток 17. Эти заселен печенки были использованы в качестве доклинических экспериментальных моделей для тестирования метаболизма лекарственных средств и открытия и разработки лекарственных средств 18; кроме того, они предоставили среду в естественных условиях для созревания и дифференцировки клеток 19. Основная цель ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют конкурирующих финансовых интересов, которые можно было бы раскрыть.

Благодарности

Мы хотим поблагодарить Проект по генетике млекопитающих, Токийский столичный институт медицинских наук, за предоставление мышей. Мы также благодарим С. Аояму и Ю. Адачи из Научно-исследовательского института абсорбции, распределения, метаболизма, выведения) и токсикологии С. Аояма и К. Кодзакай и Ю. Ямаду за помощь в анализе ЖХ-МС/МС. Эта работа была частично поддержана грантами от Министерства образования, культуры, спорта, науки и технологий (MEXT) Японии для Y-W.Z. (18591421, 20591531 и 23591872); Проект по инновациям и предпринимательству в провинции Цзянсу по привлечению талантов высокого уровня и Проект планирования науки и технологий в провинции Цзянсу (BE2015669); а также грантами Х.Т. за стратегическое содействие инновационным исследованиям и разработкам (S-innovation, 62890004) от Японского агентства по науке и технике.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Альбумин человекаSigmaA6684Мышь
Человек CK19DakoM088801Ядра
мышиМиллипорыMAB1281Мыши
Человек CK8/18ПрогенGP11Морская свинка
CDCP1Biolegend324006Мышь
CD90BD559869Мышь
CD66BD551479мышь
GOT/AST-PIIIFujifilm14A2X10004000009
DMEM/F-12Gibco11320-033
FBSBiowestS1520
0,05% трипсин-ЭДТА Gibco25300-054
Дифтерийный токсинSigmaD0564-1MG
Альбумин человека ИФА НаборBethyl LaboratoriesE88-129
Шприц (1 мл)TerumoSS-01T
32G 1/2" иглаTSKPRE-32013
O.C.T.Compound (118 мл)Sakura Finetek Япония4583
Высокоскоростной сортировщик ячеекMoFlo Beckman CoulterB25982
DRI-CHEM 7000Fujifilm14B2X10002000046

Ссылки

  1. Muruganandan, S., Sinal, C. Mice as clinically relevant models for the study of cytochrome P450-dependent metabolism. Clin. Pharmacol. Ther. 83, 818-828 (2008).
  2. Nishimura, T., et al. Using chimeric mice with humanized livers to predict human drug metabolism and a drug-drug interaction. J. Pharmacol. Exp. Ther. 344, 388-396 (2013).
  3. Suemizu, H., et al. Establishment of a humanized model of liver using NOD/Shi-scid IL2Rgnull mice. Biochem. Biophys. Res. Commun. 377, 248-252 (2008).
  4. Tateno, C., et al. Near completely humanized liver in mice shows human-type metabolic responses to drugs. Am. J. Pathol. 165, 901-912 (2004).
  5. Hasegawa, M., et al. The reconstituted 'humanized liver'in TK-NOG mice is mature and functional. Biochem. Biophys. Res. Commun. 405, 405-410 (2011).
  6. Azuma, H., et al. Robust expansion of human hepatocytes in Fah−/−/Rag2−/−/Il2rg−/− mice. Nat. Biotechnol. 25, 903-910 (2007).
  7. Rhim, J. A., Sandgren, E. P., Degen, J. L., Palmiter, R. D., Brinster, R. L. Replacement of diseased mouse liver by hepatic cell transplantation. Science. 263, 1149-1152 (1994).
  8. Haridass, D., et al. Repopulation efficiencies of adult hepatocytes, fetal liver progenitor cells, and embryonic stem cell-derived hepatic cells in albumin-promoter-enhancer urokinase-type plasminogen activator mice. Am. J. Pathol. 175, 1483-1492 (2009).
  9. Sharma, A. D., et al. Murine embryonic stem cell-derived hepatic progenitor cells engraft in recipient livers with limited capacity of liver tissue formation. Cell. Transplant. 17, 313-323 (2008).
  10. Peltz, G. Can 'humanized' mice improve drug development in the 21st century. Trends Pharmacol. Sci. 34, 255-260 (2013).
  11. Zhu, S., et al. Mouse liver repopulation with hepatocytes generated from human fibroblasts. Nature. 508, 93-97 (2014).
  12. Saito, M., et al. Diphtheria toxin receptor-mediated conditional and targeted cell ablation in transgenic mice. Nat. Biotechnol. 19, 746-750 (2001).
  13. Ishii, T., et al. Transplantation of embryonic stem cell-derived endodermal cells into mice with induced lethal liver damage. Stem Cells. 25, 3252-3260 (2007).
  14. Machimoto, T., et al. Improvement of the survival rate by fetal liver cell transplantation in a mice lethal liver failure model. Transplantation. 84, 1233-1239 (2007).
  15. Taniguchi, H., Zheng, Y. -W. Human hepatic stem cell, method for preparation of the same, method for induction of differentiation of the same, and method for utilization of the same. Japan Patent. , 5822287 (2015).
  16. Zhang, R. -R., et al. Human hepatic stem cells transplanted into a fulminant hepatic failure Alb-TRECK/SCID mouse model exhibit liver reconstitution and drug metabolism capabilities. Stem Cell Res. Ther. 6, 1-12 (2015).
  17. Strom, S. C., Davila, J., Grompe, M. Chimeric Mice with Humanized Liver: Tools for the Study of Drug Metabolism, Excretion, and Toxicity. Hepatocytes. , Methods in Molecular Biology; 640. Springer. 491-509 (2010).
  18. Zhang, D., Luo, G., Ding, X., Lu, C. Preclinical experimental models of drug metabolism and disposition in drug discovery and development. Acta Pharm. Sin. B. 2, 549-561 (2012).
  19. Nowak, G., et al. Identification of expandable human hepatic progenitors which differentiate into mature hepatic cells in vivo. Gut. 54, 972-979 (2005).
  20. Naglich, J. G., Metherall, J. E., Russell, D. W., Eidels, L. Expression cloning of a diphtheria toxin receptor: identity with a heparin-binding EGF-like growth factor precursor. Cell. 69, 1051-1061 (1992).
  21. Mitamura, T., Higashiyama, S., Taniguchi, N., Klagsbrun, M., Mekada, E. Diphtheria toxin binds to the epidermal growth factor (EGF)-like domain of human heparin-binding EGF-like growth factor/diphtheria toxin receptor and inhibits specifically its mitogenic activity. J. Biol. Chem. 270, 1015-1019 (1995).
  22. Liu, Y., Yang, R., He, Z., Gao, W. -Q. Generation of functional organs from stem cells. Cell Regener. 2, 1(2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Alb TRECK SCID
Генерация гуманизированное печени мышей с помощью печени человека стволовые клетки
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.